CC BY
101
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 4, с. 42-57
УДК 636.1/.2:599.723: 577.2::575.174.015.3 doi: 10.15389/agrobiology.2014.4.42rus
ISSR-PCR МАРКЕРЫ И МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ В ГЕНОМЕ ДОМАШНЕЙ ЛОШАДИ Equus caballus
Н.В. БАРДУКОВ1, А.В. ФЕОФИЛОВ1, Т.Т. ГЛАЗКО1, 2, В.И. ГЛАЗКО1, 2
Закономерности и причины различий в полиморфизме отдельных микросателлитов, как и видоспецифичность такой изменчивости до сих пор остаются недостаточно исследованными. Тест-системы, разработанные Международной ассоциацией по генетике животных (International Society of Animal Genetics) для генетической паспортизации сельскохозяйственных животных, оценки межпородных взаимосвязей, консолидированности пород, включают небольшое число маркеров. Поэтому для животных сельскохозяйственных видов более простым и эффективным методом полилокусного генотипирования служит использование фрагментов микросателлитных локусов в качестве ПЦР-праймеров. Нами предложен метод выявления в секвенированных последовательностях позиционирования инвертированных повторов участков микросателлитов. Были исследованы алтайская порода (п = 96), рысистые породы (п = 48), карачаевская порода (п = 34) домашней лошади Equus caballus. Проанализированы нуклеотидные последовательности для фрагментов (ожидаемая длина/фактиче-ская длина) разной локализации: 1250-1350/1326 п.н. (17-я хромосома), 1250-1350/1302 п.н. (2-я хромосома), 1250-350/1296 п.н. (Х-хромосома), 1250-1350/1287 п.н. (20-я хромосома), 980/986 п.н. (23-я хромосома), 800-900/900 п.н. (24-я хромосома), 800-900/876 п.н. (Х-хро-мосома), 800-900/871 п.н. (18-я хромосома), 800-900/857 п.н. (3-я хромосома), 800-900/832 п.н. (6-я хромосома), 800-900/823 п.н. (19-я хромосома), 740/739 п.н. (16-я хромосома), 580/585 п.н. (1-я хромосома), 550/637 п.н. (Х-хромосома), 550/572 п.н. (10-я хромосома), 500/494 п.н. (1-я хромосома), 490/489 п.н. (28-я хромосома), 380/378 п.н. (11-я хромосома), 380/377 п.н. (21-я хромосома), 360 (370)/364 п.н. (5-я хромосома), 310/309 п.н. (5-я хромосома). Рассчитан индекс PIC (polymorphic information content). Выявленные в геноме домашней лошади фрагменты ДНК (99 участков), фланкированные инвертированным повтором (GA)9C, содержали участки гомологии к мобильным генетическим элементам. При их сопоставлении с продуктами амплификации, полученными в полимеразной цепной реакции у представителей ряда пород лошадей с использованием в качестве праймера последовательности (GA)9C, выделены близкие по размеру консервативные и полиморфные фрагменты ДНК. Оказалось, что фрагменты ДНК, полиморфные у разных животных, в большинстве случаев несут последовательности, гомологичные фрагментам ретротранспозонов (в частности, ERV III), тогда как консервативные гомологичны участкам ДНК транспозонов. В исследованных фрагментах геномной ДНК лошади, фланкированных инвертированным повтором (GA)9C, наблюдается увеличенная плотность нуклеотидных последовательностей, потенциально предрасположенных к формированию G4 квадруплексов, что, по-видимому, может быть ассоциировано с повышенной активностью рекомбинаций в этих участках. Полученные данные позволяют предполагать связь между полиморфизмом фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов, и мобильностью ретротранспозонов.
Ключевые слова: ISSR-PCR, анонимные ДНК-маркеры, Equus caballus, ДНК-транс-позоны, ретротранспозоны, неканонические структуры ДНК.
Генотипирование по микросателлитным локусам получило широкое распространение в популяционной генетике, особенно при решении таких актуальных задач, как контроль генетической структуры сельскохозяйственных видов, выявление сорто- и породоспецифичных особенностей их генофоцдов (1). Международной ассоциацией по генетике животных (International Society of Animal Genetics — ISAG) разработаны тестсистемы для разных сельскохозяйственных видов, рекомендованные при генетической паспортизации животных, оценке межпородных взаимосвязей и консолидированности пород (http://www.frontiersin.org). В то же время закономерности и причины различий в полиморфизме отдельных микросателлитов, видоспецифичность такой изменчивости до сих пор остаются недостаточно исследованными. Кроме того, предложенные тест-системы (http://www.frontiersin.org) включают не более двух десятков маркеров. В этой связи именно для животных сельскохозяйственных видов более простым и эффективным методом полилокусного генотипирования
42
признается использование фрагментов микросателлитных локусов в качестве ПЦР -праймеров, позволяющее за одну-две постановки реакции оценивать полиморфизм нескольких десятков фрагментов ДНК, фланкированных инвертированным повтором такого праймера (inter-simple sequence repeat PCR — ISSR-PCR маркеры) (2).
Следует отметить, что применение в качестве одного праймера в ПЦР консенсусного фрагмента высокоповторенных последовательных ДНК успешно используется для геномного сканирования и выявления полиморфизма различных геномных районов у человека (3). Обнаружена достаточно высокая частота инвертированных повторов таких последовательностей на небольших расстояниях, что позволяет в одной ПЦР с одним праймером выявлять полиморфные участки ДНК (4). В геноме домашней лошади около 36 % нуклеотидов входят в диспергированные повторы; микросателлиты занимают около 2 % генома (5). Тем не менее, с использованием ISSR-PCR маркеров можно получать полилокусные спектры фрагментов ДНК, полиморфизм которых достаточно надежно отличает одну породу лошадей от другой (6). Ранее в наших исследованиях число выявленных в ПЦР фрагментов ДНК, фланкированных инвертированным повтором (ФИП) микросателлита, и их полиморфизм зависели от нуклеотидной последовательности праймера (6). В полученных спектрах продуктов амплификации выделялись участки, консервативные и высокополиморфные у всех исследованных лошадей.
Для того чтобы оценить возможные причины описанных различий по консервативности и полиморфизму, мы сопоставили данные по экспериментально наблюдаемому полиморфизму локусов и первичной структуре участков близкой длины, фланкированных инвертированным повтором микросателлита, который использовался в качестве ПЦР -праймера, в секвенированных последовательностях генома лошади из Gen-Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Методика. Исследования выполнялись на геномной ДНК следующих пород домашней лошади Equus caballus: алтайская (48 образцов из хозяйства «Энчи» и 48 образцов из СПК «Чингиз», Алтайский край); группа лошадей рысистых пород, содержащихся в конезаводе «Поворот В.П.» (Московская обл.) (7 образцов от американских рысаков, 6 — от русских рысаков, 4 — от орловских рысаков, 31 — от помесных русских рысаков, улучшенных американскими рысаками); карачаевская порода (34 образца).
ДНК выделяли из образцов периферической крови с помощью набора ДНК-Экстран 1 («Синтол», Россия). Для исследования генетической структуры и полиморфизма внутри вышеуказанных пород лошадей применили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) ISSR-PCR (inter-simple sequence repeat PCR), в которой в качестве праймера использовали нуклеотидную последовательность (GA)9C. ПЦР выполняли в амплификаторе Терцик («ДНК-технология», Россия) в следующем режиме: первичная денатурация (94 °С, 2 мин); денатурация (94 °С, 30 с), отжиг (55 °С, 30 с), элонгация (72 °С, 2 мин) — 35 циклов; финальная элонгация (72 °С, 10 мин). Для проведения ПЦР использовали наборы реагентов PCR Core («Биоком», Россия) и ПЦР-РВ (ПЦР в реальном времени) («Синтол», Россия). Продукты амплификации, окрашенные в растворе бромистого этидия, разделяли в 1,5 % агарозном геле с последующей визуализацией на трансиллюминаторе УВТ-1 («Биоком», Россия). Длины полученных фрагментов оценивали с помощью маркера молекулярных масс M 27 (100 bp + 1,5 Kb + 3 Kb, 12 фрагментов от 100 до 3000 п.н., «СибЭнзим», Россия).
Индекс PIC (polymorphic information content) вычисляли по форму-
43
ле: PIC =_ 2f (1 - f), где f — частота одного из двух аллелей, рассчитанная как f = VR, где R — частота вариантов, у которых отсутствовал фрагмент ДНК соответствующей длины (гомозиготы по «рецессивному» аллелю).
Результаты. Экспериментальные спектры ДНК-фрагментов ФИП (GA)9C у исследованных пород лошадей. Напомним, что ISSR-маркеры характеризуются доминантным типом проявления. В спектрах ампликонов, которые мы получили с праймером (GA)9C в ISSR-PCR (табл. 1) на геномной ДНК лошадей разных пород, суммарно присутствовали 20 фрагментов (до 20 000 п.н.), при этом 11 из них ока-
1. Значения ивдекса полиморфного информаци- зались п°лиморфными жля онного содержания локуса (PIC) у исследо- бы у одной из исследован-ванных пород домашней лошади Equus cabal- ных пород. При расчете ин-lus по результатам ISSR-PCR декса полиморфного инфор-
мационного содержания локуса (PIC) каждый фрагмент ДНК рассматривали как отдельный локус. Наибольший полиморфизм отмечали у лошадей алтайской породы, наименьший — у карачаевской. Полиморфными оказались фрагменты ДНК 1700, 1600, 1580, 1100, 980, 880, 840, 740, 550, 500 и 360 п.н.; консервативными — 1880, 1400, 1300, 1200, 950, 900, 580, 490, 390 п.н. При этом полиморфизм каждого локуса в значительной степени варьировал в зависимости от породной принадлежности животных.
