CC BY
37
УДК 616-098:591:11
ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ, АЛАНИ-
НАМИНТРАНСФЕРАЗЫ И АСПАРТАТЕМИНОТРАНСФЕРАЗЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ МЫШЕЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ДЕЛЬТАЭНДОТОКСИНА BACILLUS THURINGIENSIS
М.С. ФЕКЛИНА, Д.В. КАМЕНЕК, Э.К. ЮНУСОВА, Л.К КАМЕНЕК*
Ключевые слова: активность лактатдегидрогеназы, аланинамин-трансферазы
В настоящее время широко распространены препараты, содержащие спорово-кристаллические комплексы Bacillus thur-ingiensis, занимающие до 90-95% мирового рынка биоинсектицидов [1]. С развитием генной инженерии стали создаваться трансгенные растения, модифицированные геном токсинообразования. Такие растения уже производятся генно-инженерными фирмами в промышленных масштабах. Разработаны новые препараты на основе очищенного от спор и других балластных веществ и предварительно активированного эндотоксина [9, 10]. Уникальная избирательность взаимодействия дельта-эндотоксина с мембранами клеток насекомых дает возможность использовать его для защиты сельскохозяйственных растений и леса от листогрызущих насекомых-вредителей. Существуют данные о безвредности дельта-эндотоксина для млекопитающих, основанные на изучении его прямой токсичности. Попадая в организм животного, дельта-эндотоксин может всасываться в кишечнике и, в первую очередь, имеет возможность взаимодействия с элементами крови. При длительном воздействии токсических веществ в концентрациях, не вызывающих внешне обнаруживаемого эффекта, могут выявляться скрытые изменения ряда биохимических показателей системы крови, которая является чувствительным индикатором, отражающим состояние организма в целом. Метаболизм клетки включает множество разветвленных ферментативных реакций, которые формируют отдельные циклы: гликолиз, цикл трикарбоновых кислот и т.д. При интоксикации накапливается большое количество промежуточных и конечных продуктов обмена, которые оказывают деструктивное действие на важнейшие системы организма [2].
Сопряженные химические реакции, протекающие в живом организме, и активность ферментов, катализирующих их, характерны почти исключительно для внутриклеточной среды. Лак-татдегидрогеназа (ЛДГ), аланинаминотрасфераза (АлАТ) и ас-партатаминотрансфераза (АсАТ) сыворотки крови являются ферментами, которые способны выходить в межклеточное пространство в результате нарушений целостности клеточных мембран [4]. В этом случае на основании результатов анализов внеклеточных жидкостей (особенно плазмы или сыворотки крови) можно сделать заключение о характере изменений, происходящих внутри клеток разных органов и тканей. Поэтому исследования выше перечисленных ферментов являются важным лабораторным тестом, позволяющим выявить нарушение в работе органов на ранних стадиях токсикации [3].
Цель работы - изучение влияния различных концентраций дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki, который наиболее широко используется в защите растений, на активность ЛДГ, АсАТ, АлАТ.
Материалы и методы. В исследованиях использовали полугодовалых белых беспородных мышей - самок со средним весом 30±2 граммов. Животным в течении 4 недель дважды в неделю перорально вводили препарат в дозах- 100, 50 или 25 мг на кг массы животного, что составило 0,003, 0,0015 или 0,00075 мг на особь, соответственно. В эксперименте использовавали 360 животных, разделенных на 4 группы, три опытные и одна контрольная. Контрольным животным токсин не вводили. Материалом для исследования служила сыворотка крови. Забор крови для оценки активности проводили еженедельно путем декапитации животных, для усыпления животных использовали эфир.
