CC BY
59
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2013, № 1
УДК 632.78:577.21
ИЗМЕНЧИВОСТЬ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ
ПОПУЛЯЦИЙ У ЯБЛОННОЙ ПЛОДОЖОРКИ Cydia pomonella (L.)
ПОД ВЛИЯНИЕМ ИНСЕКТИЦИДОВ И ДРУГИХ СТРЕССОВЫХ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ*
В.И. КИЛЬ, Е.Н. БЕСЕДИНА
С использованием PCR-анализа оценили состав двух географических популяций яблонной плодожорки по ДНК-маркерам. Описана молекулярно-генетическая структура исследуемых популяций вредителя и изучена ее изменчивость под влиянием инсектицидов, условий года и географического положения. По двум микросателлитным локусам исследовано внутрипопуляционное генетическое разнообразие вредителя в садах с разной интенсивностью инсектицидных обработок. Показано, что генетическое разнообразие популяций у яблонной плодожорки определяется главным образом ее генетическими особенностями, а не инсектицидным фактором или погодными условиями.
Ключевые слова: полиморфизм, генетическое разнообразие, микросателлитные локусы, популяция, яблонная плодожорка, ДНК, RAPD-PCR, SSR-PCR.
Keywords: polymorphism, genetic diversity, microsatellite loci, population, codling moth, DNA, RAPD-PCR, SSR-PCR.
Изучение генетики популяций насекомых-вредителей имеет большое значение для мониторинга процессов их миграции и потока генов (1, 2). Кроме того, анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры популяций способствует более глубокому пониманию механизмов развития резистентности насекомых к инсектицидам (3).
Яблонная плодожорка Cydia pomonella (L.) (Lepidoptera: Tortrici-dae) — основной вредитель фруктового сада во всем мире. Свыше 70 % обработок плодовых культур инсектицидами связаны с контролем ее численности (4). Несмотря на значительный экономический ущерб, причиняемый яблонной плодожоркой, об изменчивости генетической структуры и генетического разнообразия популяций C. pomonella под влиянием инсектицидов известно очень мало. В то же время подобные сведения важны при разработке стратегии защитных мероприятий (5).
Ранее мы исследовали молекулярно-генетическую структуру различных географических популяций яблонной плодожорки по RAPD (randomly amplified DNA polymerase chain reaction), ISSR (inter simple sequence repeats) и SSR (simple sequence repeats) маркерам (6-9).
Цель настоящей работы заключалась в изучении влияния инсектицидов, географического положения и условий года на молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяций Cydia pomonella.
Методика. Объектом наблюдений (2008-2010 годы, Краснодарский край) были выборки из двух популяций яблонной плодожорки. Насекомых отлавливали с помощью феромонных ловушек в садах с неодинаковой интенсивностью инсектицидных обработок: особей краснодарской популяции — в саду Всероссийского НИИ биологической защиты растений (ВНИИЗБР, до 12 обработок ежегодно), учхозе «Экологический сад» (4-5 обработок экологически малоопасными инсектицидами), учхозе «Органический сад» (без обработок), особей ейской — в садах «Колледж Ейский» (до 12 обработок ежегодно) и «Малюс» (без обработок). Объем каждой выборки составлял 20-60 насекомых.
Выделение ДНК, RAPD- и SSR-PCR проводили по протоколам,
* Работа выполнена при поддержке РФФИ и администрации Краснодарского края (грант № 09-04-96514).
61
описанным нами ранее (10, 11). Во избежание ошибки опыта в RAPD-PCR все исследуемые образцы ДНК анализировали одновременно в одной реакции (по каждому праймеру отдельно), на одном приборе, с использованием стандартного набора реактивов. Как мы уже отмечали, соблюдение таких условий достаточно для адекватной оценки результатов RAPD-PCR, в том числе при анализе ДНК насекомых из разных таксонов (12). В SSR-PCR использовали две пары праймеров (13), фланкирующих микросател-литные локусы: Ср1.63 — мотив повтора (GA)x9, Ср2.39 — мотив повтора (ТС)4АС(ТС)ц. Продукты SSR-PCR разделяли в 8 % полиакриламидном геле длиной 20 см и толщиной 1 мм при напряжении 200-300 В в течение 5-6 ч. Визуализацию ампликонов после предварительного окрашивания бромистым этидием проводили в ультрафиолетовом свете, используя трансиллюминатор ECX-20.M («Vilber Lourmat», Франция).