Расчетные спектры ДНК-фрагментов ФИП (GA^C в секвенированных последовательностях генома домашней лошади (Equus caballus, Gen-Bank). Для выявления внутренней структуры полученных в результате ISSR-PCR полиморфных и мономорфных фрагментов ДНК, фланкированных инвертированным повтором (GA^C, были разработаны алгоритмы на языке Python 2.7.3 (http://www.python.org/):
Длина PIC по породам
локуса, п.н. рысистые | алтайская |карачаевская | по всем
1880 0 0 0 0
1700 0 0 0 0,43
1600 0,49 0 0 0,38
1580 0,27 0,19 0 0,11
1400 0 0 0 0
1300 0 0 0 0
1200 0 0 0 0
1100 0,43 0,50 0 0,42
980 0,41 0,48 0 0,49
950 0 0 0 0
900 0 0 0 0
880 0 0,43 0 0,29
840 0,43 0,35 0 0,29
7401 - 0,44 - -
580 0 0 0 0
550 0 0,35 0,28 0,29
500 0,43 0,35 0,47 0,44
490 0 0 0 0
390 0 0 0 0
3601 (370) 0,47 0,40 - -
PIC™ 0,14 0,15 0,04 0,17
Примечание. Прочерки означают, что у карачаевской ло-
шади не учитывали фрагменты меньшей длины, чем 390 п.н.; 1
(в верхнем индексе) — опубликованные данные (6). праймера использована последовательность (GA^C. В качестве
import re
f=open("chromosome1 .txt", "r") for line in f.readlines():
re.findall(r".AGAGAp...]{0,4|GAGAGACp...]{50,2000|GTCTCTCp...]{0,4|TCTCT......", line)
f.close(),
где chromosome1.txt — файл из GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) для хромосомы с удаленными в текстовом редакторе пробелами и переносами строк (в анализ включали последовательно все аутосомы и Х-хромосому
лошади); ....AGAGA[A...]{0,4|GAGAGAC — прямая последовательность
для праймера (GA)9C, где точками указывались нуклеотиды, которые могли быть неспаренными; [л...]{0,4| — символ, которым задается шаг длиной не более 4 нуклеотидов после жестко детерминированных 7 нуклеотидов с 3'-конца праймера; GTCTCTC[A...]{0,4|TCTCT.... — инвертированная по-
следовательность праймера в той же цепи ДНК; {50,2000} — указание нук-
44
леотидного промежутка между сайтами отжига праймера. Алгоритм поиска возможных амплифицируемых последовательностей ДНК предполагал, что не менее 7 нуклеотидов с 3'-конца праймера должны отжигаться точно и не менее 12 нуклеотидов — иметь комплементарность к праймеру (GA^C. Такое условие основано на экспериментальных исследованиях (7, 8) об источниках ошибок при отжиге праймеров в ПЦР.
Длина последовательности между предполагаемыми сайтами отжига праймеров по условиям поиска составляла не менее 50 и не более 2000 нуклеотидов. До начала работы с сиквенсами хромосом все строки необходимо было объединить в одну, что выполнялось при помощи текстового редактора или программы BioEdit, представленной в свободном доступе (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit).
В качестве внутреннего контроля с использованием тех же подходов выделяли и рассматривали фрагменты секвенированных последовательностей ДНК, на флангах которых локализованы прямые повторы последовательности (GA)9C.
Сравнение спектров экспериментальных и расчетных фрагментов ДНК ФИП (GA)9C в геноме домашней лошади. Электрофоретические спектры продуктов амплификации участков ДНК (ампликонов) были представлены зонами с различной интенсивностью окрашивания, что допускает наличие в них фрагментов ДНК с близкими длинами. Условно мы обозначили зоны как мажорные (наиболее крупные и интенсивно окрашенные) и минорные. Для того чтобы уточнить возможность присутствия в мажорных зонах нескольких фрагментов ДНК, были выполнены исследования, в которых на одной и той же геномной ДНК проводили ПЦР при разных температурах отжига. В спектрах ампликонов, полученных с праймером (GA)9C (рис., А), выделились две крупных зоны в размерном диапазоне примерно 800-900 п.н. и 12501350 п.н., которые при повышении специфичности ПЦР за счет увеличения температуры отжига до 62 °С превращались в кластеры, состоящие из групп ампликонов, и смещались вверх (см. рис., А).
Пример спектра ампликонов ISSR-PCR с праймером (GA)9C для генома домашней лошади Equus caballus при разных температурах отжига (А) и использовании лиофилизированной полимеразы
(Б, температура отжига 55 °С): 1, 2 — 55 °С; 3, 4 — 62 °С; М — маркер молекулярных масс M 27 («СибЭнзим», Россия); а, б — соответственно кластеры 1250-1350 п.н. и 800-900 п.н., в — бэнд ~ 590 п.н., г — вероятный гетерогенный бэнд ~ 559 п.н., д, е — мажорные бэнды соответственно ~ 490 п.н. и ~ 380 п.н.
45
Сопоставив данные о последовательностях ДНК, найденных в сек-венированных хромосомах лошади с использованием описанных выше алгоритмов поиска, с результатами, полученными при электрофоретическом разделении продуктов амплификации, мы выявили соответствие экспериментальных и расчетных длин для многих участков.
Так, для кластера 1250-1350 п.н. фрагментами ДНК с высококомплементарными предполагаемыми сайтами отжига праймеров были последовательности 1326 п.н. (локализована в 17-й хромосоме, имеет комплементарные сайты отжига праймеров по всей длине последних), 1302 п.н. (2-я хромосома), 1296 п.н. (Х-хромосома), 1287 п.н. (20-я хромосома). Разделение зон на кластеры при увеличении температуры отжига праймера соответствовало повышению точности отжига в найденных фрагментах ДНК (см. рис., табл. 2).
2. Фланкированные инвертированным повтором (GA^C нуклеотидные последовательности в секвенированном геноме домашней лошади Equus caballus, соответствующие размеру ампликонов в ISSR-PCR, и их предрасположенность к формированию G4 квадруплексов
