CC BY
56
УДК 577.127:547.973
ИЗМЕНЧИВОСТЬ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ
МОЖЖЕВЕЛЬНИКА КАЗАЦКОГО В ГРАДИЕНТЕ СОДЕРЖАНИЯ ИОНОВ МЕДИ НА ЮЖНОМ УРАЛЕ
© А. В. Щербаков1*, С. Р. Рахматуллина1, М. В. Чистякова-Мавлетова1,
И. Ю. Усманов2
1 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел./факс: +7 (347) 229 96 30.
E-mail: [email protected] Уфимский государственный университет экономики и сервиса Россия, Республика Башкортостан, 450078 г. Уфа, Чернышевского, 145.
Тел.: +7 (347) 252 77 05.
E-mail: [email protected]
Представлены данные о накоплении и антиоксидантной активности флавоноидов в различных органах Можжевельника казацкого (Juniperus sabina) в зависимости от содержания в этих органах ионов меди. Выявлено, что возрастание содержания эндогенной меди приводит к высокой пластичности состава выявленных флавоноидов. При этом установлено, что динамика накопления флавоноидов в органах на фоне различного содержания в них эндогенной меди не имеет защитного характера. Полученные данные, наряду с данными о соотношении содержания экзогенной и эндогенной меди, позволяют сделать вывод, что растения можжевельника казацкого по отношению к меди действуют, как «исключатели» тяжелых металлов.
Ключевые слова: флавоноиды, антиоксидантная активность, динамика накопления, медь, пластичность.
Введение
Токсический эффект от повышенного содержания тяжелых металлов в растений в последнее время обсуждается очень активно [1—3]. Тяжелые металлы (далее ТМ) в соответствующих концентрациях являются сильными стресс-факторами и одними из главных природных токсикантов, с которыми растения сталкиваются либо в своих естественных местах обитания, либо в связи с нарастающим антропогенным воздействием на окружающую среду. Чувствительность растений к ионам отдельного ТМ зависит не только от его токсического действия, но довольно часто определяется также качественным и количественным составом других соединений
В настоящее время считается, что по отношению к данному ТМ растения разных видов могут выступать как:
1. Аккумуляторы и гипераккумуляторы — содержание ионов ТМ в растениях многократно превышает их содержание в почве. Эти растения сформировали конститутивные механизмы устойчивости к тяжелым металлам, что позволяет им аккумулировать токсичные элементы в метаболически инертных органах и органеллах или включать их в хелаты и тем самым переводить в физиологически безопасные формы. Сюда относятся растения, накапливающие металлы главным образом в надземных органах как при низком, так и высоком содержании их в почве;
2. Индикаторы — содержание ионов ТМ в растениях соответствует таковому в почве или в окружающей среде;
3. Исключатели — в побегах этих растений поддерживается низкая концентрация ионов ТМ, несмотря на высокую концентрацию в окружающей среде. В этом случае барьерную функцию обычно выполняет корень [3, 4].
Одним из типичных ТМ, часто оказывающих токсическое действие на растения, является медь [3-5] что актуально и для Южного Урала [6-8].
Одним из классов веществ, участвующих в защите растений от ТМ являются флавоноиды [9, 10]. Кроме непосредственного хелатирования ионов тяжелых металлов, известны еще 2 защитные функции флавоноидов:
1. Торможение вызванного тяжелыми металлами образования активных форм кислорода, то есть антирадикальная активность [10].
2. Ингибирование ферментов, связанных с продуцированием АФК — фермент-ингибирующая функция. Флавоноиды способны ингибировать ферменты, ответственные за синтез супероксид-аниона - протеинкиназу и ксантиноксидазу и др. [10]. Механизмы этих процессов могут быть основаны на конкуренции фенолов с субстратом при связывании с регуляторным центром фермента, или инактивации активного центра. Огромное количество фенолов, особенно флавоноиды, ингиби-рует простагландинсинтазу, липоксигеназу, мие-лопероксидазу, НАД(Ф)Н-оксидазу и ксантинок-сидазу [9].
