CC BY
115
Оригінальні дослідження Original Researches <ü ГАСТРОЕНТЕРОЛОГІЯ GASTROENTEROLOGY
Патологія кишечника / Bowel Pathology
УДК616.345-002.44-018.73
ДОРОФЕЕВ А, Э„ ВАСИЛЕНКО И.В., РАССОХИНА О,А,
Донецкий национальный медицинский университет им, М, Горького
ИЗМЕНЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ MUC2, MUC3, MUC4, TFF3 В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА У БОЛЬНЫХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ ЯЗВЕННЫМ КОЛИТОМ
Резюме. Целью данной работы была оценка изменений экспрессии муцинов (М11С2, МиСЗ, МиС4) и трефоилового пептида (ТИНЗ) слизистого барьера кишечника у больных неспецифическим язвенным колитом (НЯК). Было обследовано 49 больных с левосторонним НЯК в стадии обострения. Всем больным НЯК было проведено эндоскопическое исследование с биопсией слизистой оболочки толстой кишки и морфологическим исследованием биоптата, определением экспрессии МиС2, МиСЗ, МиС4, ТРБЗ. Изменения слизистого барьера кишечника у больных НЯК отображают нарушение процессов слизеобразования, экспрессии муцинов и их свойств, а также тяжесть течения НЯК Ключевые слова: неспецифический язвенный колит, слизистый барьер толстого кишечника.
Введение
Протективная функция слизистого барьера толстого кишечника во многом определяется уровнем экспрессии эпителиальных муцинов и их свойствами. Целью данной работы была оценка влияния изменений экспрессии муцинов (М11С2, МИСЗ, М11С4) и трефоилового пептида (ТРРЗ) на состояние слизистого барьера толстого кишечника у больных неспецифическим язвенным колитом (НЯК). Было обследовано 49 больных НЯК, выполнено эндоскопическое исследование с биопсией слизистой оболочки толстой кишки (СОТК) и морфологическим исследованием биоптата. У всех больных НЯК выявлено снижение числа бокаловидных клеток, при этом степень их уменьшения коррелировала с тяжестью НЯК, снижение уровня экспрессии секреторного (МиС2) и мембраносвязанных (МИСЗ, МиС4) муцинов. Отмечалась высокая экспрессия ТРРЗ. Следовательно, для больных НЯК характерно снижение защитного слизистого барьера за счет уменьшения МиС2 и М11СЗ. Выявленные изменения коррелировали со степенью тяжести НЯК. Наблюдается нарушение взаимодействия муцинов и трефоилового фактора, что снижает протектив-ные свойства муцинов и регенераторный потенциал слизистой оболочки толстого кишечника у больных НЯК.
Актуальность
Защитная функция слизистого барьера толстого кишечника определяется балансом клеточного и гуморального иммунитета, оптимальным соотношением облигатной и факультативной флоры, количеством и свойствами толстокишечной слизи.
Уровень экспрессии и степень гликозилирования муцинов характеризуют состоятельность протек-тивной функции муцинов. Эпителиальные муцины — это большая группа секретируемых, а также трансмембранных гликопротеинов, богатых серином, треонином и пролином, связанных большим числом олигосахаридных цепей. На сегодняшний день идентифицировано более 20 муцинов, большинство генов локализуются на хромосоме 11 .pql5,5 [1, 2]. Муцины подразделяются на 2 класса соединений: секреторные (MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6) и трансмембранные муцины (MUC1, MUC4, MUC13, MUC16, MUC17) 11, 3]. Муцины активно экспрессируются эпителием желудочно-кишечного тракта и формируют высокомолекулярный вязко-эластический слой, являющийся протективным барьером между поверхностью слизистой оболочки и полостным содержимым желудочно-кишечного тракта, представляющий собой питательную среду для жизнедеятельности комменсальных бактерий кишечника [2, 3]. Изменения вязко-эластических свойств слизи формируются при взаимодействии муцинов с микроорганизмами, электролитами, белками и пищевыми компонентами. В условиях развития воспалительного процесса муцины претерпевают характерные преобразования: сульфатирование снижается, а сиалирование увеличивается, что отражает снижение резистентности муцина к бактериальному разрушению и способствует повышению проницаемости слизистого барьера кишечника [1,2,4].