__ Длина фрагмента ДНК 1250-1350/1326 п.н. (17-я хромосома, PIC «-»)
GGAAGAGAGAGAGAGAGACAGACCGTGGTCATTTGATCCCTGAATGTAGGTTTGCTGAG
ACCAGCACTCAGTCTGACTCCTCAGTTATGTGAGCCAGCATATTACTTTTCTTCATAAA
GAGGTTTGAGTGGGTTTCTGACACTGGCACTGAGAGAGTCCTGAGTAACTCAAATATGG
AAATAAAT GGAAATTATACCAAAT GAAGACATAT GTAAAAAG GAGAACTTCCT CTGATG
TGTGCAACAGTGAAAAAGCTCATCAAATCTGAAGCAGCTCCGAGACAGCTGAAGTCGAC
AGATCCTAGGGTCTTTACCATAATCATACTAATTTTGTATATGTGATGCTTTAAAAATA
TCACACATATTCTTTACAAGTATAATTTTTTAATTTATTTTTTCTTCTCCCTTTTAAAG
AAGGAGATTCTAGAATACAAATGGAGCTCAAGGAATATATCATCCTTTCAGCATGCCTT
AAAGTTCTGTATCAAACAATGAATTATTGTATGTGAAAGGGGTTTATGTTTCTGAAAAT
TATTATAATAGGGATTATTTAAAATATGATTTTGAAGCATTAACATATTTACTTATTTG
CACCCTTTTATATATTAGTTTTTATATTTAAAAGAAATGTAGCCACATTTCTTCAGTAA
TATTGAACAGTTGAAAAGTTTACCATCATCCTGGACTTTTCCTCATTATTGGGAAGTAG
AGGAATTTTACTGTAATATATTTCAATAATGTTTATCTAGTGTTAGCTTTTGAGGTTCA
AAGTTTTAACCCCAGAGAAGATCTTTTTTATGTACATGGTACTTGAAAATGCAATCATG
ACTGAAATGAGTTAATCTAAAACTGTGAAACAAGAATTAATCACTTATTTGTCAAGATC
AAGACATGATGTGTCAATTTATTTAGCACACAGGAGGGCCATCCCTATACATACTAAAA
CATATTTGGAGGATTGTTAGAAATCAACTATATTTGATGGAAACATTTCTGCAAAATTA
GCTAAATATAATACTGAATAGTTTGAGCTTCTATTTGCTTTTAAAATAGTAAATCTCTT
TTGGTTGACCACAGATATCAATTATAATTATCAGTTACTGTGTAATAGGTTGATGCTCT
TTATTGCTTTTTATGCATGTAAGTTCACTTGTCTCAATTTTAAATGATTTCAGACTGGC
GTGTTTTTGAAGTGTTTACTTTCATAGTTTCTATCTCCTTCTTTACTGTTGAAATCCCA
GCTGTCACTTCTATTTCTGTCAATATGCTAGCCTTCAGCAATCTCTCAATTCCTTCTTG
TTCTTCTTGGTCTCTCT CTCT CTTTCTC
Длина фрагмента ДНК 1250-1350/1302 п.н. (2-я хромосома, PIC «-») gaaagagagagagagagacaggttctttgtgcatttcgcatcctgttagTgggtgtgggi GGtgcatGGtttatgttagttacatggttatgagggtgacaacctgt gtccct gtctca
TACCGTCTGGGGATATCATGTGCCCGTCTCACGATCTGGGCGAAGTGACAGGTTATATG CTTAGCTCATCCTGTTAGGAGGGTGGTCACTGACTTGTGTGCTTGTCTCTGGCTGTTGG GTAT GT GTGAG GTGT CACCATGT GCCCGTCTGAT GTTGTGAGGAGT GACATGT GTGATT
atctcgtgctgttgGgaggttgtcagtaacttggggGttgtctctcaccctaaagagac
aacatgttgcccagTggtgtggggctgcggttggCaGGgccttcccacgcagaccacag
ggccccaaAgggctGgccagaggaagctctgGgggccctgagtacagGgacagatgtgG
IgctggagcgagGgtctcagtccctcatgacctaccttctggcccaggtgccaacccttg
AGACTGTTCCCCAGGAGGAAGGACCCCGTGTATCTTCACACAGTGTlGGAAAGGGGCCCCl
TggctctggGgcAggtgtgactggggagGtagagcaccAggcgggCttcacatgggggG
CTGTGTCCCCGCAGGCCTGGGGGGCCCTATTCCCTGCCTCTTCTGCCCCTGAAACTGTT
aaactaattaaggctgtggagccgcaggattaatcgIgggcagctcggcgcgggccgggA
Gctcaggtagtcgattagtgtgccgcggaggatattggatttctgaaccgcaagtcagc
actattcgggcctgttatctctccgaGgcttgagggtcaggaggcgGgagcctccgggc
GCACTGGCCGCCCCCGCCCGGCCAGCTCTGGAGCGTCCACTCCCCCTGCCCACACACCG
CCAGCCTGTCTGCCTGGCATCCCTACCCACTCCCCCCTGCCCTCCTGGCCCCACCGCTG
CCCACACGGCACCCTCACCCAGCCCTTCTCCCTGGCTCACCCTGGCCCTACAGTCATGT
TCTCTCTCCTTCTTGTTCCCTCCTGGCATGACTCCCACTCTGTGCCTCCCTGACACCTG
CTCCTCAGCTTCTCACCAGCCTCTCTCCACTTTGGTCTCCATCTCCCTGTCACTGTCTC
TGTCCCCCAGTCTCTGTTAGCCTCTCCTATCACCACTCTCTGTTTTTGTGTTTGTGTTT
GTGAGTGCCTGTCTCTTACAGTTTCTGTCTGTCTCCATCTCTCTGTCTCTCTCCCTCTG
TCTG
_ Длина фрагмента ДНК 1250-1350/1296 п.н. (Х-хромосома, PIC «-») GGATGAGAGAGAGAGAGACAT GAATGACAGAGTAAGAGAGACAGAT GATGAATAAGTAG ATGACAGAGAGAGATAGATAATAGCTTATTTACTAATTTATTTAGTCATTTACTGTGGC AGACTCCATACTAGATGCTGAGGGCGCAGAGGTGACTAAGATAAGGGTCCCTGTTTTCA ACAAGCTTGTTACATAGTAGGATAAATCAGCTGTCTACCTCCTAlGGAGCAGTAGTGGACl lAGACTCAGGCTGGlATTCCATCCCAGCTAGGAATGCCCCTCACCCCAGCGGAAACACAGA
aaatcccagcagtgcaAggttctagagggctaaggcctaaaaaggTagtcctgaagaga
acggcgttgctgggaaaaacctggIggtagaatggtaacaggccaggIcacagacaaIggagI
46
____________________ Продолжение таблицы 2
GtgtaagaggaagaacagGggaagctgcttgtcaaaggtcaggaaccagagccacaggt cagcagcagtggctaagatttaTgggaaggaaagccaggtgagGcccccacttctaacc ^ acattattctgttatggatttcagagggcccagcagIggacgctgaaggcatgagaaagC |cttgggG|gt gt gtaactgct ccagagtctcacacacaaagccatgat gttagaaatatc
TCCAGCTGCTGTTACCCGGTAGTCTTCAACAACTATTTATAAAACCTCTCGCAGAAGTA
CTATGTACTACTACGCACTGTGCCATGTGTATCTACTATATACTATGCTTCTAGGCACT
GAAGATACAGTACAGAACAGGGTATGTCTCTTATTTTGGGCCCTTCTTCTACATCCAGG
ATTCCTGAAGTTCTCCTGAGCCCAGGGTTTAAAATGTGAGCAGTCAGTGTTGATACCAC
CTTCTCCCCAACTGTCCAATCCTTCACTGAGTTCTGCTGAGTTTTCTTTTATGATATGT
CTCTGGCTTTGCCTCTCTCTCTCCATTCTCAGTGAAACTATTTCACATAATTGCAGTTC
TCCTCCACAGAATCCATCACCAACACTTCCTATTCTAGTCCAAGCCCTTAACATTCTAT
GTCCAAAATACTGCATCAGTATGCCAGCCAGTGTCCCCTTGTTCCACCTCCAGTCACTG
CTTTTAGACCATATCATGTCAAACACCAATTGAATTGTGGCACTCTCCTATTCAAGAAT
ATTCACTGGCTCCCTATTTCTTACCCTGTCCTGCATCAAATGTAAGCTGGATTAGACCT
TCAAAGCCCTCTATAAGCTATCTTTATCCGCCAGCCCAGTCTCTCACATCTCTGCTC
Длина фрагмента ДНК 1250-1350/1287 п.н. (20-я хромосома, PIC «-»») GGAGAGAGGAGAGAGAGACACAGAGAGAGAAAGACTGAGAATATTGCAGGTATTCCTAG
ctgcctaaattttctgctcaaaaatatAggagaacccgcagcccggtggaagGagccta
TTTAAGTCdGGAGGAAGGTTGAACTTTAACAGAAATGGlCAGTCAGGCCAGTCGAACGGG TTCCTGAAACATCCAAAAAGGTTTTCTGTTGCCCCTGGCTTTGCCTGGAAAGGATAAGT TTAGTGTACTT GAAGATT GATTGCATGTATT GTAAATTGAGGTAAAAAT CAGACTGTAT
gagcactaaagaGggaaaggcggcacacgGatgaaaaaccccggctcgcctctgtcctt
TAATAAATAAGCATAATCTCCGATATTCAGTGAAAGTCCGCAGACGTCACTGTAAACAA
CCGGGCCCACCGGGTTACTTTTCTCTCTCCTCCAAATGATGAGGGAACGCCTTTTTATT
TTGTTCTTAATCTGCACACAAAGCACCTAGGGCGATCGACTCTTCCCATTAGGAAAGTC
CCTCTCCAGGAACAAGGACACCTACGTTCTCTACCAGCCCCCAGCGATGCTCTCCCTCC
CTGCCTTGTCCCGGGGAGCAGGGGCTGCTTTACGCGTGTCCCCGGCTCAGTTAATTGAA
GTTCTGCCTCTTTCCTGCTAAACTTTTTCCCCAGTCTGCCTTTGCCAGCCCCCTGGTCT
GATTACATCTAGTAATTCTCCACTGAATGAACGTCATTTACAATAGTAGGGGAGCTCTG
CGCTCGCTGCTGCTTCACGCTCCATTTGTCCTCCATTCTCCCTTTAAAGTACTCGTGTA
ATATTAATAGTCATGAATATCAATTATTATGAGGCGGTGTAlGGCAAGCGGAGGGAGGAAl
IggggIcgcctgagcagtctgagcccagcttcIgggtggaaGaggactgcgtctggIagcCcc
