CC BY
178
УДК 615.371
Избирательная протективность An/pD-мутантов Yersinia pestis
С. В. Дентовская1, С. А. Иванов1, П. Х. Копылов1, Р. З. Шайхутдинова1, М. Е. Платонов1, Т. И. Комбарова1, Т. В. Гапельченкова1, С. В. Балахонов2, А. П. Анисимов1* Тосударственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, 142279, Московская обл., Серпуховской район, Оболенск 2Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78 *E-mail: [email protected], [email protected] Поступила в редакцию 12.06.2014
РЕФЕРАТ Мутация по гену nlpD приводит, как показано недавно, к полной аттенуации Yersinia pestis, а nlpD-мутант превосходит вакцинный штамм EV76 по способности защищать мышей от гибели при заражении бубонной или легочной формой чумы [PLoS One. 2009. V. 4. № 9. e7023]. В представленной работе аналогичные AnlpD-мутанты сконструированы на основе других родительских штаммов Y. pestis, включая непатогенные для морских свинок и человека штаммы подвида microtus. Проведение сравнительной оценки подтвердило, что при подкожной иммунизации мышей AnlpD-мутанты индуцировали иммунный ответ, в 105 раз превосходящий по напряженности ответ на введение вакцинного штамма EV. В то же время варианты NlpD--бактерий практически не защищали морских свинок от подкожного заражения возбудителем чумы, уступая штамму EV по напряженности формируемого иммунитета в 106 раз. Обсуждаются возможные причины выявленного феномена.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА Yersinia pestis, AnlpD-мутант, избирательная протективность, чумная живая вакцина. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИИ - индекс иммунитета; ИФА - иммуноферментный анализ; КОЕ - колониеобра-зующая единица; ЛПС - липополисахарид; DCL (LD100) - абсолютная летальная доза (dosis certa letalis); ImD50 - иммунизирующая доза, предохраняющая от гибели 50% зараженных животных; LD50 - доза, летальная для 50% зараженных животных.
ВВЕДЕНИЕ
Живые вакцины стимулируют не только гуморальное, но и клеточное звено иммунитета, играющее ведущую роль в иммуногенезе чумы у некоторых видов животных [1—8]. Кроме того, живые вакцины, сконструированные на основе аттенуированных штаммов, содержат не только один-два иммунодоминант-ных антигена, а целый спектр сложных (комплексы белков с липополисахаридами (ЛПС) и т.п.), конфор-мационно-лабильных и минорных антигенов, что обеспечивает индукцию «гетерогенного» иммунного ответа после однократной иммунизации. Этот иммунный ответ способен защитить животных различных видов от патогенных бактерий даже с частично измененной антигенной специфичностью как при подкожном, так и аэрозольном заражении [3, 7 — 11]. Однако коммерческая живая чумная вакцина, созданная на основе штамма EV Yersinia pestis, способна независимо от путей введения вызывать различные по тяжести местные и системные побочные реакции у 5-29% лиц с нормальным иммунным статусом [1, 2,
12, 13]. Поэтому исследования, направленные на создание живых чумных вакцин на основе прецизионно аттенуированных штаммов Y. pestis, превосходящих используемый в коммерческой вакцине штамм EV по иммуногенности и обладающих сниженной реак-тогенностью, сохраняют свою актуальность до настоящего времени [2, 8, 14-19].
Потенциальные гены-мишени для аттенуации вирулентных штаммов отбирают с помощью произвольного мутагенеза индивидуально меченными транспозонами [20], с использованием методик обратной (реверсивной) вакцинологии [21-23] или исследуют аналоги генов других бактериальных патогенов, мутации в которых ведут к снижению вирулентности [24]. Так, в последнее десятилетие установлена взаимосвязь экспрессии генов семейства nlpD/lppB (novel lipoprotein D /lipoprotein B) с выживанием некоторых грамотрицательных бактерий в стрессовых условиях и их патогенностью [18, 25, 26]. Показано [14], что липопротеин NlpD необходим и для вирулентности возбудителя чумы Y. pestis при под-
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 1. Характеристика использованных в работе штаммов микроорганизмов
Штамм Характеристика Источник получения и/ или ссылка*
Y. pestis
EV линии НИИЭГ pFra+pCad+pPst+Apgm вакцинный штамм (subsp. pestis bv. orientalis) ГКПМ-Оболенск
231 pFra+pCad+pPst+Pgm+ дикого типа (subsp. pestis bv. antiqua) ГКПМ-Оболенск
231 AnlpD AnlpD вариант 231 НИ
И-3455 pFra+pCad+pPst+Pgm+ дикого типа (subsp. microtus, bv. altaica)** МЖК ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ
^3455AnlpD AnlpD вариант И-3455 НИ
И-2359 pFra+pCad+pPst+Pgm+ дикого типа (subsp. microtus, bv. altaica) МЖК ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ
^2359AnlpD AnlpD вариант И-2359 НИ
E. coli
DH5a Apir F , X , recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rK ,mK+), supE44, recA1 [27]
S17-1 Apir thi pro hsdR- hsdM+ recA RP4 2-Tc::Mu-Km::Tn7(TpR SmR PmS) [28]
* ГКПМ-Оболенск - Государственная коллекция патогенных микроорганизмов и клеточных культур на базе «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора; МЖК Ир-кутскНИПЧИ Сибири и ДВ - музей живых культур ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора.