Сыворотку крови получали методом отстаивания цельной крови и ретракции кровяного сгустка с последующим центрифугированием. Центрифугирование сыворотки проводили при скорости 3000 об/мин в течение 10 мин [7]. Определение активности ферментов проводили в присутствии восстановленной формы кофермента НАДН. В качестве субстрата для определения ЛДГ использовали пируват, АсАТ - L-аспарагиновую кислоту,
* ГОУ ВПО Ульяновский госуниверситет, г. Ульяновск, ул. Льва Толстого 42., тел. 8(8422) 320016
АлАТ - Ь-аланин. Инкубационная смесь для определения ЛДГ содержала 2,7 мл 100мМ трис буфера (рН 7,4); 0,1 мл сыворотки; 0,1 мл 23 мМ пирувата натрия; 0,1 мл 5 мМ НАДН. Инкубационная смесь для определения АсАТ содержала 1 мл 80 мМ фосфатного буфера (рН 7,4); 0,1 мл сыворотки; 2 мл 200мМ Ь-аспарагиновой кислоты, 0,02 мл а-кетоглутаровой кислоты;
0,05 мл 18мМ НАДН. Инкубационная смесь для определения АлАТ содержала 1 мл 80мМ фосфатного буфера (рН 7,4); 0,1 мл сыворотки; 2 мл 500 мМ Ь-аланина, 0,02 мл а-кетоглутаровой кислоты; 0,05 мл 18мМ НАДН. Для определения активности ферментов инкубационную смесь помещали в кварцевые кюветы толщиной в 1 см и оценивали скорость окисления НАДН, спектрофотометрически по убыли величины оптической плотности при длине волны 340 нм [8]. Активность ферментов измеряли в нмоль/(с-л), но для удобства активность выражали в %, принимая контроль за 100%, чтобы исключить изменения, связанные с внешними воздействиями на организм животного.
Экспериментальные данные обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики. Достоверность полученных результатов оценивали с помощью 1-критерия Стьюдента.
Таблица 1
Влияние дельта-эндотоксина на активность лактатдегидрогеназы в крови лабораторных мышей
Сутки Изменение активности ЛДГ,% в зависимости от дозы токсина, мг/кг
Контроль (без токсина) 25 50 100
1 100 103±9 103±15 100±13
7 100 103±11 100±0,11 99±9
14 100 79±8 94±7 91±12
21 100 96±10 93±12 92±21
Примечание: p < 0,001 при n = 10, где n - число повторностей
Результаты. Анализ данных указывает на отсутствие существенных изменений активности ЛДГ в сыворотки крови животных во всех исследуемых дозах на протяжении всего эксперимента. Однако прослеживается устойчивая тенденция к снижению активности данного фермента к окончанию эксперимента с увеличением дозы дельта-эндотоксина. На наш взгляд, подобно снижение может быть связано с усилением аэробности условий, которое вызвано действием дельта-эндотоксина. В литературе данный факт описан, как эффект Пастера.
Таблица 2
Влияние дельта-эндотоксина на активность аспартатаминотра-сферазы в крови лабораторных мышей
Сутки Изменение активности АсАТ, % в зависимости от дозы токсина, мг/кг
Контроль (без токсина) 25 50 100
1 100 103±7 102±5 119±14
7 100 107±2 103±3 97±4
14 100 99±2 98±2 97±3
21 100 103±8 108±6 99±5
Примечание: р < 0,001 при п = 10, где п - число повторностей
В активности АсАТ также не было отмечено достоверных изменений во всех исследуемых дозах на протяжении всего эксперимента.
Таблица 3
Влияние дельта-эндотоксина на активность аланинаминотрасфе-разы в крови лабораторных мышей
Сутки Изменение активности АлАТ, % в зависимости от дозы токсина, мг/кг
Контроль (без токсина) 25 50 100
1 100 98±10 106±4 109±23
7 100 118±5 133±13 130±11
14 100 97±13 111±12 91±22
221 100 100±11 96±12 98±8,8
Примечание: -p < 0,001 при n = 10, где n - число повторностей
Также отсутствуют достоверные изменения для всех исследуемых дозах на протяжении всего эксперимента в активности АлАТ. во всех исследуемых дозах на протяжении всего эксперимента. Таким образом, не отмечено существенных изменений активности ЛДГ, АсАТ и АлАТ в сыворотки крови животных для всех исследованных доз на протяжении всего эксперимента. Следовательно, можно констатировать, что в таких количествах
дельта-эндотоксин не вызывает разрушения клеток и органов и тканей. Наши результаты подтверждаются ранее полученными данным, согласно которым не было установлено непосредственного токсического эффекта дельта-эндотоксина в высоких дозах (1000, 500 и 250 мг на кг массы животного) in vitro на клетки крови. Токсин также не оказывал влияния на жизнеспособность эритроцитов периферической крови животных [7]. Угнетающее действие B. thuringiensis in vivo в очень высоких дозах связано, вероятно, с неспецифической реакцией организма на чужеродный белок, способный проникать в кровоток.