Степень ДНК-полиморфизма определяли как отношение числа полиморфных ДНК-фрагментов к общему числу ДНК-маркеров. Молекулярно-генетическую структуру описывали по частоте встречаемости ДНК-фраг-ментов и проводили сравнительную оценку изменчивости по критерию X2. Сравнение средних значений по выборке выполняли по ¿-критерию Стью-дента с использованием программы Microsoft Excel. Оценку генетического разнообразия популяций, генетического сходства и кластерный анализ данных осуществляли по M. Nei и С. Shennon методом UPGMA (невзвешенный парно-групповой метод с арифметическим усреднением) в программе POPGENE v. 1.31.
Результаты. В л и я н и е и н с е к т и ц и д о в н а в н у т р и-п о п у л я ц и о н н о е г е н е т и ч е с к о е р а з н о о б р а з и е. Результаты SSR-PCR анализа показали, что между насекомыми из краснодарской популяции C. pomonella видимые различия в ДНК-спектрах в целом отсутствовали (рис. 1). Это же наглядно демонстрировали данные статистической обработки (табл. 1).
1. ДНК-полиморфизм по 88Я-маркерам и генетическое разнообразие популяций Суй1а ротопе11а (Ь.) в садах с разной интенсивностью инсектицидных обработок (Краснодарский край, 2010 год)
Показатель Краснодарская популяция Ейская популяция
учхоз «Органический сад» (без обработок) учхоз «Экологический сад» ВНИИБЗР сад «Малюс» (без обработок) сад «Колледж Ейский»
Л о к у с Ср.1.63
h 0,14±0,17 0,14±0,16 0,17±0,14* 0,08±0,09 0,08±0,06
I 0,23±0,23 0,22±0,23 0,29±0,18* 0,15±0,17 0,15 ±0,11
Л о к у с Ср.2.39
h 0,22±0,15* 0,25±0,14* 0,22±0,17* 0,17 ±0,1 0,12±0,10
I 0,35±0,19* 0,40±0,19* 0,35±0,24* 0,30±0,16 0,22±0,15
П р и м е ч а н и е. ВНИИЗБР — сад Всероссийского НИИ биологической защиты растений, до 12 обработок по насекомым ежегодно; учхоз «Экологический сад» и сад «Колледж Ейский» — соответственно 4-5 и до 12 обработок по насекомым ежегодно; Ь — генетическое разнообразие по М. N01 (среднее±стан-дартное отклонение), I — индекс Шеннона (среднее±стандартное отклонение).
* Достоверно отличаются от выборки из сада «Колледж Ейский» (?факг. - ?05).
Оценка влияния инсектицидной нагрузки на внутрипопуляционный генетический полиморфизм у яблонной плодожорки показала, что как в краснодарской, так и в ейской популяции значения индексов генетического разнообразия в вариантах без обработок практически не отличались от таковых при инсектицидных обработках (различия были статистически не достоверны). При этом важно отметить, что даже значительное число инсектицидных обработок (в садах ВНИИБЗР и «Колледж Ейский» — до 12 ежегодно) не вызывало снижения внутрипопуляционного генетического раз-
нообразия у насекомых (см. табл. 1).
м
м
а
— -4-395
— -«-318
ГГ ^"216
— ■■«-164
М
М
-395
-318
-216
-164
А
Б
Рис. 1. Индивидуальные электрофореграммы ампликонов (88Я-РСЯ) по микросателлитным ло-кусам Ср1.63 (А) и Ср2.39 (Б) у насекомых из краснодарской популяции €уй1а ротопе11а (Ь.), собранных в садах с интенсивными инсектицидными обработками (а — Всероссийский НИИ биологической защиты растений, до 12 обработок по насекомым ежегодно) и без обработок (б — учхоз «Органический сад»): М — маркеры молекулярных масс, п.н. (8 % полиакриламидный гель) (Краснодарский край, 2010 год).