**Использованы наименования подвидов и биоваров У. pestis, предложенные в [29].
кожном и аэрогенном способе введения. Более того, при иммунизации мышей 105 КОЕ AnlpD-мутанта штамма Y. pestis Kimberley53 с последующим введением 105 LD50 вирулентного штамма Kimberley53 (1 LD50 = 1-3 КОЕ) выжило 100% мышей, а вакцинный штамм EV76 защитил от гибели только 10% животных.
Цель настоящей работы состояла в конструировании AnlpD-мутантов на основе других родительских штаммов Y. pestis, включая непатогенные для морских свинок и человека штаммы подвида microtus, и оценке их иммуногенности в отношении мышей и морских свинок.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактериальные штаммы, использованные в работе, и их характеристика представлены в табл. 1. Штаммы Y. pestis и Escherichia coli культивировали на жидких или плотных питательных средах Хоттингера (различные серии лабораторного приготовления ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии) и LB (триптон - 1%, дрожжевой экстракт - 0.5%, натрий хлористый - 1%), pH 7.2. Селекцию клеток, содержащих рекомбинантные плазмиды, вели на средах с добавлением антибиотиков: ампициллин -100 мкг/мл, хлорамфеникол - 10 мкг/мл, полимиксин B - 100 мкг/мл. Штаммы Y. pestis для иммунизации и заражения животных выращивали при температуре 28оС в течение 48 ч.
Мутагенез
Конструирование мутантных штаммов Y. pestis проводили путем гомологичной рекомбинации с помощью рекомбинантной плазмиды pCVD442-AnlpD::cat на основе суицидного вектора pCVD442 [30], в которой часть клонированной кодирующей последовательности гена nlpD (нуклеотиды 112-318) заменили геном cat из плазмиды pKD3 [31] (рисунок).
Плазмиду pCVD442-AnlpD::cat из донорного штамма E. coli S17-1 Apir переносили в штаммы-реципиенты Y. pestis (231, И-3455 и И-2359) методом конъюгации. Элиминацию суицидного вектора и селективный отбор клонов Y. pestis осуществляли в присутствии 5% сахарозы и хлорамфеникола [30]. Ген устойчивости к хлорамфениколу удаляли с помощью плазмиды pCP20 [31] (рисунок). Плазмиду pCP20 удаляли путем культивирования бактерий при температуре 40оС в среде, содержащей 2.5 мМ хлорида кальция, в течение ночи. Отбирали клоны, потерявшие устойчивость как к ампициллину (100 мкг/мл), так и к хлорамфениколу (20 мкг/мл). Правильность рекомбинации контролировали методом полимеразной цепной реакции.
Бактериоскопия и бактериологические исследования
Бактериоскопическое исследование, скорость роста и лизис культур чумным бактериофагом Л-413С, а также фибринолитическую и плазмокоагулазную
Интактный ген nlpD surE pcm nlpD
rpoS
Замена части гена nlpD на ген cat, фланкированный локусами FRT surE pcm FRT cat FRT nlpD rpoS
Удаление гена cat surE pcm FRJ nlpD
rpo S
Схема конструирования An/pD-мутантов Y. pestis. Детальное описание стратегии приведено в [30, 31]
активности, способность к пигментосорбции и плаз-мидный профиль определяли согласно [14, 32-34].
Иммунохимические исследования
Титры F1, продуцируемого испытуемыми штаммами У. pestis, определяли в реакции непрямой гемагглю-тинации согласно [35].