GAAGAACGGCAGAAGAAAAAAGGCCAAAAAGACAGCAAGAGACGGAGAAACAGCTCTGT
ctgtgtgtgacaggcatcgccaatcttgttTgggaggggggggggGgtaaatttttttt
TTTGATGGCTTGTCCTGGAAACACCTCAAGCTCGGCTCCTGTGTCCAGCTCGTTGCTCA
GCTGGACTCCTTGATTGTTTTTTTTTAATCATTGTTTGATTTTGAGCAGTAACCAGGCT
TTTTTTTCCAGATGTTAGTCCACACCTATTCATCCATGGTGAGTTTGGATTCACGTTGT
ACCAGAATTGCATGCTCCCTCCTCTCACTGTCTCTCTGTCTCTCTGTC
_ Длина фрагмента ДНК 980/986 п.н. (23-я хромосома, PIC = 0,49) TGGGGAGAGAGAGAGAGACAGTGGCTTCTTTCATCTGATGGGTATCTGCTCTAATAGCA GTATCCAGTGAATACCTAGCTTCGATGGTTCGTTTCACCTGCCTCTCTCTGAGTGGGTA AAAGGGTATCACAGAAAAGAAGTATACATACCTTATATATCTCATAAGTTTGGTTATAG CACAGAATGTAAATGCTATCATGAAACTCACCCAGCTTGTATTTGGTGTATTAGAAAAC TAT CTCT CCAGAG GAGAAAAACAAACAAAAACATT CTGCGCT GAAATATGGTAGAAGAC
acttggataagcaaaggtaaaggctttctttaccctgggacttctICaGaGtggacTtgGI
IggctaaaacccagGtctcttgcttcagaataattgcctttccccccctcacaatgctgc
TCTGTTTAGTTCATAGGGCCCAAGGCCCTCAGTTTGAGGCCCAAACCAGCGGCTTTGAG
aaattatgccccctcatcctgatcatcacaaattcaaggttgctgacgAgggaagaaggI
IagaagccaggggAacaagaatagagTggaaatacaggggttaagGgtatttcctctgga
GTCAGAAGGTACTGAATGTTTATCCCCATCTGACACTAGCTTTGTGAACTTGGATCAAG
AAATTTGTTAAGGTTCAGCTTCCTCATCTTTAATACAGAGTTGTTTAAAGAACAAAATA
TGAGAGTTCTTTTTCAATGTTACTGTTACTATTTTTTATTAATTTTTGTCGAGTCTAAC
AACCCATCCCTTTTTCAATGGGGTTATCAGTTTCATCTCCAATTATGAGTAGCAGCTCT
TTCATTGGTTTCCTTAAAATGGTATCAAGGAAAAAGAAATATGCCTTAGAAGAAATTGA
GAGGCTTTATATCTAAATGCACTGTATTAAAACAGTCTCAAAGTAATTAACGTTATTTT
AATTAAAGTATGCAAATCTCTCTGTCTCTCTGTCTCTAACAC
_ Длина фрагмента ДНК 800-900/900 п.н. (24-я хромосома, PIC = 0) TAGAAAGAGAGAGAGAGACCACCAGGGAATTGTGAGGAAAAGAAAAATGAGGGAAATGT CTCGATTTAATAGGAATTTGGGAGTGTTGAGAGCATTTTAAGAAAAATGCTTGCTTTTT CACTAGATGAGTCATTTTGTTCAAAGGGAGAAGAAACTTACTACTTTCTCTGAAGTGTA ATAGAACTGCAGACCTAGCTCCACAACTTTTTTCTCTTTTACATAATCTTGTCCTTATT CAAGAGCTAGTGAGTGAGGGTTTTCCCATGAGAACTGGTCATGTACAGAATGTTAATGC AGAGCTGGGTCAGGCTACGGTGTTCAACATATACAAGGTGAGAAAGCTCTGCCTCTGGT TAGATTAAGGTATGTGGATTGTCCCGTGCATTCTGTCCATGTGTCTGGGAACCTCATGT AATCATGAGAACTAAGGAATCCACCGATTCCTTAGACACCAlGGTTTCTAAGGGCCTAGGl ICATTGTGTCTGGlTTTTGTTTTTATCTTCCCAAACATGGGTTTTTTCCAGCTTCACTTAA TATGTCTAGCAGATAAAGCTATTTCAGTTAGGCACAGTTCCACTGCTCTTAGAAACATT GAGGATGAATTTTCCTTGTTTGTACCTGCTTCTTGCCAGAGACTAAAAACTGATAATTT GGCTGCTGGCAAGATTCCACTGCAACAGCTAGTAGAGTGTTCTGGAACGATGCCAACAG
cagacagattgcattaaatacttaaactactattttagatcagttctgcagtTggggacI
IctgaaatcagcggtggIatccactttctactttccagcttactttgctctgggtttttta
AATGTCTTCTGTGATTTCCTCCAAATGGTTATCTCAAAGTGGCTTCTCTCTCTCTGTCT CTCTCT CTAACATGC
_ Длина фрагмента ДНК 800-900/876 п.н. (Х-хромосома, PIC «-») TTTATAGAGAGAGAGAGACAGAAAAATTCT GTAACT GTGTAACTGTTCTTATATTTAAT CCATGTGACACATTTAATATTGATTTTCTCTGTCCTAGGATCTATGTGATGACTTATTT GAAATAGCCAAGTGGATTTTAGGGTTATCACTAAAAACACACCATTGATTGGAGCAATG CTGTCCAATTGAACTTTCCCAATGAGGGGAATGTTATATATCTGTGCTGGAGTAGCTAC TAGCCAGATAGAGTTTTTGAGCAAATGACATGAAGCTAGTGTAGCCGAGGAACTGAATT
47
Продолжение таблицы 2
TTTAATTTTATTTAATTTTACTTAGCTTATATTTAAATAAATGCATTTGGCTAGTGGTC
ACTCTGTTGGGCAGAGCAGCTCTGTCCAAAGATAAATTTTGAGAAAAAAATTGTTAAAG
AAGCCTAGTGTTTGTCCTTATTTTTAAATAAACTATCCTCTAAGCTCTCAGATTCATCA
CCTTCCATTAATTAAACAGAATACTATGAAATTCTAAAGGTTCTCAGAAGTGACCATTT
gatttgtgagacaagIggtaaagtggaaaacaggtgattgggIagtctggattctcccctg
CTTTCCCATCTCTCTACCTTCAACAAAACAGCATATTTGTATGTGTTTAGTAAATTAAT
TTTTCACTTAACTCTTTACTCAAATAAAGATTTTATTCCACTTAAAATCTTTTAGAAAC
CACTACCTTGAACAACAGATTTTTATCTATATTCAGGAGCAACATGCAATATCTACCCA
GTATGTGCCTGTGCATATTTATAGGAAGGGAAAGTCACTATCCATGTAGAATGATATGA
GAGGCATAAGAAGGTCTCTCCACCTCCAAGTGTCTCTCTCTCTCACTCAC
_ Длина фрагмента ДНК 800-900/871 п.н. (18-я хромосома, PIC «-») AAGACAGAGAGAGAGAGACAGAGAGACAGAGAGAGAGAGAGAGAG GGAGAGAGACT GAC
ttaaaagaggcagcctgaacTGgatcttggggaagcagctcggAatatattattgtact
tgtttttttgtaatactaagccaagccaatagatcaaaggcagcacaaagggaaaaggq
AgQataacgtaacgaacagtttctgactaaaattcctctatcactcccccatatggctc
GACACCTCCACCACAACAAGCAAAAGACACACACACACACACACACACACACGCACACA
CACGCACAAAACCTAGAGAGAGACAGAGAGACACAGAGAGAGAAGCATCACTTGTCTCT
AATCAAAATTCTCTCGTCTTTGTGTTTTCCTCCCTCCAGCACCCCACACTGCGCCCCCA
GCCGCCCCCTCCCCGCGCCGGGCAGCTCCGGlGGCAGGCCGGGGGlCGCGCGCGATTGTCT
tctctggaagaaagttgctccaagtgggcccgggcgctccccgcgagccgagggcTgggI
IcttgcgggaggccggaggccggGctggcgccgcgtccccgcggccagctcgggagcgtc
aacgcggccccgcgccGggtgatcgggctcagagcgaggggAacgagaagtttcctttc
CCAGTCTGAGCTGGCGCTAGTTCGCTTGTTTGTTTTGGGGGGTTGGTTTTTCTTTTTAA
ACTCAGTATCCTCCGTCAGCTCCCCCTCGGCACCCTCTCTTGTCCCCAGCTCTCTCCCC
TCCCCCAGGCGCCTTCTGCGCTCTTGCCAATCACTTTTCTCTTTTATTCCCACGATTTT
gtttggGggtaatacctagggggtcGgtctctctttctctctctc
Длина фрагмента ДНК 800-900/857 п.н. (3-я хромосома, PIC «-») CTGTTAAGAGAGGAGAGACAATTTGATGTGCAGCTTCTGACTGTCTCAGGCTACTGATA AGTACAGTTGATGGCAGCATTAGACTCTGTTTTAGTTATCTATTGCCCAACACTTTAAA
aaatgatctttttcctcatgattctgtGggttgactaggctgagttgggtgGtttttcg
GCCCCTTATGGTGTCAGCTAGGGTTACTCAGTTGGTTGCATTCAGTTAGCATCTTGGTT
GGCTAGAAGTTCCAACAAAGCTTCACACAAATGCCTCACCCTTTGCTGGTTCTCCACGT
atcctttttacgtggctagcttGggcctcctttcagtatggtggcttcagGctattcaa
ACTTCTTACCCTGCCACTGGCTTCAAGGGGGAAAACAGCAGCTGCTAAGCCTCTTAAAG
CCTAGAACTGCATCTGGCACAGTGTCACTTCCACCTAAATTATGAGAACAACCCAAATT
CAAGGGAAGGGAGGTAGACGCCACTTCTCTATGAGGAGAGTGGCTTGCTGATAGAGTGA
GGGAAAGAATTGATGGCAGCCATCTTTGGAGAATCACCACCACAGCCTCATTACTCACT
TTACATTAGCACTATTTAATTTTATGTTAGATTTTCTTATGTATCTTCAGCTCCCTTTA
TAAGAACAATCTTACATTCACTTACCAGTTCCAGCCAGTGTTTTCTGGTCCTTTAGGAA
AAGTGGTCCTAATTATTCTTAATAGTTGGTACTATATAGTTAGGTCTCACTTATGTGCT
CAGTACTGAGTTTAGTTCTTTATGTATATGAGCAAGTCCTTACAATAACCCTGTGAGGG
AGATATTATTAT GTCTCTCTCTCTATTTTTT