1 Дорофеев Л.'1).. Василенко 11.1?.. Рассохина O.A., 2013 SP ^Гастроэнтерология», 2013
Согласно современным представлениям, в тонком кишечнике, слепой кишке и проксимальных и дистальных отделах толстого кишечника преимущественно экспрессируются МиС2, МІІС4, МІІСЗ и МиС 17, при этом в неизмененной слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта их локализация совпадает с распределением трефоиловых пептидов. Трефоиловые факторы (ТТП—3) наряду с муцинами играют важную роль в формировании гастроинтестинального барьера и выполняют протективную и регенераторную функции [4, 5]. ТББ синтезируются и секретируются муцинпродуцирующими клетками и тесно связаны с муцинами. Однако молекулярные механизмы взаимодействия муцинов и трефоиловых пептидов, а также многообразие их свойств еще недостаточно хорошо изучены [3, 4]. Считается, что в отличие от ТБП и ТЖГ2 только ТББЗ экспрессируется колоноцитами [4, 5]. Все три трефоиловых фактора обеспечивают процессы миграции клеток, участвуют в полимеризации муцинов, способствуя повышению защитной функции эпителия [5, 6]. Изменения слизистого барьера кишечника при неспецифическом язвенном колите могут характеризоваться изменением экспрессии муцинов и трефоиловых пептидов и приводить к снижению защитных свойств мукозного слоя слизистой оболочки кишечника, что стимулирует клетки иммунной системы, способствует поддержанию воспаления в толстом кишечнике при НЯК.
Целью данной работы была оценка влияния изменений экспрессии муцинов (МиС2, МІІСЗ, МиС4) и трефоилового пептида (ТБРЗ) на состояние слизистого барьера толстого кишечника у больных НЯК.
Материалы и методы
Было обследовано 49 больных левосторонним НЯК в стадии обострения, среди которых было 24 мужчины и 25 женщин. Средний возраст больных составлял (38,3 ± 9,2) года. Помимо общеклинических методов обследования всем больным НЯК было проведено эндоскопическое исследование с биопсией слизистой оболочки толстой кишки и морфологическим исследованием биоптата. Фиксация биоптата слизистой толстой кишки проводилась в 4% растворе нейтрального формалина на одни сутки с последующей заливкой в парафин. Гистохимическую идентификацию муцинов (МГІС2, МиСЗ, МГІС4) и 1ТРЗ проводили в биоптатах, фиксированных в 10% нейтральном забуференном формалине (pH 7,2—7,4) в течение 18—24 часов, заливали в парафин по общепринятой методике [1,6]. Для характеристики слизеобразования проводилась РА8-реакция, с помощью которой выявляли гликопротеиды, гликолипиды и гликоген. Другие срезы окрашивали альциановым синим при значениях pH 1,0 и 2,5. При pH 1,0 сульфатные группы углеводов приобретают достаточный заряд для связывания положительно заряженных молекул красителя. При
pH 2,5 окрашивали как сульфатные, так и карбоксильные группы углеводов, которые входят в состав сиаловых, глюкуроновой и индуроновой кислот. С помощью этой методики определяли сульфатиро-ванные и несульфатированные протеогликаны и гликопротеины [4, 6].
Иммуногистохимическое исследование муцинов (MUC2, MUC3, MUC4) и трефоилового пептида (TFF3) выполняли на парафиновых срезах. Демаскировку антигенов проводили в цитратном буфере (pH = 6,0) при кипячении на водяной бане в течение 1 часа. В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела (USBiological, США), а также систему визуализации КР-500 (Diagnostic Biosystems, США). При просмотре препаратов на светооптическом уровне антигенпозитивные клетки идентифицировали по их коричневому окрашиванию.
Все обследованные больные получали базисную терапию препаратами 5-аминосалициловой кислоты в течение 30 дней в сочетании с ферментными препаратами и пробиотиками. Эндоскопическое и морфологическое исследования проводились у больных НЯК до начала терапии и после ее окончания.
Результаты
Клиника НЯК была типичной и характеризовалась нарушениями стула, поносами от 4 до 10 раз в день с примесью крови и слизи, тенезмами, ночными дефекациями, вздутиями кишечника, болевым, астеноневротическим синдромами. Среди обследованных больных НЯК у 25 (62,5 %) пациентов было выявлено среднетяжелое течение, а у 15 (37,5 %) диагностировано легкое течение НЯК. При эндоскопическом исследовании у всех больных НЯК до терапии выявляли гиперемию СОТК с изменением сосудистого рисунка, отечность слизистой толстой кишки с «зернистостью» — грануляциями мембранной поверхности слизистой оболочки, рассеивающими отраженный свет. Эрозии или язвы, повышенная ранимость СОТК, примеси слизи, фибрина, гноя обнаружены практически у всех больных, и степень выраженности этих изменений коррелировала со степенью тяжести НЯК.