Титры антител к антигенам F1 и LcrV в сыворотках животных, иммунизированных для оценки напряженности иммунитета (см. ниже), определяли с помощью непрямого варианта ИФА на 21-е сут после подкожного введения испытуемых и контрольного штаммов. Титры антител определяли индивидуально у пяти животных, произвольно отобранных в каждой группе из 40, иммунизированных одним из опытных или контрольным штаммом, с последующим определением среднего титра в группе. За величину титра принимали наибольшее разведение специфической антисыворотки, которому соответствовала оптическая плотность растворов субстрата при длине волны 492 нм, превосходящая на 0.1 значение контроля в этом же разведении [36]. На практике вычисляли разность контрольных и опытных значений А492 и строили графики зависимости полученной величины от соответствующих разведений антисывороток, которые аппроксимировали с использованием полиномной функции.
Определение безвредности штаммов У. pestis Безвредность испытуемых штаммов У. pestis для мышей линии BALB/c, а также морских свинок оценивали по методикам, приведенным в [35]. Культуры исследуемых штаммов чумного микроба вводили подкожно мышам массой 18-20 г в дозе 102, 103, 105 и 107 КОЕ (по 10 мышей на каждую дозу) и пяти морским свинкам массой 180-200 г по 1.5 х 1010 КОЕ.
Оценку иммуногенной активности кандидатных вакцинных препаратов проводили в соответствии
с Методическими указаниями [35]. Иммуногенность сконструированных штаммов оценивали по величине ImD50. Морских свинок (10 животных на группу) иммунизировали подкожно в область верхней трети правого бедра двухсуточной агаровой культурой исследуемого штамма в дозах 4 х 10, 2 х 102, 1 х 103 и 5 х 103 КОЕ в объеме 0.5 мл. Мышей линии BALB/c (10 животных на группу) также иммунизировали подкожно дозами 2 х 102, 1 х 103, 5 х 103 и 2.5 х 104 КОЕ в объеме 0.2 мл. Животных заражали на 21-е сут после иммунизации подкожно в область верхней трети левого бедра в дозе, соответствующей 200 DCL (LD ) вирулентного штамма чумного микроба (в наших опытах 1 DCL соответствовала 10 КОЕ для мышей и 100 КОЕ для морских свинок). Наблюдение за зараженными животными продолжали в течение 20 сут. Погибших животных вскрывали и исследовали бактериологическим методом.
Напряженность иммунитета, т.е. способность вакцинного препарата предохранять животное от гибели на 21-е сут после иммунизации при заражении массивными дозами вирулентной культуры, определяли по формуле:
ИИ =
LD5
LD5
(1)
где ИИ - индекс иммунитета; LD50имм - LD50 для животных, иммунизированных исследуемым препаратом, КОЕ; LD„ - LD„ для интактных животных,
' ' 50инт 50 ^ '
КОЕ [35].
Для определения напряженности иммунитета животных иммунизировали подкожно двухсуточными агаровыми культурами испытуемых и контрольного штаммов (по 40 морских свинок и 40 мышей на один штамм): морских свинок в дозе 5 х 103 КОЕ в объеме 0.5 мл, мышей линии BALB/c - 104 КОЕ в объеме 0.2 мл. На 21-е сут после иммунизации животных заражали культурой вирулентного штамма У. pestis 231 в четырех дозах: 102, 104, 106, 108 КОЕ (морских свинок в объеме 0.5 мл, мышей - в объеме 0.2 мл). Одновременно заражали интактных (контрольных) животных в дозах 1, 5, 25 и 125 КОЕ в том же объеме, как и иммунизированных. Наблюдения за зараженными животными проводили в течение 20 сут. Погибших животных вскрывали и исследовали бактериологическим методом.
Статистические методы
Величины ImD50 мутантных по гену nlpD штаммов и LD50 вирулентного штамма, полученную на иммунизированных и интактных животных, а также доверительные интервалы (для вероятности 95%) определяли по методу КагЬег [37].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Конструирование и характеристика NlpD--вариантов вирулентных штаммов Y. pestis Сайт-направленным мутагенезом гена nlpD в штаммах Y. pestis subsp. pestis 231 и двух штаммах подвида microtus bv. altaica И-3455 и И-2359 с последующим удалением маркера устойчивости к хлорамфениколу получили мутанты 23lAnlpD, ^2359AnlpD и ^3455AnlpD без генов антибиоти-коустойчивости.
При бактериоскопическом исследовании окрашенных по Граму мазков, приготовленных из штаммов 23lAnlpD, И-2359AnlpD и ^3455AnlpD, установили, что культивирование мутантных штаммов при температуре 28оС вело к формированию неразделенных цепей, включающих в среднем 8.2 ± 3.6 клетки/цепь, в то время как исходные культуры Y. pestis 231, И-2359 и И-3455 формировали агрегаты из отдельных клеток. Повышение температуры культивирования до 37оС снижало число клеток AnlpD-мутантов в цепи до 4 ± 2.5. Морфология клеток и клеточных скоплений исходных штаммов не зависела от температуры культивирования. Скорость роста Y. pestis 23lAnlpD была такой же, как у исходного штамма при 28 и 37оС.