Целью данных исследований было изучение качественного и количественного состава флаво-ноидов в различных органах растений можжевельника казацкого (Juniperus sabina), собранных на
* автор, ответственный за переписку
территории Баймакского района в условиях повышенного содержания в почве ионов меди.
Экспериментальная часть
Объектами служили образцы хвои и стеблей мужских растений, а также хвои, стеблей и шиш-коягод женских растений. Координаты — 51°51' северной широты, 58°25' восточной долготы, абсолютная высота 715 м над уровнем моря. Образцы были взяты с 7 опорных точек, расположенных на разной высоте на склоне восточной экспозиции.
Содержание обменной меди в почве и меди, накопленной растениями, определялось методом обратной полярографии на приборе «Полярограф Экотест-2». В качестве фонового раствора использовался 0,01 М раствор азотной кислоты. Стандартный образец ГСО меди (Cu) разводился до концентрации 20мг/л.
Определение флавоноидов в образцах проводилось методом ВЭЖХ. Экстракция флавоноидов осуществлялась 70% этанолом. Для улучшения разделения веществ методом ВЭЖХ было применено градиентное элюирование: Вода: ацетонитрил = градиент (5-20 минут - 90:10^40:60, 30-45 минут - 0:100^90:10). Хроматографирование спиртовых экстрактов образцов для определения флава-ноидов производилось в обратно-фазовом режиме на колонке Luna C18 250x4.6 мм, 5 мкм. Стандарты и вещества в образцах детектировались при длине волны 360 нм.
Для оценки общей антиоксидантной активности выявленных флавоноидов нами был предложен показатель суммарной неспецифической антиокси-дантной активности накопленных флавоноидов -антиоксидантный статус (АС), который может быть расчитан как сумма произведений содержания отдельных флавоноидов, обнаруженных в сырье (мг/г сухой массы) на стандартные показатели оценки их антиоксидантной активности. Эти показатели определяются по стандартной методике и выражаются в тролокс-эквивалентах (TEAC, trolox equivalent antioxidant capacity, мМ [10]), то есть в единицах концентрации в растворе синтетического антиок-сиданта тролокса, используемого в качестве стандарта: n
АС = X TEACi*[ ], i = 1
Все измерения проводились в 4-5 аналитических и 3-4 биологических повторностях.
Результаты и обсуждение
Показатели содержания меди в почве и в растениях. Было установлено, что содержание обменной меди в почве в исследованных опорных точках варьировало в диапазоне от 5.46 до 7.0410-3 мг/г сухой почвы, что в 1.5 и более раз превышает показатель ПДК по меди для почв сельскохозяйственного значения, который составляет 3 • 10-3 мг/г сухой почвы [3].
Данные о содержании обменной меди в почве и органах растений можжевельника казацкого представлены в табл.
Как следует из представленных данных, содержание меди в органах можжевельника казацкого в среднем на 1—2 порядка ниже содержания меди в почве.
Показатели накопления флавоноидов органами можжевельника казацкого. В исследованных образцах было выявлено 4 флавоноида — квер-цетин, изокверцетин, рутин и нарингенин.
Анализ накопления флавоноидов различными органами мужских и женских растений в ответ на различное содержание в этих органах меди позволил выявить следующую картину.
Было установлено, что стебли мужских и женских растений в целом отличаются минимальным содержанием выявленных соединений и отсутствием явно выраженной зависимости их накопления от содержания меди в этих органах (рис. 1 и 2).
Как следует из представленных данных, в стеблях растений можжевельника наибольшим содержанием отличается рутин, содержание которого варьирует от 0.3 до 3.6 мг/г сухой массы.
В других органах можжевельника казацкого зарегистрировано более высокое содержание выявленных флавоноидов, при этом рутин часто не является доминирующим соединением (рис. 3—5).