В малых дозах дельта-эндотоксин не влияет на состояние организма, в средних дозах обладает некоторым иммуностимулирующим действием, а в больших - угнетает иммунную систему организма [8]. Работа выполнена при поддержке гранта Министерства образования и науки Российской Федерации, Федерального агентства по образованию, в рамках проекта: «Разработка теоретических основ экологически безопасного регулирования численности вредных организмов дельта-эндотоксинами Bacillus thuringiensis» (код организации: 296, коды ГРНТИ: 62.09.39).
Литература
1.Харвуд К. Р. Бациллы. Генетика и биотехнология. М.: Мир. 1992. 530 с.
2.Новожилова О.С. Автореф. дис... канд. биол. наук. Уфа., 2007., 122 с.
3.Бочкарева А.В., Зимин Ю.В., Хомутов А.Е. // Биоло-гия.2008, №5, 86-88 с.
4.Северина, Г.А. Кочетова, М. Функциональная активность ферментов и пути ее регуляции / Под. ред. С.Е. Северина, Г.А. Кочетова. М.: Изд-во МГУ .1981. 180 с.
5.Бардюкова Т.В., Зайцев С.Ю., Максимов В.И.
//Ветеринарная медицина//.2006, №2. С. 28.
6.Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. М; 1987, 197 с.
7. Феклина М. С. Действие дельта-эндотоксина на активность клеток периферической крови in vivo и in vitro / М.С. Феклина, Д.В. Каменек, Э.К. Юнусова, Л.К. Каменек , УлГУ. Ульяновск, 2008. 17 с. Деп. в ВИНИТИ 12.05.08 №407.В2008.
8. Феклина М. С. Изменение активности клеток крови под действием дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis / Л. К. Каме-нек, Э. К. Юнусова, Л.Ю.Савельева, В.В. Ногичева // Материалы II Международной научно-практической конференции «Постге-номная эра в биологии и проблемы биотехнологии». Казань: КГУ, 2008. С. 139-140.
9.Каменек Л.К. Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis: строение, свойства и использование для защиты растений // Автореф. дисс. докт. биол. н. М., 1998. 40 с.
10.Каменек Л.К. Изучение механизма действия дельтаэндотоксина Bacillus thuringiensis на насекомых // Автореф. дис... канд. биол. н. Л. 1985. 19 с.
УДК 611.018.5
ГИПОТЕЗА О ГАРМОНИЧЕСКОМ МЕХАНИЗМЕ САМООРГАНИЗАЦИИ ТЕЗИОГРАММ КРОВИ И ЕЕ ПРЕПАРАТОВ
В.Н. КИДАЛОВ, А.А. ХАДАРЦЕВ, А.В. ЧЕЧЕТКИН
В процессе самоорганизации тезиограммы крови осуществляют поиск энергетического экстремума, и в течение короткого времени приближаются к нему в экспоненциальном развитии. Оптимальным алгоритмом поиска является естественное разбиение пространства, на котором осуществляется поиск, в золотой пропорции (1/Ф=0,62). Ключевые слова: самоорганизация, кровь, тезиограмма
Примером самоорганизации сложнокомпонентных биологических систем из раствора на плоскости является тезиография (ТЗГ), или кристаллогенез крови и ее препаратов. Постижение закономерностей естественного тезиографического процесса, способов управления им, создает возможности получать из крови и биожидкостей твердые вещества известного состава с заранее определенными свойствами, необходимые для экспериментальных и лечебных целей. Исследования морфологических особенностей специфических тезиографических структур (СТС) крови и ее препаратов могут лечь в основу новых методов диагностики различных заболеваний человека и животных. В препаратах, приготовленных из крови и биожидкостей на стекле или подложках из иного материала, по мере возрастания концентрации растворенных веществ, вызванной испарением растворителя, наблюдается последовательность событий: от изменения температуры в зоне кристаллизации, появления автоволн, образования гелевой матрицы до
самой кристаллизации с образованием кристаллов, кристаллитов и кристаллоидных включений в различных участках фации сформировавшегося (самоорганизовавшегося) препарата. Нередко такие препараты крови, особенно взятые от здоровых людей или животных, поражают своей симметрией и гармоническими соотношениями их мельчайших СТС (рис.1). При этом, в зависимости от вида препарата, его состава и способов его обработки ТЗГ принимают характерный для конкретного препарата и ситуации вид.