Сконструированные AnlpD-мутанты лизирова-лись чумным бактериофагом Л-413С. Содержание капсульного антигена F1 в клетках мутантов по данным реакции непрямой гемагглютинации в 4-16 раз превышало аналогичный показатель, полученный на культуре вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, выращенной в аналогичных условиях (1-4 мкг/109 КОЕ и 0.25 мкг/109 КОЕ соответственно). Эти AnlpD-мутанты не уступали штамму EV по фи-бринолитической и плазмокоагулазной активностям.
Как и вакцинный штамм, они содержали три плаз-миды pFra, pCad и pPst, но отличались от У. pestis EV способностью к пигментосорбции.
Определение безвредности штаммов
Все дефектные по гену nlpD штаммы У. pestis: 23lДnlpD, И-3455ДnlpD и И-2359ДnlpD, так же как и вакцинный штамм У. pestis EV, были ави-рулентны при подкожном введении мышам линии BALB/c (100% выживших при заражении дозой 102, 103, 105 и 107 КОЕ) и морским свинкам (100% выживших при дозе 1.5 х 1010 КОЕ). Наблюдение проводили в течение 50 сут.
Антительный ответ к кандидатам в вакцинные штаммы
Образование антител к F1 и LcrV У. pestis в крови мышей линии BALB/c определяли на 21-е сут после подкожной иммунизации исследуемыми штаммами У. pestis в дозе 104 КОЕ (табл. 2). Средние титры антител против F1 и LcrV в сыворотках мышей после вакцинации культурами У. pestis 231 ДnlpD и И-3455ДnlpD превышали показатели, полученные для У. pestis И-2359ДnlpD и вакцинного штамма EV ^ < 0.05).
Титры анти^1- и анти^сгУ'-антител в крови вакцинированных и контрольных морских свинок определяли на 21-е сут после подкожной иммунизации исследуемыми штаммами У. pestis в дозе 5 х 104 КОЕ (табл. 2). По нашим данным средние титры антител против F1 и LcrV в сыворотках морских свинок после введения вакцинного штамма У. pestis EV на два-три порядка превышали показатели для штаммов 23lДnlpD, И-3455Дп^ и И-2359Дп^ ^ < 0.05). Антительный ответ к F1 и LcrV У. pestis у морских свинок после введения вакцинного и сконструирован-
Таблица 2. Антительный ответ на введение штаммов Y. pestis по результатам ИФА
Средние титры IgG (обратные значения)
Штамм 231 AnlpD ^3455AnlpD ^2359AnlpD EV НИИЭГ
Морские свинки
Антиген
F1 4435 ± 1625 2650 ± 1045 130 ± 80 127630 ± 52830
LcrV 1555 ± 840 710 ± 260 920 ± 630 94390 ± 49290
Мыши
Антиген
F1 942560 ± 16620 9140 ± 1590 550 ± 95 310 ± 140
LcrV 2465 ± 970 6715 ± 1620 1580 ± 850 235 ± 85
Таблица 3. Показатели иммуногенности и напряженности иммунитета у мышей линии BALB/c, вакцинированных Дп/рО-вариантами штаммов У. pesfis 231, И-3455 и И-2359
Иммунизирующий штамм Y. pestis ImD КОЕ 50' Напряженность иммунитета
LD50 при заражении штампом Y. pestis 231, КОЕ ИИ
231 AnlpD 1.3 x 102 (5.3 x 10 ^ 3.4 x 102) 3.9 x 108 (слишком велик) 7.1 x 107
^3455AnlpD 2.9 x 102 (1.2 x 102 ^ 7.5 x 102) 2.5 x 107 (1 x 107 ^ 3.9 x 108) 4.5 x 107
^2359AnlpD 1.1 x 104 (4.4 x 103 ^ 2.8 x 104) 2.5 x 103 (6.3 x 102 ^ 3.9 x 103) 4.5 x 102
EV НИИЭГ 7.5 x 103 (2.4 x 103 ^ 5.9 x 104) 1.0 x 103 (2.5 x 102 ^ 3.9 x 103) 1.8 x 102
Таблица 4. Показатели иммуногенности и напряженности иммунитета для морских свинок, вакцинированных Дп/рО-вариантами штаммов У. pesfis 231, И-3455 и И-2359
Иммунизирующий штамм Y. pestis Напряженность иммунитета
1ШБ50, КОЕ 50' LD50, при заражении штаммом Y. pestis 231, КОЕ ИИ
231 AnlpD 9.1 х 103 (слишком велик) 63 (1.6 x 10 ^ 2.5 x 102) 3.7
И-3455Ди/рО 4.3 х 103 (слишком велик) 158 (4.0 x 10 ^ 6.3 x 102) 9.3
И-2359AnlpD 1.1 х 105 (слишком велик) 10 (3 ^ 4.0 x 10) 0.59
EV НИИЭГ 65 (1.6 х 10 ^ 2.6 х 102) 1.6 x 108 (слишком велик) 9.4 x 106
ных нами штаммов варьировал, у мышей ответ был более однородным.