В то же время при сравнении двух исследуемых географических популяций яблонной плодожорки имелись достоверные различия, особенно четко выявляемые по локусу Ср.2.39 (см. табл. 1). Так, генетическое разнообразие в краснодарской популяции С. ротопвИа было в 1,5-2,0 раза выше, чем в ейской (в целом по всем выборкам /факт. = 3,69 - /05). Это указывало на тот факт, что внутрипопуляционное генетическое разнообразие главным образом обусловлено географическим положением популяции (ее биологическими и генотипическими особенностями, определяемыми в том числе потоком генов), тогда как инсектицидные обработки не приводят к снижению генетического разнообразия в популяциях (ранее мы, наоборот, предполагали, что такое снижение возможно) (8, 9).
Подобное заключение подтверждалось оценкой генетического сходства исследуемых выборок. Наиболее близкими в генетическом отношении оказались ейские выборки из садов «Колледж Ейский» и «Малюс» (генетическая идентичность 1 по М. №1 равнялась 1,00), что свидетельствовало об их принадлежности к одной популяции. По аналогии выборки из краснодарской популяции были генетически близки (1 = 0,94-0,96) и отличались от выборок из ейской популяции. Это наглядно демонстрировали и данные кластерного анализа (рис. 2), согласно которому исследуемые выборки входили в два кластера, соответствующие их географическому положению.
Таким образом, у яблонной плодожорки внутри-популяционное генетическое разнообразие не обусловлено числом инсектицидных обработок в садах. При этом очевидно, что инсектициды могут влиять не только на численность популяции насекомых в целом, но и на ее молекулярно-генетическую структуру, то есть частоту встречаемости отдельных генетических элементов. Однако подобный эффект не приводил к изменению внутрипопуляционно-го генетического разнообразия, а различия по этому показателю определялись исключительно географическим положением популяций (их генотипическими особенностями и условиями размножения).
Сделанные нами выводы согласуются с данными немецких ученых (14), изучавших устойчивость яблонной плодожорки к бакуловирусу СрОУ. Они выяснили, что даже при высоких показателях резистентности популяция вредителя оставалась генетически неоднородной и в ней присутствовали чувствительные к вирусному препарату насекомые. Следовательно, генетическое разнообразие у чувствительных и резистентных популяций может не различаться из-за гетерогенности последних.
В л и я н и е у с л о в и й г о д а н а м о л е к у л я р н о-г е н е т и ч е с к у ю с т р у к т у р у и г е н е т и ч е с к о е р а з н о-о б р а з и е п о п у л я ц и й. Для анализа изменчивости молекулярногенетической структуры популяции яблонной плодожорки в зависимости от условий окружающей среды были отобраны выборки насекомых из одного сада (ВНИИБЗР) в разные периоды исследований (2008 и 2010 годы). Инсектицидная нагрузка при этом не изменялась, однако погодные условия 2010 года характеризовались экстремально высокими температурами в летние месяцы (свыше 40 °С) и практически полным отсутствием осадков.
Результаты РСЯ-анализа краснодарской популяции С. ротопвИа по КАРБ-маркерам выявили отсутствие сколько-нибудь видимых различий в ДНК-спектрах между двумя исследуемыми выборками (2008 и 2010 годов). В то же время в ряде случаев (по отдельным праймерам) в выборках насекомых отмечали неодинаковую частоту некоторых ДНК-маркеров. Кроме того, наблюдалось некоторое снижение числа ДНК-фрагментов на особь в 2008 году по сравнению с аналогичным показателем в 2010 году (табл. 2). Это, по-видимому, объясняется частичной деградацией водных растворов ДНК, хранившихся в течение 2 лет (с 2008 года) при -20 °С.
«Экологический сад»
---------ВНИИБЗР
_________Учхоз
«Органический сад»
00_______Сад
«Колледж Ейский»
Сад «Малюс»
Рис. 2. Дендрограмма, отражающая генетические расстояния между ейской (1) и краснодарской (2 и 3) популяциями Суйїа ротопеїіа (Ь.) из садов с разной интенсивностью инсектицидных обработок (4) (см. раздел «Методика»). Дендрограмма построена методом иРОМЛ (невзвешенный парно-групповой метод с арифметическим усреднением) по М. №і (Краснодарский край, 2010 год).