Д л и н а фрагмента ДНК 800-900/832 п.н. (6-я хромосома, PIC «-») GGTGAAGAGGAAGAGAGACAGT GGGCT GAGATCCTACGCCTGAAACTTATCT GGACAGA AAGGATGCCTTTAATCAGGCCTGACTAACTGTCTGCACCCCCACATACACACCTTCACA
caaattctttggAgggcaAggggggaaGaggtgtaaAGGccaacgcagacggcagtttc
ATCCTAGGATAAGAAGAGCCATCACAACATTCAAGAAATGTTAGCATATTTTCTTTTCC
TGGAAGTGAGGACCAGGGCACCAAAACAGTGACAGGCACATTGTGCCTCGAACTGCTGG
AGGAGGCAGTGCATTTTAGACAAGATGTTTAAGCTCCCTGCTTCCATGTTTTCATCTGC
AAATCAGCAGTTACGACAGTAACCACGCCATAGGGTTATGATGAATTTTAATGGGATAA
TCCAAGTCAAGCACTTAGCACGTGCCTGGCACAAAGGTGACGCTCAATAAAAGTGAGCT
CTTGTCATTCTTTGGAGCACCCCGTACATTCTGTCTACCCCCTGCTCACCCTGACCCAA
GGCGTCTGGTTTAATTTAGTGTCCAAAACCAGCCTAGGCAGATGACCTGGAAGCCTCAA
agtctgaacacctggggcttacaGgggtgactggagGaccacccggatctcctcacctg
aggatccatctttgtgagcgcccacccagctagccTggggttctgtccgggtcctcaagI
TgGgagacagctatgcTggagtgaggctgaccctggacctggGgttaggattttcagga
TTGGAACCCTAACTCTGCCATTTACCAACTTGGTTACCTTGAGCGAGTCTCTCTCTCTC
TAGCAT
Длина фрагмента ДНК 800-900/823 п.н. (19-я хромосома, PIC «-») tagagagagagagagagacagatgIgggggagggTgtgggggaggGcgagattcattgat
TGATTGCAAGGAATTGTAATGCAATTGTGAGAGCTGTCTGGGCATGTCCCAAATCA|GGd
CatcagggagggcagtttggIaaactctTggtcaggagcagatgcaggagtccacagGaA
ATTTCTTCTTCCTCAGGGAAACCTCAGTTCTGTTCTGAAGGCCTTCAGCTGAATGGTTC
AGGCTCACTGAGATTATCCAAGATAGTCTCTTATACAGCCAACTGATCCCATCACTGAA
ATACCTTCATAGCAACACCTGGAGCACAACAACCTAGAGTGCTGTTCGATTGCATAATA
GAGTACCATAGCTTAGCCAAGATGACACAAAACTAACCATCACAATAAGTACAAGGGAA
ggggcaagacgctactacagtattcctTggactaggtgaatgggggIcaataatattggg
tgtattgttcggtagtggccIggctgactggtccctgtttgggaggcgGIagtgtgcacaa
GGTTCGCATGCTGTTGTGTCACAGCCCAGGACCCTTGGTGTACTTTTTTCTATCCCAGC
CCTAATATAACCTTCTGTCTTCCAGTGTATAGCATGAAGCTCTAGCTTCATTCTTCCAA
TTCAATCCCGTGTTCTCTGAAGAAAAAATGCCCAAAGCAATTTTCACCCCATCACACAC
TAGTAATCATTTTATTTTTCTGATTATGTTTCTTTCTCTCTTTCAGCCCTTTGGTAAAT
TACGCAGGGACCCTTTATTCTCATTCTCTCTTTTTCTGTCTCTCTGTGTCTCTATG
Длина фрагмента ДНК 7401/739 п.н. (16-я хромосома, PIC = 0,29) GACAGAGACAG GGAGAGACAGACAGACAGACAGAGACAGAGAGAGAGAGAGAGAAAGTG AGCCAGACGAAGCTGTATCCCTTTTCATGAGCTAGCATCAGAAAATAAGTCACAAAGAC TAAGACTAGCCCTTATTCAATAGTGAAGGCTTAGATGCGACCATTTGATGAGAATGTCA AGTAATTTTCAGACATGTTTTAAAACCATCACAGTTGTATATGTTCTTCCAGGATGTTG ATCAACTCCATTTCTTTAACATCTCCTCTCATATCTAGCCTCTCCTCCCCAGCCTATAG TTTATTCCTCAGTACGTGTAATGGTTCATATTATGTACCAACTTGACTAGGTTACAAGA
48
Продолжение таблицы 2
TGCTCATATATTTGGTTAAACAGTATTTCTGGGTGCATCCCTGAGAGTGTCTCCAGAAG
attagcatttaagtctgactgagtaaagaagatgtctccctcgtcccccagtTggggtG
GgcattatccgatctatgagGgcctcaacagaacaaaaAggtggagggaggIgagaattt
GCTTTCTCTGCTTAAATGCTTGAACTGGGACATTGGCTTTTTTCCTACCAGCTCTCCTG
GTTCTCAGCCTTCAGGCTCAGCTAGAATGACACCGCTAGCTTTTATGCGTCTCCAGCTT
GTAGATGGCAGATTGTGGGACTTCTCAGCCTCCATAATTGCATGAGCCAATTCCATATA
ACCTCTGTCTCTGTCTCTCTGTCTCTGTCTG
Длина фрагмента ДНК 580/585 п.н. (1-я хромосома, PIC = 0) CGCTGAGAGAGAGAGAGACCAAATGCCCACAGACGGCTCATCCTAACTCGACATGGAGG
aaaagtcctactgagtgctaaaagtaattcccagagtatggaattctgaatgacIgggcT
IgaggtaatgatgggcaccttcaggIaggctggcacccccatctcaattataccaacctca
ATCTGCTTATACCTGTCAGTTTGTAAAAGAACTCTCCTCTTCCTGTCTTAGCCAGGCTG
CTCATAAGAGTTCCAACAAACAACCAATAATTAATAGAAlGGTTGGTCCTAGGTTGG^CT
TAACCAAGCCATGAAGGATGTGTGTGTAGATTTTATACTCCAGCAGAGGGCAGTACCAC
ATAAAAATTACTATTAAGGAAAAACTGAGGTGCAGCCTCTTTTGTCAATTACCCTGAAT
TTTCTGTATTATTGAATAATTATTATTTACTGTCACAAAAACGGGTAACTTGTTCATAC
GGTTATCTTGAGTATCAATGGACAATCCTGGCAATCAATTTAAGCCCTAACAATTTTAA
ATCTTACAATTTTACATAATACTTGCTTTACGTGAGTCTCTCTCCTCTCACATG
_ __ Длина фрагмента ДНК 550/637 п.н. (Х-хромосома, PIC = 0,29)
CAAAACGAGAGAGAGAGACCCAGACTTCTCATAGAACCCGAATTAGGACCGATACACTC
CTTACTGCCAGAATGTAAGAGGAATTTCCCCTATAAGTCCCGTGAGTCAGAACTCAGGA
aaataatgAggggctttccatggctctcctgagGaaaagagaaatatctatttacttga
AGAACATGGAATGTGTTTCATACCACTTTGTCTTTCTCTAGGACTGAGGTCTGTTGGCT
TTTTAAAATATAGCTACCCAAGGAGTGGGATCTCTCTCTTTCTCTCTCTCCATGTTTTT
CTCTTTCTCCATCTCTCTCCATCTCTCTCCATCTATCTCTCCATCTCTCTCCGTCTCTC
TCTCCATCTTTTTCTCTTTCTCCATCTCTCCATCTCTCTCCATCTGTCTCTCCATCTCT
CTCCATCTCTCTCCATCTGTCTCTCCATCTCTCTCCATCTCTCTCCATCTCTGTCTATC
TCTCTCCATCTTTTTCTCTTTCTCCATCTCTCTGTCCATCTCTGTCCATCTCTCTCCGT
CTGTCT CTCTAT CTCTCT CCATCTCTGTCCATCTCT CTCCATCTCTCT CTCCATCTATC
CTCCATTTCTCTCCATCTCTCTCTCCATGTCTCTCCATCTCTCTCTC
_ Д л ин а фрагмента ДНК 550/572 п.н. (10-я хромосома, PIC = 0,29) AAGAAAGAGGGAGAGAGACAGAGAAATACTCTGCTCTCTCCAGCACTCCAGTCTTCTGC
cagtgcctcccattggccagacctaccTggaaggctgagggcaacagactctgGgagct
gtagttcccggaaataccgagaacagtaggaggtgIggggtaggagggatacaaaagggG
GGcaaaaagcatctggcattgattctaaaactaacaggaaaaactaggctgtgaaaagt
CAAAAGCTCTTAGGAAAATGTCACTTTGGAGATGAGCTCACATCTCTTATGAAGTTTAG
CACAGCCAGTTTTACCTCTGGTGTTGGAACAGAAAATTCTCCTTTTGATTGGGCAATAG
ATGACATCTTTGGCTTTGCTCTGGGGTCATCTTGTACGAACAATATGAATATTTCAATG
CTAAAATCATTCAGCTCAGTGACATGCTCATAACTTGAGAAGTTGCCAGAAACTGAGAA
GAAGAACCAGGGTAAAAGCAGTTTCACACCTCCCATTTCGTCCTTACTCAGAAATCTCA
GTCTCTCTCTGTTTCTATCTCTGTCTCTCTCTCTTTCTCTT
Д л ин а фрагмента ДНК 500/494 п.н. (1-я хромосома, PIC = 0,44) CACAGAGGAGGAGAGAGACTGTTCCCCAGAACAGAACTGGGTGCAGAACCAGAAGAAAG TGAGACTCCTGCTGGGGCCAAAAACGTCAATGAGTTCTGATGTAGTGGACAACGACACC ACTGACAGAGCGGTTGTAAGGAGAAAAGGGACCAAACAGTAAAGCACTGGGCACAGTGC CCTGTCCCTTCTCAGGGGTCAGCAGCGTTAGCTGTGCTAACCATCGCTTCTCTCAATCC
tcagcaactctgtgaagcatctcccccattccccagatgggcgaccggGgctcgagctgI
GtgatggggttgcctgagGctgcctaagtgccaggcaagtctctgatccagcccgtccg
CAGGGCCGGCTACATACACTGCAAAGCCTTGTGCAAACGAAAGCAAGGAAGCCCTTGTT CAAAAAGCAGGAAAAATACCATTAAGAGAGCTAAAATATAAAGCTTTTTCCTTTCTTCC AGTGTCTCTCT CTCTCT CGCCA