5 6 7 8
Рис.1. Гармония в ТЗГ препаратов крови: ветовая микроскопия. Ув. х 90 -х 120 1 - ТЗГ эритромассы; 2 - эритроцитарный тест-препарат для проверки автоматических гемоцитометров (США), средняя и центральная части тезиограммы; 3 - ТЗГ плазмы крови донора № 015113; 4 - ТЗГ плазмы крови донора № 015114; 5 - ТЗГ эритроцитной фильтрованной взвеси; 6 -То же: фазовый контраст; 7. ТЗГ крови донора сразу после забора крови, средняя и центральная части препарата. Ув. х90; 8. ТЗГ крови донора сразу после забора крови, средняя и центральная части препарата. Ув. х90.
Самоорганизация биожидкости в процессе формирования ТЗГ зависит от множества процессов, протекающих на различных уровнях организации материи.
Предложены перспективные теории и гипотезы расшифровки процессов самоорганизации крови и других биожидкостей. Определена зависимость характера СТС ТЗГ-препаратов от насыщенности жидкости растворенными веществами и характеристик предела их растворимости [9], зависимость кинетики процесса кристаллизации и характера фрактализации фации ТЗГ от внешних по отношению к ТЗГ-препарату условий (температуры, освещения, влияния электромагнитных полей (ЭМП) и др.) [2,19], установлена зависимость растворимости разнообразных веществ в крови, а следовательно, морфологии ТЗГ, от атмосферного давления в соответствии с законом Генри [3], а также значение частиц определенной минимальной (критической) величины (групп ионов, молекул), как кристаллического зародыша. В крови зародыш может не иметь кристаллической структуры, это может быть устойчивый нанокомплекс ионов или молекул, способных к дальнейшему росту [16], показана роль флук-туационных явлений в возникновении устойчивых кристаллических зародышей [20], зависимость формирования СТС и морфологии ТЗГ-препаратов от числа частиц в биожидкости и их коллективного взаимодействия. Появление нового слоя на растущем кристалле напоминает процесс возникновения новой фазы: для образования слоя требуется определенное конечное пересыщение раствора, при котором возникает устойчивый двухмерный зародыш, разрастающийся уже по всей грани. Процесс наслоения не является непрерывным. Равновесие между адсорбционным слоем и раствором при дегидратации ТЗГ-препарата устанавливается быстро, поэтому при переходе частиц в кристаллическую решетку адсорбционный слой тотчас же восстанавливается за счет поступления в него новых частиц из окружающего раствора [14]. Хотя вероятность присоединения ионов (или молекул) к разным участкам грани кристалла одинакова, рост кристалла происходит главным образом на недостроенных частях кристаллической решетки, так как осаждение металла на этих участках сопряжено с минимальным увеличением поверхности кристалла и, следовательно, его поверхностной энергии [21]. Зародыш новой фазы, возникший из исходной, становится устойчивым лишь по достижении определенных размеров в соответствии с правилом Гиббса. Рост зародышей до этих размеров сопровождается увеличением свободной энергии системы, что связано с ее затратой на создание поверхности раздела [12]. Механизм кристаллизации определяется процессами возникновения и функционирования ЭМП, а сам кристалл становится формой существования постоянного ЭМП в данном веществе. Кристаллы, Земля и даже живая клетка - все это различные формы существования ЭМП. При испарении растворов и в других случаях создаются условия конденсированной среды, в которой уже в момент образо-