Как следует из представленных данных, в хвое мужских и женских растений, а также шишкоягодах женских растений кроме рутина в значительных количествах могут встречаться также изокверцетин и нарингенин. В целом установлено, что по мере возрастания содержания меди в изученных органах рутин встречается достаточно стабильно, а накопление других выявленных флавоноидов варьирует в широком диапазоне — от полного их отсутствия до накопления в концентрации, наибольшей среди всех выявленных соединений. Наименьшее содержание во всех исследованных образцах можжевельника характерно для кверцетина. При этом между накоплением меди в органах можжевельника казацкого и содержанием в них отдельных флавоноидов не выявлено значимых корреляционных связей.
Показатели антиоксидантной активности обнаруженных флавоноидов. Данные о суммарной антиоксидантной активности (АС) выявленных флавоноидов в отдельных органах мужских и женских растений представлены на рис. 6 и 7.
Как следует из представленных данных, показатель суммарной антиоксидантной активности выявленных в отдельных органах флавоноидов не имеет четкой зависимости от накопления в них меди. Однако в целом антиоксидантная активность флавоноидов в стеблях мужских и женских растений имеет обратную динамику, о чем свидетельствует выявленная значимая обратная зависимость между этими величинами (коэффициент корреляции 0.93, р < 0.05).
Таблица
Диапазон содержания обменной меди в почве и в органах можжевельника казацкого
Концентрация обменной меди в почве, 10 3 мг/г Содержание меди в мужских растениях, 10 3мг/г Содержание меди в женских растениях, 10 3мг/г
хвоя стебли хвоя стебли шишкоягоды
5.46-7.04
0.028-0.44
0.036-1.4 0.03-0.59 0.36-1.24 0.09-1.07
>я
12.
te Ы о.
о П § 0
О
■
1 i J I L с
- i - -
- - ж 1 -
кверц Iизокверц | рутин 'нарингенин
1
2 3 4 5 6 7 0.036 10-3 мг/г- 1.4-10"3 мг/г Градиент возрастания содержания меди
Рис. 1. Зависимость накопления флавоноидов от содержания меди в стеблях мужских растений можжевельника казацкого.
я
5
s
л
о g
О
3 2,5 2 1,5 1
0,5 0
J
3 г ,1
■ л - ■ i. -
кверц |изокверц |рутин 'нарингенин
1234567 0.028 10-3 мг/г- 1.2410-3 мг/г Градиент возрастания содержания меди
Рис. 2. Зависимость накопления флавоноидов от содержания меди в стеблях женских растений можжевельника казацкого.
12
S 10
я я
tS &
§ о
кверц изокверц рутин нарингенин
1234567 0.03 10-3 мг/г - 0.59-10-3 мг/г Градиент возрастения содержания меди
Рис. 4. Зависимость накопления флавоноидов от содержания меди в хвое женских растений можжевельника казацкого.
я
5
s
л
о §
О
■ кверц
■ изокверц
■ рутин
□ нарингенин
7
123456 0.09-10-3 мг/г -1.07-10-3 мг/г Градиент возрастания содержжания меди
Рис. 5. Зависимость накопления флавоноидов от содержания меди в шишкоягодах женских растений можжевельника казацкого.
Iкверц ■ изокверц |рутин нарингенин
N
I 2 ° 0
1 2 3 4 5 6 7 0.028 10-3 мг/г - 3.3-10-2 мг/г Градиент возрастания содержания меди
Рис. 3. Зависимость накопления флавоноидов от содержания меди в хвое мужских растений можжевельника казацкого.
80
70
60
S 50
о < 40
щ
н 30
20
10
0
В
хвоя I стебли
1234567 0.28 10 3 мг/г-3.3-10-3 мг/г Градиент возрастания меди
Рис. 6. Антиоксидантная активность флавоноидов в органах мужских растений можжевельника казацкого.