Длина фрагмента ДНК 490/489 п.н. (28-я хромосома, PIC = 0) GAGAGAAAGAGAGAGAGACCACAATGAGATATAAAATACAGGACATAGTTTAAATTACT GACAAAGTGGCAAACTGGTGTGTGTGTCTTGTGGTACCCTTCGGGAAGCTGTCCTGTCT TTTTTTTTTCATATCACCTGATACCTCCAGCTCCACTCGGCTCAAGGTTTGTCAGGTCA AGAGCTCAGAAGAGCAGCCGCACACAGCGCTCTCCACAATCTCTCGCCTGTGCTCGCCC AGATAGACCTCAGGCCCTGGCCCTTTCATGTCCTCTCCCAGCTCTCAGCCTGGCTCCCC
cctcagaaagccagagtcccagccgaatcagaggagctggtgttagagtccccgaagAGI
GtcacctcggccgtcctggggGcacagctgtcatgggtttcagagcagcaggtaaaatg
GACTGCAAGTTGAGAGCAGACCCAACAlGGGGAGGAGTCAGACAGdCGCCCACACACCGT CTCTCTCTCT CACACAC
Длина фрагмен та ДНК 380/378 п.н. (11-я хромосома, PIC _ = 0)
acacacagaggagagagacgtagIggagaagagaaggccgtgtgaagacggaggIcagaga
TTGGAAT GATGCAGCCACAAG CCAAGGAGCAT CT G GAACCATCCGGAAGCTACAAGAGG
CAAGCAAGAATTCTCCCCTACAGCCTTTGGAGGGAACGTGGCTCTGCCAACATCTTGAT
TTCAGACTTCTGGCCGCCAGAACTGTGAGAGAATGAATTTCTGTTGTTTATAGCCACCA
AGTTTGTAGTCATTTGTTATGGCAGCCTGAGCAAAGTAACACAGGAAATTACTGTGATA
ATGTAGCAAAACGTTTAAAAGCCTGTTTCCCCAAGCACGTCTCTCCTTCTCTGTCTCGC
TGCGTGTCTCTCTCTGTCTCTCTC
Длина фраг мента ДНК 380/377 п.н. (21-я хромосома, PIC = 0) tgaggagagggagagagaCaggggaacactgGttggtgGagcagtcataacacacacat
TTATCAATTGTTAGCCATCTTATATGGTTGAGGTTCATCGCCCCTCAAAACAATTACAA
TAGTGCCATCAAAGATCACTGACACAGATCACCACTACAAATATAATAATAATTAAAAA
TTTGAAATTTTGTGAAAATTACCAAAATGTGACACATAAAAGTGACCAAATGCTGCTGG
GAAAATGACTCCACTAGACTTTCTTATTGCAGGGTTGCCACAAACCTTCAATTTGTAAA
AATGCAATATCTGCAAAGTGCAATAAAGTGGGCTGCGAAAAAATGAGTTAGGCTTCTCT
CTCAGT CTCT CTATCTCT CTCTA
_ Дли н^ф рагмента ДНК 360 (370)1/364 п.н. (5-я хромосома, PIC = 0,421) GAAAAAGAGGAAGAGAGACCGGAGCTCTTTCTTTCTCTCTTTCGATCATGTGAGGATAC
49
Продолжение таблицы 2
AGCAAGACTGTCTGGGAACCAGGAAGAAGGCCCTTACTGAGAACCTAATTGGCAGGCAC
CTTGCTCTTGGACTTCCCCATCTCTTATTCTGTTGTTTAAGCCACTCAGTCTATGGTAT
TTGTTATAGCAGCCCATCTTAGTCATAAGACATACATATATATACACATATACGTATAT
GTGAGTCT GT GT GTGT GTATATATATAT GTATTTTTTT CCATTTCCTAAATTCAT GCAC
TTTCAAAAAATGCCTTCTCTTCCTTTTTCACATTCTGTAGAAATAGTACAGTCTCTCTT
CTCTTCCCCT
_ Длина фрагмента ДНК 310/309 п.н. (5-я хромосома, PIC «-») TTCACAGAGAGAGAGAGACAGAGACAGAGAT GAGAGAGAGAGGACAGGAAAT GCAAAGA GATAACTCTAAATAGAGAGGCAAAAGGGAAGAAAATAAGGAACATATAGATAGAATAAT ATTATCATTCCAGAGACTCTCAGTGAATTTCTGTAAAGTCCATAGGGACAGGGCCCCTT ATCGCCATGTTTCAGGGATTTGATTAAGGATGCTCAGCAGGCACTTGACAGAGTGAGCT TGTTCAGTTCTAATCCTTCGAGGAACCATTACTCATTCTGCAACATTGAGCCATGTCTC _____TCTTTCCCTCTTCT
Примечание. Представлены результаты анализа сиквенсов из Gen-Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) для последовательностей размером до 2000 п.н. на соответствие полученным собственным экспериментальным данным по ISSR-PCR амплификации фрагментов ДНК с праймером (GA)9C (фактическая дли-на/расчетная длина). PIC — индекс полиморфного информационного содержания локуса, PIC «-» означает, что в эксперименте невозможно оценить полиморфизм фрагмента в связи с отсутствием четкого совпадения экспериментальных и расчетных длин фрагментов, 1 (в верхнем индексе) — опубликованные данные (6). Светло-серым выделены сайты отжига праймера, серым — точки ошибки отжига; последовательности, предрасположенные к формированию G4 квадруплексов, отграничены рамками.
3. Представленность диспергированных повто- Для кластера 8°°-
ров различных классов в секвенированных 900 п-н- также был:и на:йде-участках генома у домашней лошади Equus ны готенциадкно амплифи-caballus, фланкированных инвертированным цируемые участки ДНК из повтором (GA)9C разных хромосом: 900 п.н.
Класс | Число |От общего числа повторов, %
ERV/ERV3 47 15,93
DNA/hAT 32 10,85
NonLTR/SINE/SINE2 30 10,17
NonLTR/L1 29 9,83
LTR/Gypsy 28 9,49
NonLTR/CR1 17 5,76
DNA 15 5,08
DNA/EnSpm/CACTA 13 4,41
DNA/Mariner 10 3,39
LTR/Copia 10 3,39
ERV/ERV1 9 3,05
ERV/ERV2 7 2,37
DNA/Ginger2 5 1,69
DNA/Kolobok 5 1,69
LTR/BEL 4 1,36
DNA/Dada 3 1,02
DNA/Harbinger 3 1,02
Interspersed Repeat 3 1,02
DNA/Helitron 2 0,68
DNA/MuDR 2 0,68
DNA/Polinton 2 0,68
LTR 2 0,68
NonLTR/L2 2 0,68
NonLTR/Tad1 2 0,68
Simple/Sat 2 0,68
DNA/Novosib 1 0,34
DNA/piggyBac 1 0,34
DNA/Transib 1 0,34
DNA/Zator 1 0,34
LTR/DIRS 1 0,34
NonLTR/CRE 1 0,34
NonLTR/I 1 0,34
NonLTR/Rex1 1 0,34
NonLTR/RTE 1 0,34
NonLTR/RTEX 1 0,34
NonLTR/Tx1 1 0,34
(24-я хромосома), 876 п.н. (X-хромосома), 871 п.н. (18-я хромосома), 857 п.н. (3-я хромосома), 832 п.н. (6-я хромосома), 829 п.н. (19-я хромосома). Наибольшую точность отжига имел фрагмент длиной 871 п.н. из 18-й хромосомы (см. табл. 2). Отметим, что при повышении температуры отжига примерно такому размеру фрагмента соответствовала зона, которая четче визуализировалась в виде кластера. Далее на электрофореграмме располагался фрагмент ~ 580 п.н. Согласно расчетам, он мог соответствовать участку длиной 585 п.н., локализованному в 1-й хромосоме (см. табл. 2).
Особый интерес представляла зона, соответствующая 550 п.н. Исходя из найденных нуклеотидных последовательностей, она, ве-
роятно, гетерогенна и включает участки из 10-й хромосомы (полная дли-
на фрагмента 572 п.н.) и X-хромосомы (полная длина 637 п.н.). В каждом из
них находились три сайта отжига праймера — по одному прямому и по два обратных. Таким образом, существует возможность амплификации как полных фрагментов (соответственно 572 и 637 п.н.), так и их коротких вариан-
50
тов (550 и 552 п.н.) (см. табл. 2). Не исключено, что по указанной причине этот участок относился к числу локусов, которые воспроизводились наиболее стабильно, хотя он и не был одним из самых яркоокрашенных.