Однако в целом молекулярно-генетическая структура оставалась неизменной, статистически значимых отличий в ДНК-спектрах мы не обнаружили
(Х2ф акт. ^ Х205).
2. ДНК-полиморфизм по ЯАРБ-маркерам в краснодарской популяции Суй1а ротопе11а (Ь.) на фоне интенсивных инсектицидных обработок в разные годы исследований (Краснодарский край, сад Всероссийского НИИ биологической защиты растений)
RAPD - праймер Степень ДНК-полиморфизма, % Число детектируемых ДНК-фрагментов Среднее число ДНК-фрагментов на особь х2
2008 | 2010 2008 2010 2008 | 2010
OPAÖ2 100 100 19 18 5,9 7,5 8,4
OPAÖ6 1ÖÖ 100 15 16 4,4 7,8 21,2
OPA2Ö 94,7 94,7 19 19 4,5 6,9 25,2
OPBÖ1 100 100 17 16 4,9 5,2 17,2
OPBÖ8 94,1 94,1 12 17 4,3 5,3 12,8
OPDÖ6 100 100 11 15 4,0 5,9 18,2
OPEÖ7 100 94,1 17 17 5,3 7,4 22,5
П р и м е ч а н и е. Число ежегодных обработок инсектицидами — до 12; х2факг, ä Х205 (различия недостоверны).
Для того чтобы проверить предположение о частичной деградации ДНК, мы провели RAPD-анализ ейской популяции насекомых по двум праймерам — ОРАОб и ОРА20, сравнив препараты ДНК, которые находились при -20 °С в течение 2 лет, со свежевыделенными (2011 год) из биоматериала той же выборки 2008 года (насекомых хранили в чашках Петри при +4 °С). В варианте, когда в PCR использовали ДНК после хранения при -20 °С, по RAPD-праймеру 0РА06 имелись ампликоны, которые были выражены очень слабо или совсем отсутствовали, а по RAPD-праймеру 0РА20 насчитывалось достоверно меньше ДНК-фрагментов, чем при анализе свежевыделенной ДНК (в среднем на особь соответственно 8,7±0,92 против 14,2+0,78, ¿фЖт. = 4,59 > <0s)-
3. ДНК-полиморфизм по ввЯ-маркерам и генетическое разнообразие популяций Суй1а ротопе11а (Ь.) на фоне интенсивных инсектицидных обработок в разные годы исследований (Краснодарский край)
Показатель Ейская популяция (сад «Колледж Ейский») Краснодарская популяция (сад BHHHB3P)
2008 | 2010 2008 1 2010
Л о к у с Ср.1.63
n 20 20 35 60
A 12 12 25 25
Ar 1,8 2,6 3,5 4,3
h 0,14±0,09 0,19±0,14 0,14±0,13 0,15±0,15
I 0,26±0,14 0,31±0,20 0,24±0,19 0,26±0,19
х2 13,3 Л о к у с Ср.2.39 23,0
n 20 20 26 60
A 27 27 32 32
Ar 5,1 5,9 8,5 11,3
h 0,18±0,13 0,19±0,13 0,19±0,16 0,26±0,14*
I 0,31±0,18 0,32±0,18 0,31±0,21 0,41±0,18*
Х2 23,3 58,8*
П р и м е ч а н и е. ВНИИБЗР — Всероссийский НИИ биологической защиты растений; n — объем выборки, A — число аллелей, Ar — обогащенность аллелями (allelic richness), или средняя частота аллелей на одну особь, h — генетическое разнообразие по M. Nei (среднее±стандартное отклонение), I — индекс Шеннона (среднее±стандартное отклонение).
* Различия достоверны (¿факт. а ¿05; Х2факт. а х205).____________________________
Выявленный факт свидетельствовал, что зафиксированные нами изменения в молекулярно-генетической структуре популяций были, скорее всего, вызваны не изменениями условий внешней среды, а деградацией водных растворов ДНК при хранении.