До терапии у всех больных НЯК выявлено снижение числа бокаловидных клеток, при этом степень их уменьшения коррелировала с тяжестью НЯК и варьировала от незначительного уменьшения количества бокаловидных клеток с преобладанием клеток с мелкими, незрелыми вакуолями у больных НЯК легкой степени до выраженного снижения и иногда полного отсутствия бокаловидных клеток у пациентов со среднетяжелым течением НЯК. Выявлены истончение, дистрофия поверхностного эпителия с перестройкой крипт, кроме того, у всех больных обнаруживались дефекты поверхностного эпителия — от микроэрозий до глубоких язв, заполненных некротическими массами. На этом фоне у всех больных НЯК выявлена усиленная
воспалительная клеточная инфильтрация слизистой оболочки толстой кишки, интенсивность которой колебалась от умеренной до выраженной.
В воспалительном клеточном инфильтрате у больных НЯК чаще преобладали лимфоциты — 24 (80 %) больных, плазмоциты преобладали у 18 (60 %) пациентов, а макрофаги — у 14 (46,7 %') больных. Нейтрофилы обнаруживались в инфильтрате у 18 (60 %) больных НЯК, при этом активные сегментоядерные лейкоциты, содержащие гликоген, обнаружены у 13 (43,3 %) пациентов. Более чем у половины больных НЯК выявлялись внутриэпите-лиальные лимфоциты, что свидетельствует об активности воспалительного процесса.
Помимо изменений клеточного состава слизистой оболочки толстой кишки у больных НЯК выявлены нарушения слизеобразования. У всех больных выявлено уменьшение количества внутриклеточной и внеклеточной слизи с изменением ее свойств. При проведении РА8-реакции, окрашивании альциановым синим pH 2,5 и pH 1,0 интенсивность окрашивания у всех больных НЯК была ниже нормы (Р < 0,01), что свидетельствует об изменениях состава толстокишечной слизи, уменьшении в ней гликозамингликанов и гликопротеинов.
Уровень экспрессии секреторного (МиС2) и мембраносвязанных (МИСЗ, М11С4) муцинов у всех пациентов с НЯК был низким, при этом наиболее выраженным было снижение М11С2 и МИСЗ, проявляющееся негомогенностью окрашивания вакуолей бокаловидных клеток вплоть до его полного отсутствия, что свидетельствует о значительном снижении секреторной активности СОТК, снижении ее протективной функции при НЯК. При этом отмечалось интенсивное окрашивание муцинов в цитоплазме вокруг вакуолей и умеренное — в базальных отделах клеток эпителия, что может отражать высокую интенсивность метаболических процессов в эпителиальных клетках кишечника. В то же время низкая экспрессия МИС2 и М11СЗ в поверхностном эпителии, выявленная у большинства обследованных пациентов с НЯК, может характеризовать неэффективность репаративных процессов слизистой оболочки при обострении заболевания (рис. 1а).
У 29 (59,2 %) обследованных больных НЯК отмечалось окрашивание клеток стромы от слабой до высокой экспрессии как MUC2, так и MUC3, что свидетельствует об активности митоза и процессов дифференцировки эпителиальных клеток стромы в бокаловидные экзокриноциты. Эти изменения могут индуцироваться высокой интенсивностью воспалительного процесса в толстом кишечнике и носить компенсаторный характер (рис. 16). Экспрессия секреторных муцинов индуцируется провоспалительными цитокинами: TNF-a, INF-y, IL-6. Поэтому ее отсутствие в вакуолях бокаловидных клеток и появление в строме свидетельствует также о локализации воспалительного процесса в собственной пластинке СОТК, характерной для НЯК. В то же время хроническое воспаление, вызванное бактериальными инфекциями (энте-ропатогенная и гемолизирующая E.coli, Salmonella enteritidis, Clostridium difficile и др.), ассоциируется с повышенной экспрессией секреторных муцинов в поверхностных отделах, ограничивая проникновение микроорганизмов в глубь слизистой оболочки кишечника, что может являться дополнительным дифференциально-диагностическим критерием.
Уровень MUC4 был низким у большинства больных НЯК, однако снижался в меньшей степени по сравнению с MUC2 и MUC3 (рис. 1в). В то же время у трети обследованных больных экспрессия MUC4 была высокой.
