CC BY
22
ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ ЦИСТЕИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ СТЕНКИ СОСУДОВ В ДИНАМИКЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ТРОМБОЗА У КРЫС
Фомина Н.В., Фомина М.А., Калинин Р.Е., УДК: 616.131.14-005.6-092.9
Герасимов А.А., Новиков А.Н.
ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань
Резюме
Обнаружено повышение активности лизосомальных цистеиновых протеиназ катепсинов В, L и Н в стенке вены крыс при моделировании экспериментального тромбоза путём лигирования общей подвздошной вены. Активность катепсинов изучалась в стенке сосуда в динамике: на первые, третьи и пятые сутки. В тромбиро-ванных венах активность катепсинов статистически значимо повышалась на первые, третьи и пятые сутки по сравнению с контрольными значениями. В интактных венах активность катепсинов демонстрировала статистически значимый подъём к третьим суткам после проведённой операции.
Активность изучаемых катепсинов в тромбированных венах статистически значимо отличалась от активности в интактных венах на первые и пятые сутки.
Ключевые слова: лизосомальные цистеиновые протеиназы, экспериментальный венозный тромбоз, сосудистая стенка.
THE CHANGE OF LYSOSOMAL CYSTEIN PROTEINASES ACTIVITY AT THE WALLS OF BLOOD VESSELS IN THE DYNAMICS OF THE EXPERIMENTAL THROMBOSIS IN RATS
Fomina N.V., Fomina M.A., Kalinin R.E., Herasimov A.A., Novikov A.N.
The increased of activity of lysosomal cystein proteinases cathepsins L, B and H in the vein wall of rats under tromboze made in the experiment was found. Thrombosis simulated by ligation iliac vein, extracted operated and intact vessels and determined the activity of the cathepsins in the wall of the vessel in the dynamics: in the first, third and fifth day. In operated veins activity cathepsins statistically increased significantly in the first, third and fifth day compared with reference values. In intact veins activity cathepsins demonstrated a statistically significant rise on the third day after the operation.
The activity of the studied cathepsins in operated veins statistically significantly differ from the activity in intact veins on the first and fifth day.
Keywords: lysosomal сystein proteinases, experimental venous thrombosis, vascular wall.
В современной флебологической практике проблема венозных тромбозов занимает одну из лидирующих позиций в силу ряда причин. По данным некоторых авторов частота тромбозов глубоких вен (ТГВ) нижних конечностей ежегодно составляет около 160 на 100 000 человек, около 30% из них погибает в течение ближайшего месяца. Ещё у 20% в течение последующих двух лет развивается рецидив заболевания [3].
Опасными осложнениями ТГВ, нередко приводящими к инвалидности и летальному исходу, являются тромбоэмболия лёгочной артерии и посттромботическая болезнь.
В развитии венозных ТГВ нижних конечностей большую роль играет состояние сосудистого эндотелия, который при воздействии различных факторов способен менять свой антитромботический потенциал на тром-богенный [6]. Эти изменения могут происходить при гипоксии, повреждении стенок сосудов физическими и химическими агентами, под влиянием экзо- и эндотоксинов, антиэндотелиальных и антифосфолипидных антител, клеточных и плазменных протеаз [2]. В свою очередь, это приводит к изменениям в структуре сосудистой стенки, связанных с развитием воспалительного процесса, в результате чего вены теряют свои функциональные свойства [1].
Повреждение сосудистой стенки воспалительного, атеросклеротического или другого происхождения, повышение свёртываемости крови и замедление кровотока являются основными механизмами тромбообразования, составляя триаду Вирхова [13].
Стаз - важнейший механизм, предрасполагающий к тромбообразованию. Ранее было показано, что лигирова-ние вены приводит к образованию тромба [4, 6].
По данным ряда авторов основными механизмами тромбообразования в условиях используемой модели являются повреждение сосудистой стенки, увеличение экспрессии тканевого тромбопластина и прекращение тока крови. Кроме того, лигирование вены приводит к гипоксемии, которая играет важную роль в экспрессии молекул адгезии эндотелия сосудов и способствует адгезии лейкоцитов [14].
Известно, что при остром венозном тромбозе изменениям подвергаются все компоненты сосудистой стенки. Характер и выраженность этих изменений определяются сроками после возникновения гемодинамических нарушении. Деструктивные изменения эндотелия в острую стадию сочетаются с дистрофическими изменениями гладких миоцитов средней оболочки, а также коллагено-вых и эластических волокон [6].