В отличие от RAPD-маркеров, микросателлитные SSR-маркеры об-
ладают большей воспроизводимостью ввиду более высокой температуры отжига в полимеразной цепной реакции и большей специфичностью связывания праймеров с ДНК-матрицей. Поэтому несомненный интерес представляло изучение изменчивости молекулярно-генетической структуры у исследуемых популяций насекомых по микросателлитным локусам под влиянием условий года. Результаты SSR-PCR анализа показали, что электрофоретические спектры ампликонов, полученные с использованием ДНК насекомых, собранных в 2010 году, характеризовались большим числом фрагментов по сравнению с таковыми в 2008 году (табл. 3). В краснодарской популяции C. pomonella такое изменение в молекулярно-генетической структуре и генетическом разнообразии (по локусу Ср.2.39) было к тому же статистически значимым (¿факт. > ¿05Í Х2факт. > Х205). Кроме того, при анализе ДНК яблонной плодожорки в образцах 2008 года наблюдали некоторое уменьшение среднего числа ДНК-фрагментов на особь и снижение внутрипопуляционного генетического разнообразия по сравнению с аналогичными показателями в образцах 2010 года.
Таким образом, как и при анализе популяций C. pomonella по RAPD-маркерам, с SSR-маркерами, несмотря на более высокую специфичность связывания, также выявлялось общее снижение числа ДНК-маркеров в PCR-спектрах образцов ДНК, выделенных в 2008 году. По нашим данным, это объяснялось частичной деградацией водных растворов ДНК (образцы 2008 года), хранившихся в течение 2 лет при -20 °С, а не изменениями в молекулярно-генетической структуре и генетическом разнообразии популяций яблонной плодожорки. Следовательно, как жаркое и сухое лето 2010 года, так и инсектициды не оказали деструктивного влияния на внутрипопуляционное генетическое разнообразие.
Итак, в популяциях яблонной плодожорки Cydia pomonella (L.) влияние инсектицидов и условий года не приводит к снижению генетического разнообразия, а различия по этому показателю, наблюдаемые между популяциями, определяются в первую очередь их географическим положением (генетическими особенностями). Очевидно, что стрессовые факторы внешней среды, будь то инсектициды или экстремальные погодные условия, могут сказаться на численности или молекулярно-генетической структуре популяции C. pomonella, то есть на частоте некоторых генотипов. Однако, как свидетельствуют наши эксперименты, это не всегда означает, что одновременно снижается внутрипопуляционное генетическое разнообразие особей. Выполняя сравнительный PCR-анализ с различными выборками насекомых, необходимо также учитывать тот факт, что при хранении возможна частичная деградация водных препаратов выделенной тотальной ДНК (например, из-за размораживания при аварийном отключении электроэнергии). Подобные изменения неизбежно приводят к снижению числа ДНК-фрагментов в анализируемых PCR-спектрах (RAPD- и SSR-PCR). В этой связи мы рекомендуем сохранять биоматериал (насекомых) в чашках Петри при +4 °С, а водные препараты ДНК лиофилизировать или пере-осаждать этанолом и хранить в морозильной камере (при -20 °С).
Авторы выражают искреннюю благодарность О.Д. Ниязову и Е.С. Сугоняеву за предоставленный биоматериал.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. S c o t t L.J., L a w r e n c e N., L a n g e C.L. et al. Population dynamics and gene flow of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) on cotton and grain crops in the Murrum-bidgee Valley, Australia. J. Econ. Entomol., 2006, 99: 155-163.
2. E n d e r s b y N.M., H o f f m a n n A.A., M c K e c h n i e S.W., W e e k s A.R. Is
there genetic structure in populations of Helicoverpa armígera from Australia? Entomol. Exp.
Appl., 2007, 122: 253-263.
3. T i m m A.E., G e e r t s e m a H., W a r n i c h L. Gene flow among Cydia pomonella (L.) (Lepidoptera: Tortricidae) geographic and host populations in South Africa. J. Econ. Entomol., 2006, 99: 341-348.
4. Franck P.., Reyes М., Olivares, J., Sauphanor B. Genetic architecture in codling moth populations: comparison between microsatellite and insecticide resistance markers. Mol. Ecol., 2007, 16: 3554-3564.