При этом уровень циркулирующих анти^1 и анти^сгУ в крови мышей, иммунизированных кандидатами в вакцинные штаммы У. pestis 231 ДnlpD и И-3455ДnlpD, значительно превышал показатели для морских свинок, иммунизированных теми же штаммами.
В контрольных группах после введения изотонического раствора хлорида натрия антител к F1 и LcrV У. pestis не обнаружили.
Протективная эффективность кандидатов в вакцинные штаммы
Показатели иммуногенности и напряженности иммунитета у однократно иммунизированных мышей линии BALB/c представлены в табл. 3. У лабораторных животных данного вида IшD50 штаммов У. pestis 23lДnlpD и И-3455ДnlpD была в 58 и 26 раз ниже, чем у вакцинного штамма У. pestis EV
соответственно, а у штамма И-2359ДnlpD - выше в 1.5 раза. Индекс иммунитета штаммов У. pestis 23lДnlpD и И-3455ДnlpD был на пять порядков выше, чем у вакцинного штамма У. pestis EV, а штамма И-2359ДnlpD - в 2.5 раза.
Обратную картину наблюдали при использовании морских свинок в качестве модели для оценки иммуногенности и напряженности иммунитета (табл. 4). IшD50 вакцинного штамма EV ниже, чем у штаммов У. pestis 23lДnlpD, И-3455ДnlpD и И-2359ДnlpD в 140, 66 и 1692 раза соответственно. Индекс иммунитета вакцинного штамма EV был на шесть порядков выше, чем у штаммов 23lДnlpD и И-3455ДnlpD, и на семь порядков выше, чем у штамма И-2359ДnlpD.
ОБСУЖДЕНИЕ
Для проверки универсальности сочетания аттенуа-ции и высокой иммуногенности у ДnlpD-вариантов У. pestis проводили сайт-направленный мутаге-
нез трех штаммов возбудителя чумы дикого типа: один - подвида pestis bv. antiqua 231, два штамма подвида microtus bv. altaica И-3455 и И-2359. Известно, что штаммы подвида microtus, к которому принадлежит биовар altaica [29], вирулентны для мышей, но авирулентны для морских свинок, кроликов и человека [38, 39]. Предполагают [40], что штаммы подвида microtus, обладающие всеми протективными антигенами и авирулентные для людей, могут служить основой для создания живых чумных вакцин. Кроме того, один из использованных нами штаммов bv. altaica И-3455 продуцирует LcrV с повышенной иммуногенной/протек-тивной активностью (за счет замены триптофана в позиции 113 на глицин) [41].
В Российской Федерации все испытания аттену-ированных штаммов Y. pestis, перспективных в качестве вакцинных, проводят, сравнивая их с эталонным вакцинным штаммом чумного микроба EV линии НИИЭГ. Согласно [35] «штамм, предлагаемый в качестве вакцинного, должен соответствовать или превосходить эталонный вакцинный по показателю иммуногенности, соответствовать контрольному штамму по показателям безвредности и реактоген-ности или быть более безопасным, а по некоторым несущественным характеристикам, которые характеризуют его как представителя вида или разновидности Y. pestis, могут отличаться от него». «Несущественные характеристики» подразумевают, что «исследуемый штамм - кандидат в вакцинные должен:
- лизироваться чумным бактериофагом Л-413С;
- быть типичным по культурально-морфологиче-ским свойствам;
- титр F1 испытуемого штамма не должен быть меньше аналогичного показателя, полученного с культурой контрольного штамма Y. pestis EV, выращенного в аналогичных условиях;
- доля кальцийнезависимых мутантов в популяции культур чумного микроба, пропассированных через организм лабораторных животных и не подвергавшихся длительному хранению или каким-либо физическим воздействием, не должна превышать 0.3%;
- не должен уступать контрольному штамму по фибринолизин-плазмокоагулазной активности;
- испытуемый и контрольные штаммы не должны обладать способностью к пигментосорбции;
- испытуемые вакцинные штаммы подобно эталонному штамму EV на электрофореграмме должны иметь три полосы плазмидной ДНК, соответствующие pFra (60 MD), pCad (47 MD) и pPst (6 MD)». Первая из плазмид кодирует основной иммуноген Y. pestis - капсульный антиген F1. Вторая - систему,
позволяющую внеклеточно расположенным бактериям обезвреживать клетки, участвующие в иммунном ответе хозяина, - вирулон Yop и входящий в эту систему второй иммунодоминантный антиген LcrV, а третья - активатор плазминогена, ответственный за диссеминацию чумного микроба в тканях хозяина [13].