Мажорный локус длиной около 490 п.н., по-видимому, включал фрагмент ДНК из 28-й хромосомы, имеющий длину 489 п.н. и высокую комплементарность флангов к праймеру (GA^C. Мажорная зона ~ 380 п.н. могла состоять из нескольких фрагментов: 377 п.н. (21-я хромосома), у которого последовательности флангов наиболее полно комплементарны праймеру (GA)9C, и 378 п.н. (11-я хромосома).
Таким образом, в хромосомах домашней лошади было найдено 99 фрагментов ДНК, которые потенциально могут быть амплифицированы в ПЦР с праймером (GA)9C (фрагменты с наиболее точными сайтами отжига на флангах — см. табл. 2).
Анализ нуклеотидных последовательностей в расчетных спектрах фрагментов ДНК ФИП (GA^C. Мы проанализировали 99 участков геномной ДНК лошади, фланкированных инвертированным повтором (GA)9C и потенциально способных к формированию продуктов амплификации в ПЦР с этим микросателлитом в качестве праймера, на наличие фрагментов мобильных генетических элементов (МГЭ) разных классов с помощью базы данных http://www.girinst.org (табл. 3). Оказалось, что наибольшее распространение имеют участки гомологии с эндогенными ретровирусами III класса, которые составляли приблизительно 15,93 % от общего числа всех выявленных МГЭ. На долю гомологии к эцдогенным ретровирусам I и II классов приходилось соответственно
3,05 и 2,37 %. Значительно распространенными были участки гомологии к DNA/hAT (10,85 %), NonLTR/SINE/SINE2 (10,17 %), NonLTR/L1 (9,83 %) и LTR/Gypsy (9,49 %).
Оценивая специфичность связи участков гомологии во фрагментах ДНК, фланкированных инвертированным повтором (GA^C, именно с этими МГЭ, мы выполнили поиск участков ДНК с прямыми повторами на флангах. Оказалось, что таких участков в секвенированном геноме лошади существенно больше, чем фланкированных инвертированным повтором (GA)9C (99 фрагментов).
4. Частота мобильных генетических элементов (ЧМГЭ) и доля участков гомологии к ним (ДУГ) во фрагментах ДНК, фланкированных инвертированными и прямыми повторами микросателлита (GA)9C, по сравнению с долей нуклеотидов МГЭ в секвенированном геноме (ДМГЭГ) у домашней лошади Equus caballus
Группа МГЭ | ДМГЭГ, % Инвертированные повторы Прямые повторы
ЧМГЭ, % ДУГ, % ЧМГЭ, % ДУГ, %
LINE L1 16,25 10,31 4,83 11,56 9,29
LINE CR1 0,26 5,84 4,70 6,80 2,85
SINE 2,85 9,97 4,45 13,61 5,63
LTR/Gypsy - 9,62 5,22 16,33 5,42
LTR ERV, III класс 1,82 15,81 9,55 7,48 4,17
LTR ERV, I класс 1,53 3,09 0,96 8,16 4,34
LTR ERV, II класс 0,07 2,06 0,64 1,36 0,56
DNA/hAT 1,551 11,34 5,94 3,40 0,90
Примечание. Прочерк означает отсутствие гомологии в секвенированном геноме крупного рогатого скота; 1 (в верхнем индексе) — приведены данные по геному человека (P. Arensburger с соавт. Genetics, 2011, 188: 45-57).
В секвенированной ДНК лошади спектр участков с прямыми повторами (GA)9C, имеющих гомологию к различным типам МГЭ, существенно отличался от представленного выше (см. табл. 3) по частоте областей гомологии к эцдогенным ретровирусам III класса и DNA/hAT (табл. 4).
51
Интересно отметить, что по нашим данным доля нуклеотидов, приходящихся на области гомологии к эндогенным ретровирусам и особенно к ДНК транспозонов, выше полученной для секвенированного генома домашней лошади (5) (см. табл. 4). Таким образом, можно ожидать, что инвертированные повторы микросателлита (GA^C наиболее тесно ассоциированы с участками гомологии к эндогенным ретровирусам III класса, LINE_L1 и DNA/hAT, поскольку в этих участках их доля выше, чем в се-квенированном геноме крупного рогатого скота.
5. Предполагаемые рекомбинационные характеристики мобильных генетических элементов (МГЭ) в секвенированных последовательностях генома домашней лошади Equus caballus, соответствующих полиморфным и консервативным фрагментам ДНК в ISSR-PCR
Число, размер, Частота образования
Длина PIC локализация уча- Потенциальные участки рекомбинаций квадруплексов (не пе-
фрагмента стка, совпадаю- с МГЭ/повторы/класс рекрывающиеся/пере-
щего по длине крывающиеся)
Полиморфные локусы
980 п.н. 0,49 1 (986 п.н., DNA transposon/hAT/MER103C 3 (G-Score = 11, 13, 14)/
23-я хромосома) 14 (G-Score = 8, 9, 11, 13, 13, 7, 7, 7, 6, 7, 14, 14, 10, 11)
7401 п.н. 0.291 1 (739 п.н, Non-LTR Retrotransposon/L1/L1-8_GM 2 (G-Score = 4, 20)/1
16-я хромосома) Endogenous Retrovirus/ERV3/MLT1G2 2 (G-Score = 3, 4, 2, 3, 4, 4,
Endogenous Retrovirus/ERV3/MLT1F1 Endogenous Retrovirus/ERV3/MLT2B2 5, 5, 20, 20, 19, 20)
550 п.н. 0,29 2 (637 п.н., 637 п.н.:
Х-хромосома; LTR Retrotransposon/Gypsy/Gypsy-53 PM-LTR 1 (G-Score = 12)/
572 п.н., Non-LTR Retrotransposon/L1/L1M6_5end 2 (G-Score = 11, 12)
10-я хромосома) 572 п.н.: DNA transposon/Mariner/Tc1/MamRep137 2 (G-Score = 12, 34)/
Endogenous Retrovirus/ERV3/LTR33A 438 (G-Score = 4815 —
Endogenous Retrovirus/ERV3/LTR33 суммарный)
500 п.н. 0,44 1 (494 п.н., DNA transposon/hAT/MER45C 1 (G-Score = 19)/
1-я хромосома) Консервативные локусы 46 (G-Score = 563 — суммарный)
900 п.н. 0 1 (900 п.н., DNA transposon/hAT/Homo5 2 (G-Score = 16, 8)/
24-я хромосома) DNA transposon/Dada/Dada-1 CSa) 3 (G-Score = 16, 15, 8)
580 п.н. 0 1 (585 п.н., 0 2 (G-Score = 18, 18)/
1-я хромосома) 14 (G-Score = 17, 18, 16, 17, 13, 14, 17, 11, 18, 12, 4, 13, 14, 18)
490 п.н. 0 1 (489 п.н., 0 2 (G-Score = 15, 12)/
28-я хромосома) 10 (G-Score = 14, 15, 13, 8, 10, 9, 7, 9, 8, 12)
380 п.н. 0 2 (377 п.н., 377 п.н.:
21-я хромосома; DNA transposon/Tigger1B Crp 1 (G-Score = 17)/
378 п.н., 33 (G-Score = 410 — сум-
11-я хромосома) 378 п.н.: марный)
Endogenous Retrovirus/ERV3/MLT1C1 1 (G-Score = 10)/ 2 (G-Score = 10, 10)
Примечание. PIC — индекс полиморфного информационного содержания локуса, G-Score — баллы вероятности формирования G4 (рассчитаны по программе QGRS, цифрами указано число потенциальных G4). В качестве праймера использована последовательность (GA)9C; 1 (в верхнем индексе) — данные, опубликованные ранее (5).
Мы детально проанализировали по четыре предполагаемые последовательности для полиморфных и консервативных локусов, исходя из данных о секвенированных участках генома с наиболее высокой точностью отжига праймера, близких по длине соответствующим фрагментам амплификации (см. табл. 2, 5). В результате в четырех полиморфных локусах выявили 11 участков мобильных элементов, из которых к ретротранс-позонам (мобильные элементы I класса) относятся 8, то есть 73 % от числа областей гомологии к разным МГЭ. Почти половина из этих 11 уча-
52
стков (45 %) приходилась на долю эндогенного ретровируса III класса ERV3, тогда как на транспозоны II класса (ДНК-транспозоны) — всего 23 %. В отношении консервативных фрагментов ДНК были обнаружены только четыре участка гомологии с МГЭ, причем три из них — с ДНК-транспозонами (МГЭ II класса). То есть в геноме домашней лошади в полиморфных ISSR-PCR маркерах, выявляемых с (GA)9C в качестве праймера, по сравнению с консервативными с относительно повышенной вероятностью могут присутствовать участки гомологии к ERV III класса. Напомним, что эндогенные ретровирусы млекопитающих подразделяются на три класса в зависимости от их происхождения от экзогенных ретровирусов, которое оценивается на основании гомологии последовательностей. Для ERV I класса предполагается тесная связь c ретровирусами Gammaretrovirus и Epsilonretrovirus, для ERV II класса — с Alpharetro-virus, Betaretrovirus, Deltaretrovirus и Lentivirus, для ERV III класса — с Spumavirus (9).