Ранний период тромботического процесса характеризуется деструкцией эндотелия (при его незначительном набухании) и внутренней эластической мембраны. На третьи - пятые сутки отмечается активная десквамация эндотелия, в средней оболочке наблюдается умеренная диффузная лейкоцитарная инфильтрация и выход лейкоцитов в окружающую сосуд соединительную ткань [5].
В последнее время всё большее внимание уделяется лизосомальным цистеиновым протеиназам (ЛЦП) - ферментам, участвующим во многих регулятор-ных и патологических процессах организма. Катепсины
В, L и Н способны к внеклеточной секреции, где они принимают активное участие в деградации внеклеточного ма-трикса и, таким образом, в развитии различных сердечно
- сосудистых заболеваний [12]. Имеются данные о роли катепсинов в адгезии и миграции моноцитов [11], запуске процессов неоангиогенеза [ 10]. Участие катепсинов В и L в деградации внеклеточных белков - ламинина, фибронек-тина, коллагена IV типа подтверждает их немаловажную роль в развитии патологии сосудистой стенки, и в частности артерий [8] и позволяет предположить участие катепсинов В, L и Н в развитии венозной патологии.
Цель настоящей работы - изучение изменения активности лизосомальных цистеиновых протеиназ
- катепсинов L, Н и В в стенке тромбированных и ин-тактных сосудов крыс в динамике экспериментального тромбоза.
Материалы и методы
В эксперименте использованы 3-4-х месячные кон-векциональные половозрелые крысы-самки линии Wistаr массой 200-400 г в количестве 40 особей, полученные из вивария ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России.
Содержание и выведение животных из эксперимента осуществлялось в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» от 06.04.1993 и «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г.).
Животные содержались по 3-4 особи одного пола в металлических клетках площадью 24 дм2 при естественном освещении, получали воду и полнорационный сухой комбикорм для лабораторных животных «Чара» (производство ЗАО «Ассортимент-Агро», Московская область, Сергиев-Посадский район, д. Тураково).
Воспроизведение тромбоза у экспериментальных животных осуществляли путём лигирования общей подвздошной вены одной конечности [6] в специально оборудованной операционной вивария ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России. Перед хирургическим вмешательством животных наркотизировали. Предварительно за 15 минут до подачи наркоза проводили премедикацию введением «Рометара» внутримышечно, наркоз осуществлялся введением препарата «Золетил» внутримышечно. В ходе операции определялась пульсация подвздошной артерии и в месте её проекции производили разрез кожи и подкожной клетчатки длиной 4-5 см. Тупо расслаивая мышцы, выделяли сосудисто-нервный пучок, определяли в нём общую подвздошную вену и перевязывали её.
Выведение из эксперимента осуществлялось на первые, третьи, пятые сутки после операции. За 12 часов до выведения животных лишали корма, а само выведение из опыта производилось в утренние часы (8-9 часов). Материалом для исследования у каждого животного служили участок вены ниже места лигирования (тромбированная
вена) и симметричный участок вены другой конечности (интактная вена). В качестве контроля использовались участки общей подвздошной вены интактных животных, сопоставимых по возрасту, массе и условиям содержания с экспериментальными особями.
Немедленно после выведения животного из эксперимента извлеченные сосуды очищали от жировой ткани и взвешивали на торсионных весах, далее измельченную ткань сосуда помещали в холодный 0,25 М раствор сахарозы в соотношении 1/100 и гомогенизировали в течение 40 с при 900 об/мин. в гомогенизаторе «Potter S» производства фирмы «Sartorius Stedium Biotech, GmbH» (Германия). Описанные процедуры проводили при температуре не выше 40° С.
Полученный гомогенат центрифугировали 10 мин. при 1000 g для осаждения не полностью разрушенных клеток и ядер. Супернатант обрабатывали раствором Тритона Х-100 в конечной концентрации 0,1% для разрушения субклеточных мембран и использовали в качестве материала для дальнейшего исследования.
Общая активность катепсинов В, L и Н измерялась спектрофлуориметрическим методом по Barrett & Kirschke [7] путем количественного определения 7-амидо-4-метилкумарина, высвобождающегося в результате энзиматического гидролиза пептидной связи из №-карбобензокси-аргинин-аргинин-7-амидо-4-ме-тилкумарин (А^-А^-7-амидо-4-метилкумарин, «Sigma», USA), ^карбобензокси^-фенилаланил-аргинин-7-ами-до-4-метилкумарина (N-СBZ-Phe-Aгg-7-амидо-4-метил-кумарин, «Sigma», USA) или L-аргинин-7-амидо-4-метил-кумарина (А^-7-амидо-4-метилкумарин, «Sigma», USA), соответственно.