По большинству несущественных показателей сконструированные нами ДnlpD-штаммы У. pestis соответствовали требованиям к вакцинным штаммам чумного микроба [35]. Они лизировались бактериофагом Л-413С, продукция F1 в клетках мутантов была в 2-4 раза больше, чем в клетках штамма EV, фи-бринолитическая и плазмокоагулазная активности у всех штаммов были на одном уровне, все штаммы содержали полный набор из трех классических плаз-мид чумного микроба.
Культурально-морфологические свойства ДnlpD-мутантов штаммов 231, И-3455 и И-2359, рост в виде цепочек, отличающий их от бактерий дикого типа и вакцинного штамма EV, совпали с аналогичными данными [14], свидетельствующими о том, что липо-протеин NlpD возбудителя чумы играет важную роль в процессе клеточного деления. Возможно, именно особенности клеточного деления являются основной причиной аттенуации ДnlpD-мутантов.
Способность к пигментосорбции сохранилась у сконструированных штаммов на уровне штаммов дикого типа, так как их аттенуация была вызвана не делецией локуса рдт, а удалением структурного гена nlpD.
Что же касается соответствия ДnlpD-мутантов основным критериям отбора вакцинных штаммов У. pestis, то по степени аттенуации (безвредности) для мышей и морских свинок штаммы NlpD- не уступали вакцинному штамму EV. Со вторым критерием, иммуногенностью, все оказалось не столь однозначно. Этот показатель оценивали на двух видах животных в трех независимых тестах: определяли титры антител к F1 и LcrV, рассчитывали иммунизирующие дозы, предохранявшие от гибели 50% зараженных животных, и индексы иммунитета.
Хотя уровни продуцируемых антител лишь частично коррелируют с протективной эффективностью чумных вакцин, гуморальный иммунитет играет важную роль в защите против чумы [42]. Полученные данные свидетельствуют о развитии эффективного иммунного ответа у мышей после введения аттенуи-рованных культур чумного микроба, причем ДnlpD-штаммы статистически значимо превосходили по этому показателю вакцинный штамм EV. В опытах на морских свинках картина была обратной - вакцинный штамм превосходил ДnlpD-мутанты по способности индуцировать антителогенез.
На мышиной модели штаммы Y. pestis 231AnlpD и ^3455AnlpD статистически значимо превосходили штамм EV по величинам ImD50 и особенно ИИ. В опытах же на морских свинках экспериментальные штаммы уступали вакцинному, причем напряженность иммунитета у животных, иммунизированных AnlpD-мутантами, стремилась к 1, т.е. практически не отличалась от этого показателя у неиммунных животных.
Результаты наших экспериментов подтверждают данные других исследователей о том, что реакция различных видов животных на один и тот же антиген/вакцинный препарат неодинакова [12, 43-48]. Отличия в протективности NlpD'-вариантов штаммов Y. pestis в отношении морских свинок и мышей, вероятно, связаны с особенностями иммуногенеза у этих биологических моделей [2]. Отсутствие про-тективной эффективности AnlpD-мутантов в отношении морских свинок может иметь, как минимум, два возможных объяснения.
Во-первых, вероятно, аттенуация в результате мутации по гену nlpD приводит к чрезмерному снижению остаточной вирулентности [12, 49], вследствие чего подобные мутанты не способны размножаться в организме морских свинок в течение времени, достаточного для формирования иммунитета.
Во-вторых, нельзя исключить, что липопроте-ин NlpD возбудителя чумы - это именно тот водо-
нерастворимый «остаточный» антиген R (residue) или один из его составных компонентов, который обладает высокой протективной активностью в отношении морских свинок, индуцируя длительную защиту от чумы [50-52]. Следовательно, его отсутствие в препарате, использованном для иммунизации, может быть основной причиной слабой протективности мутантов AnlpD.
В настоящее время проводятся эксперименты по проверке этих двух гипотез.