5. C a l k i n s C.O., F a u s t R.J. Overview of areawide programs and the program for suppression of codling moth in the western USA directed by the United States Department of Ag-
riculture — Agricultural Research Service. Pest. Manag. Sci., 2003, 59: 601-604.
6. К и л ь В.И., Б е с е д и н а Е.Н., Ф е д и ч е в а О.О. ДНК полиморфизм различных популяций яблонной плодожорки Cydia pomonella (L.) (Lepidoptera: Torticidae). Тр. Ставропольского отделения Русского энтомологического общества (мат. II Межд. науч.-практ. интернет-конф. «Актуальным вопросы энтомологии»), 2009, 5: 154-157.
7. К и л ь В.И., Б е с е д и н а Е.Н., Ф е д и ч е в а О.О. Молекулярно-генетический анализ популяций яблонной плодожорки Cydia pomonella L. по RAPD- и ISSR-маркерам. Инф. бюл. Восточно-Палеарктической региональной секции Международной организации по биологической борьбе с вредными животными и растениями (мат. докл. Межд. симп. «Защита растений — достижения и перспективы», г. Кишинев), 2009, 40: 92-94.
8. К и л ь В.И. Молекулярно-генетический анализ популяций яблонной плодожорки Cydia pomonella по микросателлитныш локусам. Мат. Межд. науч.-практ. конф. «Биологическая защита растений — основа стабилизации агроэкосистем». Краснодар, 2010, вып. 6: 281-284.
9. К и л ь В.И. ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяций яблонной плодожорки и хлопковой совки по микросателлитным локусам. Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного университета, 2010, 62(08), октябрь (http : //ej.kubagro.ru/2010/08/pdf).
10. К и л ь В.И. Методика оценки ДНК-полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR): метод. реком. Краснодар, 2009.
11. К и л ь В.И. ДНК-технология ПЦР-анализа популяций яблонной плодожорки по мик-росателлитным локусам. Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного университета, 2011, 68(04), апрель (http://ej.kubag-ro.ru/2011/04/pdf).
12. К и л ь В.И., Г р о н и н В.В., К р у т е н к о Д.В., И с м а и л о в В.Я. О полиморфизме RAPD-маркеров у различный таксонов полужесткокрышытх (Hemiptera). Сельскохозяйственная биология, 2008, 1: 70-76.
13. F r a n c k P., G u é r i n F., L o i s e a u A., S a u p h a n o r B. Isolation and characterization of microsatellite loci in the codling moth Cydia pomonella L. (Lepidoptera, Tortricidae). Molecular Biology Notes, 2005, 5(1): 99-102.
14. A s s e r - K a i s e r S., F r i t s c h E., U n d o r f - S p a h n K., K i e n z l e J., E b e r l e K.E., G u n d N.A., R e i n e k e A., Z e b i t z C.P.W., H e c k e l D.G., H u -b e r J., J e h l e J.A. Rapid emergence of Baculovirus resistance in codling moth due to dominant sex linked inheritance. Science, 2007, 317: 1916-1918.
ГНУ Всероссийский НИИ биологической защиты растений Росселъхозакадемии,
350039 г. Краснодар-39, ВНИИБЗР, e-mail: [email protected]
VARIABILITY OF MOLECULAR GENETIC STRUCTURE IN CODLING MOTH Cydia pomonella (L.) POPULATIONS UNDER THE INFLUENCE OF INSECTICIDES AND ENVIRONMENTAL STRESSES
V.I. Kil’, E.N. Besedina S u m m a r y
The results of the PCR analysis of two codling moth populations using RAPD and SSR markers are presented. The molecular genetic structure of investigated pest populations is described and its variability under influence of insecticides, varying climatic conditions during 2008 to 2011 and geographic location is studied. The intra-population genetic diversity by two microsatellite loci was estimated in pests from the gardens with different insecticide press. Genetic diversity of codling moth populations was shown to depend mainly on genetic features of the populations, bur not on the insecticide load or weather conditions.
Поступила в редакцию 19 сентября 2011 года