Избыточная акт и нация трансмембранных муцинов приводит к стимуляции ядерного фактора транскрипции (NF-kB) и канонического ингибитора ядерного фактора кВ киназы ß (IKK-ß), ассоциирующихся с неоплазией, индуцированной хроническим воспалением, что может объяснять высокую частоту малигнизации при длительном течении НЯК. *
Экспрессия TFF3 в слизистой оболочке толстого кишечника у больных НЯК в целом по группе была высокой в отличие от секреторных муцинов, что свидетельствует о нарушении регуляторного влияния трефоиловых пептидов на экспрессию и про-тективные свойства муцинов.
При этом локализация TFF3 также характеризовалась неравномерностью: в большей степени
а) отсутствие МиС2 в вакуолях бокаловидных клеток, интенсивное окрашивание цитоплазмы;
б) отсутствие МиСЗ в вакуолях бокаловидных клеток, окрашивание клеток стромы;
в) М11С4 в бокаловидных клетках, высокая экспрессия в цитоплазме;
г) экспрессия TFF3 в бокаловидных клетках.
Рисунок 1 — Экспрессия MUC2, MUC3, MUC4 и TFF3 в СОТК:
экспрессия наблюдалась в базальных отделах клеток крипт, умеренная — в вакуолях бокаловидных клеток (рис. 1г). В некоторых случаях отмечалась выраженная поверхностная локализация 'ГРЯЗ в сочетании с отсутствием или низкой экспрессией МиС2 и МиСЗ, что, вероятно, отражает истощение секреторной функции бокаловидных клеток при сохранении стимулирующего влияния ТРЖЗ на муци-нообразование в ответ на воспаление.
Следовательно, для больных НЯК характерно снижение защитного слизистого барьера как за счет уменьшения разреженного (М11С2 и МиСЗ), так и за счет плотного слоя муцинов, сформированного в большей степени мембрановстроенными муцинами (МиСЗ и МиС4). Наблюдается нарушение взаимодействия муцинов и трефоилового фактора, что снижает протективные свойства муцинов и регенераторный потенциал слизистой оболочки толстого кишечника у больных НЯК. Это приводит к уменьшению толщины и вязкости мукозного слоя СОТК, снижению колонизационной резистентности вследствие отсутствия питательного субстрата для жизнедеятельности облигатной флоры. Уменьшение толщины слизистого слоя способствует снижению как гуморального (1§А), так и клеточного компонентов защитного барьера, локализованных в мукозном геле, повышению проницаемости кишечного барьера для различных токсинов, микроорганизмов, бактериальных полисахаридов, индуцирующих и поддерживающих иммунный воспалительный ответ в кишечнике.
Степень выраженности выявленных изменений экспрессии муцинов варьировала в зависимости от степени тяжести НЯК. Так, у пациентов со слабой активностью НЯК отмечались значительные нарушения экспрессии МиС2, который не определялся у 90 % больных. МиСЗ был выявлен только у 20 % пациентов. В то же время умеренная экспрессия МиС4 отмечалась более чем у половины больных — 62 %, а высокая — у 38,5 % пациентов, что, вероятно, свидетельствует о компенсаторном увеличении синтеза мембраноассоциированного муцина (МиС4) на фоне снижения общей секреторной активности. Отмечалась высокая экспрессия ТББЗ у 70 % больных с легкой степенью тяжести НЯК, в то же время у 15 % обследованных ТББЗ не определялся.
Достоверных отличий экспрессии МиС2 и МиСЗ между группами больных с легкой и средней степенью тяжести НЯК выявлено не было. У пациентов с умеренной степенью тяжести НЯК экспрессия секреторного МиС2 выявлялась только у 30 %, а мембраносвязанного М11СЗ — у 35 % больных, при этом выраженность экспрессии муцинов была минимальной. В то же время более выраженные нарушения экспрессии МИС4 были выявлены у больных со средней степенью тяжести НЯК: отсутствие МиС4 наблюдалось у 28 % больных, низкая экспрессия — у 38 % и умеренная — у 34 % больных
НЯК. В этой группе также преобладали пациенты с выраженной экспрессией TFF3.
У 100 % больных НЯК тяжелой степени отмечалось абсолютное отсутствие экспрессии MUC2 и MUC3 в бокаловидных клетках, экспрессия MUC4 отмечалась у 70 % больных, однако была низкой, что свидетельствует о наиболее выраженных изменениях синтеза и секреции муцинов у этой группы пациентов. Стимулирующее влияние провоспалительных цитокинов на экспрессию и секрецию муцинов, вероятно, нивелировалось длительным течением заболевания и истощением компенсаторных механизмов защиты слизистого слоя кишечника у обследованных больных НЯК. Уровень TFF3 был низким у 30 % обследованных, высокая экспрессия сохранялась у 70 % больных НЯК с высокой активностью воспалительного процесса в толстом кишечнике.