ВЫВОДЫ
Завершая обсуждение полученных данных, следует констатировать, что AnlpD-мутанты без дополнительной модификации, повышающей их иммуноген-ность для морских свинок, не перспективны в качестве кандидатов в живые чумные вакцины из-за избирательности иммуногенности в отношении разных видов животных. •
Работа выполнена в лаборатории микробиологии чумы Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии по государственным контрактам № 40-Д от 30.05.2012 г. и № 34-Д от 08.08.2013 г. в рамках ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014 гг.)».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. Иммунология чумы. Саратов: Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», 1992. 172 с.
2. Dentovskaya S.V., Kopylov P.Kh., Ivanov S.A., Ageev S.A., Anisimov A.P. // Mol. Genet. Microbiol. Virol. 2013. V. 28.
Р. 87-98.
3. Feodorova V.A., Corbel M.J. // Expert Rev. Vaccines. 2009. V. 8. Р. 1721-1738.
4. Firstova V.V., Tyurin E.A., Kravchenko T.B., Zyrina E.V., Biketov S.F., Dyatlov I.A. // Adv. Exp. Med. Biol. 2012. V. 954. P. 173-177.
5. Li B., Du C., Zhou L., Bi Y., Wang X., Wen L., Guo Z., Song Z., Yang R. // Clin. Vaccine Immunol. 2012. V. 19. № 2. P. 228-234.
6. Smiley S.T. // Adv. Exp. Med. Biol. 2007. V. 603. P. 376-386.
7. Smiley S.T. // Immunol. Rev. 2008. V. 225. Р. 256-271.
8. Sun W., Roland K.L., Curtiss R. 3rd. // J. Infect. Dev. Ctries. 2011. V. 5. № 9. P. 614-627.
9. Анисимов А.П. Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость капсулы Yersinia pestis. Саратов: Российский противочумный институт «Микроб»; Оболенск: Государственный научный центр прикладной микробиологии, 1999.
10. Коробкова Е.И. Живая противочумная вакцина. М.: Мед-гиз, 1956. 208 с.
11. Girard G. // Biol. Med. (Paris) 1963. V. 52. Р. 631-731.
12. Meyer K.F., Smith G., Foster L., Marshall J.D., Jr., Cavanaugh D.C. // J. Infect. Dis. 1974. V. 129 (Suppl.). Р. 85-120.
13. Perry R.D., Fetherston J.D. // Clin. Microbiol. Rev. 1997. V. 10. P. 35-66.
14. Tidhar A., Flashner Y., Cohen S., Levi Y., Zauberman A., Gur
D., Aftallon M., Elhanany E., Zvi A., Shafferman A., Mamroud
E. // PLoS One. 2009. V. 4. e7023.
15. Braciale V.L., Nash M., Sinha N., Zudina I.V., Motin V.L. // Correlates of immunity elicited by live Yersinia pestis vaccine. National Institute of Allergy and Infectious Diseases. NIH. V. 1. Frontiers Res. / Ed. Vassil St. Georgiev. Totowa, N.J.: Humana Press Inc., 2007. P. 473-480.
16. Derbise A., Cerdà Marin A., Ave P., Blisnick T., Huerre M., Carniel E., Demeure C.E. // PLoS Negl. Trop Dis. 2012. V. 6. № 2. e1528.
17. Rosenzweig J.A., Chopra A.K. // Expert Rev. Vaccines. 2012. V. 11. № 6. P. 659-661.
18. Sha J., Agar S.L., Baze W.B., Olano J.P., Fadl A.A., Erova T.E., Wang S., Foltz S.M., Suarez G., Motin V.L., et al. // Infect. Immun. 2008. V. 76. № 4. P. 1390-1409.
19. Zhang X., Qi Z., Du Z., Bi Y., Zhang Q., Tan Y., Yang H., Xin Y., Yang R., Wang X. // Vaccine. 2013. V. 31. № 22. P. 2539-2542.
20. Flashner Y., Mamroud E., Tidhar A., Ber R., Aftalion M., Gur D., Lazar S., Zvi A., Bino T., Ariel N., et al. // Infect. Immun. 2004. V. 72. P. 908-915.
21. Garbom S., Forsberg A., Wolf-Watz H., Kihlberg B.M. // Infect. Immun. 2004. V. 72. P. 1333-1340.
22. Rappuoli R. // Curr. Opin. Microbiol. 2000. V. 3. P. 445-450.
23. Sun W., Roland K.L., Branger C.G., Kuang X., Curtiss R. // PLoS One. 2009. V. 4. e6720.
24. Oyston P.C., Mellado-Sanchez G., Pasetti M.F., Nataro J.P., Titball R.W., Atkins H.S. // Microb. Pathog. 2010. V. 48. № 5. P. 191-195.