3
8
1
80 70 60 S 50 $ 40 $ 30 20 10 0
I
4
□ шишкоягоды
хвоя ■ стебли
1 2 3 4 5 6 7 0.03 10-3 мг/г- 1.2410-3 мг/г Градиент возрастания содержания меди
Рис. 7. Антиоксидантная активность флавоноидов в органах женских растений можжевельника казацкого.
При этом обнаружено, что в хвое мужских и женских растений накопление отдельных флавоноидов на фоне различного содержания меди в органах не связано с их общим антиоксидантным статусом, поскольку между этими показателями не выявлены значимые корреляционные зависимости. Иная картина наблюдается в других органах можжевельника казацкого — выявлены значимые корреляционные связи между накоплением флавоноидов и их АС в стеблях мужских растений (коэффициент корреляции - 0.89, р (уровень значимости) < 0.05) и в шишкоягодах женских растений (коэффициент корреляции - 0.89, р < 0.05). При этом возрастание общего содержания флавоноидов в шишкоягодах значимо взаимосвязано (коэффициент корреляции - 0.81, р < 0,05) с повышением содержания среди них негликозилированных форм.
Таким образом, у можжевельника казацкого имеются существования трех независимых систем контроля активности меди.
1. Корневой барьер, который примерно на один-два порядка снижает уровень меди в тканях (табл.)
2. В результате работы первого барьера содержание меди в оганах гомеостатируется, что, по видимому снимает необходимость накопления дополнительного количества хелаторов.
3. В шишкоягодах, в силу их наибольшей биологической значимости, возрастает роль флавоноидов с повышенными антиоксидантными функ-цияциями, что и отражается в увеличении доли негликозилированных форм этих веществ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Таланова В. В., Титов А. Ф., Боева Н. П. Влияние возрастающих концентраций тяжелых металлов на рост проростков ячменя и пшеницы // Физиология растений. 2001. Т. 48. №1. С. 119-123.
2. Mijovilovich A. et al., Complexation and Toxicity of Copper in Higher Plants. II. Different Mechanisms for Copper versus Cadmium Detoxification in the Copper-Sensitive Cadmium/Zinc Hyperaccumulator Thlaspi caerulescens (Ganges Ecotype) ./Plant Physiology, October 2009, Vol. 151. pp. 715-731.
3. Демидчкик В.В., Соколик А.И., Юрин В.М. Токсичность избытка меди и толерантность к нему растений.// Успехи современной биологии. 2001, Т.1. №5. C. 511-525.
4. Титов А. Ф., Таланова В. В., Казнина Н. М., Лайдинен Г. Ф. Устойчивость растений к тяжелым металлам. Монография. Институт биологии КарНЦ РАН. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2007. 172 с.
5. Maksymiec W. Effect of cooper on cellular processis in higher plant // Photosynthetica. 1997. V. 34. P. 321-342.
6. Бускунова Г. Г., Аминева А. А. Мониторинг загрязнения тяжелыми металлами почв Южного Урала и их влияние на лекарственные растения (на примере Achillea nobilis L.) // Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность. Материалы второй международной научно-практической конференции (3-5 июня 2008 г.) СПб.: ЛГУ имени А.С. Пушкина, 2008. С. 170-171.
7. Ковальский В. В. Геохимическая экология как основа системы биогеохимического районирования // Тр. Биогео-хим. лаб. АНСССР, 1978. Т.15. С. 3-21.
8. Шагиева Ю. А. Тяжелые металлы в почвах и растениях Башкирского Зауралья. Диссерт. на соиск. степ. канд. биол. наук. Уфа, Сибай, 2002. 180 с.
9. Меньщикова Е. Б. и др. Окислительный стресс. Проокси-данты и антиоксиданты. М.: Фирма «Слово», 2006. 556 с.
10. Тюкавкина Н. А. и др. Органическая химия. Спец. курс в 2 кн. Кн.2. М.: Дрофа, 2008. 592 с.
Поступила в редакцию 18.02.2013 г.