Продукт реакции определяли на спектрофлюориме-тре «System 3 Scanning Spectrofluorometr» производства «Optical technology devices, inc. Elmstord, New York, 10523» при X = 360 нм (возбуждение) и X = 440 нм (эмиссия).
Активность фермента рассчитывали и выражали в нмоль 7-амидо-4 -метилкумарина/чхг белка, концентрацию белка в материале определяли по методу Лоури с использованием коммерческих наборов НПО «Эко-сервис», г. Санкт- Петербург.
Статистическая значимость выявленных изменений оценивали с использованием U-критерия Манна-Уитни, значимыми считались отличия при значениях р < 0,05.
Результаты и обсуждение. Изучение активности ЛЦП - катепсинов L, Н и В в стенке тромбированных и интактных вен крыс в динамике экспериментально моделированного тромбоза позволило нам выявить следующие тенденции (рис. 1-3).
Активность катепсинов В, L и Н в стенке тромбиро-ванной вены демонстрировала статистически значимое повышение как по сравнению с уровнем контрольных значений, так и относительно значений, полученных для интактной вены, уже на первые сутки после оперативного вмешательства. Это наблюдение согласуется с данными [6] о развитии отчётливых морфологических
2500 2000 1500 1000 500
1 сутки
3 сутки
5 сутки
уровень контрольных значений -о— интактные вены —с— тромбированные вены
700 600 500 400 300 200 100 0
1 сутки
3 сутки
5 сутки
уровень контрольных значений -о— интактные вены ■— тромбированные вены
Рис. 1. Изменение активности катепсина L в стенке тромбированных и интактных вен крыс в динамике экспериментального тромбоза на 1-е, 3-и и 5-е сутки, нмоль/чхг белка. Примечание: * - статистически значимые отличия от контроля, ** - статистически значимые отличия от интактных вен (р < 0,05).
Рис. 2. Изменение активности катепсина Н в стенке тромбированных и интактных вен крыс в динамике экспериментального тромбоза на 1-е, 3-и и 5-е сутки, нмоль/чхг белка. Примечание: * - статистически значимые отличия от контроля, ** - статистически значимые отличия от интактных вен (р < 0,05).
изменений стенки сосуда, в основном на уровне эндо-телиоцитов через 24 часа после моделирования острого тромбоза. Вероятной причиной выявленных изменений может оказаться локальная активация лизосомального протеолиза на участке поражения как одного из агентов развивающегося в этот период повреждения эндотелия и компонентов внеклеточного матрикса. Предположение о местном характере изменений косвенно подтверждается отсутствием статистически значимых отличий активности изучаемых ферментов в стенке интактной вены от уровней контрольных значений на первые сутки после операции.
Дальнейшая динамика изменений демонстрировала прогрессивное нарастание активности катепсинов В, L и Н в стенках тромбированных вен на третьи и пятые сутки после оперативного вмешательства. Обнаруженные отличия для всех описываемых ферментов статистически значимы относительно уровня контрольных значений. Продолжающееся нарастание активности ферментов может быть связано с диффузной лейкоцитарной инфильтрацией средней оболочки вены, формирование которой является одним из важнейших звеньев в патогенезе острого венозного тромбоза [5, 6].
Одновременно, активность всех трёх катепсинов в интактной вене также статистически значимо повышалась на третьи сутки экспериментального тромбоза по сравнению с контролем, возвращаясь на пятые сутки к величинам, близким к уровню контрольных значений. Ранее проведёнными исследованиями [9] было установлено, что как в эксперименте, так и в клинических условиях после оперативного вмешательства, в венах, значительно
1000 900. 800 _ 700 _ 600 _ 500 _ 400 _ 300 _ 200 _ 100 _
1 сутки 3 сутки 5 сутки
уровень контрольных значений —о— интактные вены —о— тромбированные вены
Рис. 3. Изменение активности катепсина В в стенке тромбированных и интактных вен крыс в динамике экспериментального тромбоза на 1-е, 3-и и 5-е сутки, нмоль/чхг белка. Примечание: * - статистически значимые отличия от контроля, ** - статистически значимые отличия от интактных вен (р < 0,05).
или мало отстоящих от места операции, происходит адгезия лейкоцитов и их инвазия в стенку вены на всём её протяжении. При микроскопическом исследовании было отмечено образование множества мельчайших отверстий и дефектов в эндотелии и базальной мембране, обнажающих субэндотелиальный слой коллагена. По мнению
автором данного исследования механизмом этого феномена является значительная дилатация вены, которая, вероятно, превышала допустимый предел её растяжения. Соответственно, в качестве причин обнаруженного преходящего повышения активности изучаемых нами катепсинов в интактных венах могут выступать лейкоцитарная инфильтрация и временное повышение объёма крови с дилатацией сосуда, которое впоследствии компенсируется улучшением кровотока в повреждённой конечности.