25. Padmalayam I., Kelly T., Baumstark B., Massung R. // Infect. Immun. 2000. V. 68. № 9. P. 4972-4979.
26. Sha J., Kirtley M.L., van Lier C.J., Wang S., Erova T.E., Kozlova E.V., Cao A., Cong Y., Fitts E.C., Rosenzweig J.A., Chopra A.K. // Infect. Immun. 2013. V. 81. № 3. P. 815-828.
27. Woodcock D., Crowther P., Doherty J., Jefferson S., DeCruz E., Noyer-Weidner M., Smith S., Michael M., Graham M. // Nucl. Acids Res. 1989. V. 17. P. 3469-3478.
28. Simon R., Priefer U., Pulher A. // Biotechnology. 1983. V. 1. P. 784-791.
29. Platonov M.E., Evseeva V.V., Dentovskaya S.V., Anisimov A.P. // Mol. Genet. Microbiol. Virol. 2013. V. 28. P. 41-45.
30. Donnenberg M.S., Kaper J.B. // Infect. Immun. 1991. V. 59. P. 4310-4317.
31. Datsenko K., Wanner B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 6641-6645.
32. Filippov A.A., Solodovnikov N.S., Kookleva L.M., Protsenko O.A. // FEMS Microbiol Lett. 1990. V. 55. P. 5-48.
33. Filippov A.A., Sergueev K.V., He Y., Huang X.Z., Gnade B.T., Mueller A.J., Fernandez-Prada C.M., Nikolich M.P. // PLoS One. 2011. V. 6. e25486.
34. Bahmanyar M., Cavanaugh D.C. Plague manual. Geneva: WHO, 1976. 78 p.
35. Основные требования отбора новых вакцинных штаммов чумного микроба. Методические указания. МУ 3.3.1.111302 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 02.03.2002). 69 с.
36. Qiu Y., Liu Y., Qi Z., Wong W., Kou Z., Zhang Q., Liu G., Yang X., Xin Y., Li C., et al. // Scand. J. Immunol. 2010. V. 72. Р. 425-433.
37. Finney D.J. Statistical method in biological assay. 3rd еd. London, England: Charles Griffin, 1978.
38. Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific diversity of Yersinia pestis // Clin. Microbiol. Rev. 2004. V. 17. P. 434-464.
39. Song Y., Tong Z., Wang J., Wang L., Guo Z., Han Y., Zhang J., Pei D., Zhou D., Qin H., et al. // DNA Res. 2004. V. 11. P. 179-197.
40. Zhou D., Tong Z., Song Y., Han Y., Pei D., Pang X., Zhai J., Li M., Cui B., Qi Z., et al. // J. Bacteriol. 2004. V. 186. P. 5147-5152.
41. Копылов П.Х., Бахтеева И.В., Анисимов А.П., Дентовская С.В., Иванов С.А., Киселева Н.В., Левчук В.П., Панферцев Е.А., Платонов М.Е., Светоч Т.Э. и др. Патент на изобретение RUS 2439155 C1, РФ, МПК C12N15/10, C07H21/00, C12N15/70, C12N1/21, C12P21/00, C12R1/19, 2010.
42. Bashaw J., Norris S., Weeks S., Trevino S., Adamovicz J.J., Welkos S. // Clin. Vaccine Immunol. 2007. V. 14. P. 605-616.
43. Бывалов А.А., Паутов В.Н., Чичерин Ю.П., Лебединский В.А., Евстигнеев В.И. // Журн. микробиол. 1984. № 4. С. 74-76.
44. Burrows T.W. // Nature. 1957. V. 179. Р. 1246-1247.
45. Hallett A.F., Issacson M., Meyer K.F. // Infect. Immun. 1973. V. 8. Р. 876-881.
46. Jones S.M., Griffin K.F., Hodgson I., Williamson E.D. // Vaccine. 2003. V. 21. Р. 3912-3918.
47. von Metz E., Eisler D.M., Hottle G.A. // Appl. Microbiol. 1971. V. 22. Р. 84-88.
48. Welkos S., Pitt M.L.M., Martinez M., Friedlander A., Vogel P., Tammariello R. // Vaccine. 2002. V. 20. Р. 2206-2214.
49. Miranda K.L., Poester F.P., Minharro S., Dorneles E.M., Stynen A.P., Lage A.P. // Vaccine. 2013. V. 31. P. 3014-3018.
50. Brubaker R.R. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1972. V. 57. Р. 111-158.
51. Meyer K.F. // J. Immunol. 1950. V. 64. Р. 139-163.
52. Schütze H. // Br. J. Exp. Pathol. 1939. V. 19. Р. 293-298.