Таким образом, наиболее выраженные нарушения экспрессии муцинов наблюдались у больных НЯК тяжелой степени с выраженной активностью воспалительного процесса в толстом кишечнике. Значительное снижение секреторных и трансмембранных муцинов отмечалось при средней степени тяжести НЯК. Повышение экспрессии муцинов наблюдается в фазе ремиссии НЯК, что отражалось на уровне MUC4 в группе больных с минимальной активностью заболевания (легкая степень тяжести НЯК). Степень выраженности нарушений экспрессии муцинов коррелировала с активностью воспалительного процесса в толстом кишечнике у больных НЯК, отражала эффективность компенсаторных процессов в зависимости от стадии заболевания.
Список литературы
1. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases/M.A. McGuckin, R. Eri, LA. Simms etal.//Inflamm. Bowel Dis. - 2009. - №15. - P. 100-113.
2. Role of intestinal mucins in innate host defense mechanisms against pathogens / P. Dharmni, V. Srivatava. V. Kissoon-Singh etal.//J. Innate Immun. — 2009. — № 1. — P. 123-135.
3. Perez-Vilar J' Mucin granule intraluminal organization / /. Perez-Vilar//Am. I. Respir. Cell Mol. Biol. — 2008. — № 36(2). - P. 183-190.
4. Kim Y.S. Intestinal goblet cells and mucins in health and disease: recent insights and progress / Y.S. Kim, S.B. Ho // Cun. Gastroenterol. Rep. — 2010. — № 12. — P. 319-330.
5. Linden S.K Mucin dynamics in intestinal bacterial infection / S.K Linden, T.H.J. Florin, M.A. McGuckin // PLoS ONE. - 2008. - V 3(12). - P. 3952-3966.
6. MUC1, MUC2, MUC4, and MUC5AC expression in salivaiy gland mucoepidermoid carcinoma: diagnostic and prognostic implications / A. Handra-Luca, G. Lamas, J. C. Bertrand et at //Am. J. Stag. Pathol. — 2005. —№29,— P. 881-889.
Получено 07.02.13 D
Дорофєєв А.Е., Василєнко І.В., Рассохіна О.О.
Донецький національний медичний університет ім, М, Горького
ЗМІНИ ЕКСПРЕСІЇ МиС2, МІЮЗ, МиС4, ШЗ
У СЛИЗОВІЙ ОБОЛОНЦІ ТОВСТОГО КИШЕЧНИКА У ХВОРИХ НА НЕСПЕЦИФІЧНИЙ ВИРАЗКОВИЙ КОЛІТ
Резюме. Метою цієї роботи була оцінка змін експресії муцинів (МиС2, МиЄЗ, МІІС4) і трефоїлового пептиду (ТЩЗ) слизового бар’єру кишечника у хворих на неспецифічний виразковий коліт (НВК). Було обстежено 49 хворих із лівобічним НВК у стадії загострення. Усім хворим на НВК було проведено ендоскопічне дослідження з біопсією слизової оболонки товстої кишки та морфологічним дослідженням біоптату, визначенням експресії МІІС2, МиСЗ, МІ С4. ТІ І З. Зміни слизового бар’єру кишечника у хворих на НВК відображають порушення процесів слизо-утворення, експресії муцинів та їх властивостей і тяжкість перебігу НВК.
Ключові слова: неспецифічний виразковий коліт, слизовий бар’єр товстого кишечника.
DorofeyevA.E.. Vasilenko I.V., Rassokhina O.A.
Donetsk National Medical University named after M. Gorky, Donetsk, Ukraine
CHANGES IN EXPRESSION OF MUC2, MUC3, MUC4, TFF3 OF COLONIC MUCOSA IN PATIENTS WITH ULCERATIVE COLITIS
Summary, The aim of this study was to evaluate the changes in expression of mucins (MUC2, MUC 3, MUC 4) and trefoil peptide (THF3) of colonic mucus barrier in patients with ulcerative colitis (UC), 49 patients with left-side UC in the acute stage were examined. All patients underwent endoscopic examination of colonic mucosa with biopsy and morphological study of biopsy sample, determination of expression of MUC2, MUC3, MUC4, TFF3. Changes in colonic mucus barrier of patients with ÜC indicate disorder in mucus production, expression of mucins and their properties, as well as severity ofUC.
Key words: ulcerative colitis, colonic mucus barrier.