Выводы
1. Моделирование экспериментального тромбоза приводит к статистически значимому повышению активности лизосомальных цистеиновых катепсинов В, L и Н в стенке пораженного сосуда начиная с 1-х суток после операции.
2. Динамика развития экспериментального тромбоза характеризуется прогрессивным нарастанием активности изучаемых ферментов в стенке тромбирован-ной вены.
3. Активность лизосомальных цистеиновых протеиназ в стенке интактной вены демонстрирует статистически значимый подъём к 3-м суткам, возвращаясь к уровням контрольных значений на 5-е сутки после вмешательства.
4. Наиболее вероятными причинами обнаруженных изменений могут оказаться лейкоцитарная инфильтрация стенки сосудов и участие лизосомальных цистеиновых протеиназ в повреждении эндотелия и компонентом внеклеточного матрикса.
11. Sukhova G.K., Zhang Y., Pan J.H. et al. Deficiency of cathepsin S reduces atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice. J Clin Invest 2003;111:897-906.
12. Suzanne P. M. Lütgens. Cathepsin cysteine proteases in cardiovascular disease / P. M. Suzanne Lütgens [et al.] // The FASEB Journal. - Vol. 21, October 2007, P. 3029-3041.
13. Virchow R.L.K. Gessamelte Abhandlungen zur wissenschaftlichen Medicin. - Frankfurt am Main: Von Meidinger & Sohn, 1856. - P. 219-732 (English translation by A.C. Matzdorff and W.R. Bell. Thrombosis and Emboli. - Canton, Massachusetts, Science History Publications, 1998).
14. Zhou J., May L., Liao P., et al. Inferior vena cava ligation rapidly induces tissue factor expression and venous thrombosis in rats // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2009. - № 29. - P. 863-869.
Литература
1. Баешко А.А. Морфологические изменения в стенке вены при экспериментальном флеботромбозе и тромбофлебите / А.А. Баешко и др. // Морфология.
- 1998. - № 5. - С. 59-64.
2. Баркаган З.С. Основы диагностики гемостаза / З.С. Баркаган, А.П. Момот.
- Москва, 1999. - 246 с.
3. Диагностика и лечение тромбоза глубоких вен нижних конечностей: учебно-методические рекомендации под ред. Ю.Л. Шевченко. - Москва, 2006. - ФГУ «НМЦХ им. Н. И. Пирогова Росздрава». - 24с.
4. Иванов И.С. и др. Антитромбогенная активность липовертина на модели венозного тромбоза у крыс / И. С. Шевченко и др. // www.MEDLINE.ru, Т. - 11, ФАРМАКОЛОГИЯ, ДЕКАБРЬ 2010, С. - 590-595.
5. Маркауцан П.В. Структурная организация стенки вены при замедлении кровотока и тромбозе в эксперименте: автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук. - Минск. - 2004.
6. Небылицин Ю.С. и др. Структурные изменения сосудистой стенки при экспериментальном моделировании венозного тромбоза /Ю.С. Небылицин, С. А. Сушков, И.В. Самсонова, О.Д. Мяделец, Л.И. Арчакова // Медицинский журнал.
- 2007. - № 4. - С. 82-86.
7. Barrett A.J., Kirschke H. Cathepsin B, cathepsin H, cathepsin L // In Enzymol.
- 1981. - Vol. 80. - P.535-561.
8. Cheng X.W., Kuzuya M., Sasaki T., Arakawa K., Kanda S., Sumi D., Koike T., Maeda K., Tamaya-Mori N., Shi G. P., et al. (2004). Increased expression of elastolytic cysteine proteases, cathepsins S and K, in the neointima of balloon-injured rat carotid arteries. Am. J. Pathol. 164, 243-251.
9. Comerota A.J., Stewart G.J. Operative venous dilation and its relation to postoperative deep venous thrombosis //Prevention of venous thromboembolism //Ed.S.Z.Goldhaber.-New York: M.Dekker. - 1993.
10. Premzl A., Turk V., and Kos J. Intracellular proteolytic activity of cathepsin B is associated with capillary-like tube formation by endothelial cells in vitro. J Cell Bioc-hem 2006; 97:1230-1240.
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Фомина Н.В.
e-mail: [email protected]