На 1000 п.н. в расчетных участках ДНК, фланкированных инвертированным повтором (GA)9C и соответствующих по длине полиморфным фрагментам ДНК при использовании этого микросателлита в качестве праймера в ПЦР, приходилось 1,5 участка различных МГЭ. Только в двух фрагментах из 99 исследованных отсутствовали области гомологии к МГЭ. Иными словами, плотность локализации участков гомологии к МГЭ во фрагментах, фланкированных инвертированным повтором (GA^C, существенно выше прогнозируемой на основании распространенности таких участков в геноме лошади (5). Полученные данные свидетельствуют о том, что большинство ISSR-PCR маркеров представлены фрагментами ДНК, сформированными при рекомбинациях между различными МГЭ. Это соответствует результатам секвенирования фрагментов ДНК лошади и крупного рогатого скота, фланкированных инвертированным повтором последовательности (GA^C, которые мы получили ранее (10, 11).
Возможные причины неполного совпадения экспериментальных и расчетных спектров для фрагментов ДНК ФИП (GA)9C. Следует отметить, что в силу различных причин полученные экспериментальные спектры фрагментов геномной ДНК не всегда полностью соответствуют теоретически ожидаемым. Например, существует вероятность того, что секвенированные области не включали анализируемый участок либо сам сиквенс оказался неполным (известно, что теломерные и центромерные повторы иногда секвенируются частично) и/или содержал ошибки. Локус может быть связан с Y-хромосомой лошади, сек-венированная последовательность которой не представлена в базе данных (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Дополнительными факторами, вероятно, служат структурные особенности района геномной ДНК, в которой локализован фрагмент с инвертированным повтором микросателлита на флангах.
Наши расчетные данные поиска последовательностей ДНК тоже не всегда совпадали с результатами ПЦР-амплификации. В частности, возникали затруднения при выявлении фрагментов с длиной менее 350 п.н. на электрофореграммах, тогда как в расчетных спектрах их находили.
Кроме того, что одна часть данных по полилокусному генотипиро-ванию домашней лошади была получена нами при использовании лиофи-лизированных ПЦР-наборов PCR Core («Биоком», Россия), другая — с помощью набора ПЦР-РВ («Синтол», Россия), состоящего из жидких реагентов. Генотипируя одних и тех же животных с применением в ПЦР одного и того же праймера, мы регистрировали неодинаковые спектры, ха-
53
рактерные для каждого из наборов (см. рис.). Причина различий заключалась в лиофилизированной Taq-полимеразе, при применении которой предпочтительно воспроизводилась более «легкая» часть спектра и происходило не только общее снижение числа локусов, но и превращение некоторых минорных фрагментов ДНК в мажорные. При добавлении в реакцию жидкой полимеразы фирмы «Синтол» или «СибЭнзим» (данные не представлены) спектр полностью восстанавливался. Очень важным представляется то обстоятельство, что точность отжига праймера, по-видимому, не играет в этом процессе определяющей роли. Подтверждением тому служит полное отсутствие в спектрах с лиофилизированной Taq-полимеразой фрагмента 877 п.н. с самыми точными сайтами отжига среди всех найденных последовательностей, при этом некоторые локусы, имеющие даже большую длину, воспроизводились стабильно (см. рис., Б).
В спектре ампликонов, полученных с лиофилизированной Taq-полимеразой, обнаруживался минорный компонент длиной примерно 310 п.н., для которого также было найдено соответствие в сиквенсах хромосом (см. табл. 2). При использовании набора ПЦР-РВ выявить этот фрагмент не удалось. В то же время с помощью набора ПЦР-РВ при повышении температуры отжига из кластера 800-900 п.н. выделялся локус размером 880 п.н., что соответствует расчетному фрагменту ДНК длиной 877 п.н., имеющему на флангах последовательности с высокой комплементарностью к праймеру (GA)9C.
Неканонические структуры ДНК в расчетных и экспериментальных спектрах фрагментов ДНК ФИП (GA^C. Как от-
6. Характеристика потенциальных шпилечных мечаёось, причинсш нетол-структур во фланкированных инвертирован- ного совпадения расчетных ным повтором (GA)9C последовательностях и экспериментальных спек-секвенированного генома у домашней лошади тров ISSR-PCR маркеров мо-Equus caballus гут быть особенности внут-
ренней структуры анализируемых фрагментов ДНК, в частности предрасположенность к формированию неканонических вторичных структур. Само их присутствие на флангах инвертированного повтора микросателлита свидетельствует о вероятности образования шпилек, что может способствовать повышению геномной нестабильности в таких участках (4). В этой связи мы проанализировали возможности для формирования шпилек (длиной не менее 8 п.н.) и G4 квадруплексов (структурные элементы с повышенной термоустойчивостью, образующие четырехцепочечные структуры, в которых гуанины формируют плоскость благодаря поперечным связям) внутри ампликонов (12). Рассмотрены связи между плотностью локализации таких структур в расчетных спектрах и полиморфизмом фрагментов ДНК соответствующей длины в экспериментальных спектрах у лошадей (см. табл. 5, 6).
Длина локуса, п.н. Длина фрагмента, п.н. Хромосома Число шпилек внутри локуса Доля G-C пар в возможных шпильках, %
900 900 24-я 7 25,0-2,5
800-900 876 Х 9 0-50,0
800-900 871 18-я 4 25,0-100
800-900 857 3-я 1 62,5
800-900 832 6-я 4 50,0-62,5
800-900 823 19-я 2 37,5
550 637 (552) Х 5 22,2-50,0
550 572 (550) 10-я 1 37,5
500 494 1-я 1 37,5
490 489 28-я 4 37,5-75,0
380 378 11-я 1 50,0
380 377 21-я 0 -
360 (370) 364 5-я 0 -
310 309 5-я 0 -
Примечание. Представлены данные для локусов длиной до
2000 п.н., соответствующих по размеру фрагментам ДНК, ам-
плифицированным в ISSR-PCR с последовательностью (GA)9C в
качестве праймера. Прочерки означают отсутствие таких после-
довательностей. Минимальное число спаренных формирования шпилек — 8. оснований для
54
Оказалось, что в последовательности длиной 877 п.н., локализованной в Х-хромосоме, выявлялось 9 достаточно крупных шпилек, что больше, чем во всех остальных участках (для анализа использовали олигокалькулятор (http://www.bio.bsu.by/molbiol/oligocalc.html). В последовательности длиной 871 п.н. из 18-й хромосомы обнаружились 4 потенциальные шпильки. Важно подчеркнуть, что в экспериментальных спектрах участки близкой длины выявлялись только при использовании набора ПЦР-РВ. В то же время для наиболее воспроизводимых в разных условиях ПЦР фрагментов ДНК была характерна пониженная частота таких последовательностей. Например, фрагмент длиной 380 п.н. имел всего одну шпильку, причем в наиболее близком по длине фрагменте длиной 377 п.н. (21-я хромосома) потенциальные шпильки отсутствовали. Не имела потенциальных шпилек и нуклеотидная последовательность минорного локуса длиной 310 п.н. (309 п.н., 5-я хромосома), амплифицуруемого в эксперименте при использовании лиофилизированной Taq-полимеразы. Полученные данные позволяют предполагать, что предрасположенность к формированию вторичных структур может влиять на воспроизводимость фрагментов ДНК в разных условиях ПЦР.
Известно, что G4 квадруплексы тесно связаны с возникновением двуцепочечных разрывов ДНК (DSBs) (13). Имеются данные, свидетельствующие о выраженных ассоциациях между наличием G4 квадруплексов и двуцепочечными разрывами ДНК (DSBs) в митотических и мейотических клетках (14). В этой связи мы сопоставили частоту потенциальных G4 квадруплексов в расчетных спектрах секвенированных нуклеотидных последовательностей, близких по длине к консервативным и полиморфным фрагментам ДНК из экспериментальных спектров ISSR-PCR маркеров (http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/index.php). При этом выраженных различий мы не обнаружили (см. табл. 5, 6). В обеих группах G4 квадруплексы встречались примерно с равной частотой (около 3,4 потенциального G4 квадруплекса на 1000 п.н.). Тем не менее, один из расчетных участков, по длине наиболее близкий к высокополиморфному в экспериментальных спектрах фрагменту ДНК длиной 550 п.н., проявлял выраженную предрасположенность к формированию таких структур (см. табл. 5). Более того, в геноме человека, например, аналогичные последовательности в среднем встречаются с частотой примерно 0,125 потенциального G4 квадруплекса на 1000 п.н. (15). В полученных нами расчетных последовательностях ампликонов ISSR-PCR спектра по праймеру (GA^C эта цифра примерно в 27 раза больше, что может свидетельствовать о повышенной частоте локализации G4 квадруплексов в участках генома, расположенных между инвертированными повторами микросателлитов.
Итак, у домашней лошади инвертированные повторы микросател-литных локусов, фланкирующие участки ДНК длиной до 2000 п.н. (ISSR-PCR маркеры), преимущественно сформировались в результате сложных рекомбинационных событий между мобильными генетическими элементами, принадлежащими к разным классам транспозонов. Полиморфные ампликоны ДНК, фланкированные инвертированным повтором (GA)9C, которые по длине близки к обнаруженным в секвенированных геномных последовательностях, могут содержать больше участков гомологии с рет-ротранспозонами (в частности, с последовательностями эндогенного ретровируса III класса — ERV III), чем консервативные фрагменты. Наличие в ISSR-PCR маркере продуктов рекомбинаций с ретротранспозонами (в отличие от ДНК-транспозонов), по всей видимости, ассоциировано с по-
55
вышенным полиморфизмом этого геномного участка. Образование вторичных структур внутри последовательности ДНК, фланкированной инвертированным повтором микросателлита, способно повлиять на воспроизводимость полилокусного генотипирования по ISSR-PCR маркерам. В участках геномной ДНК длиной до 2000 п.н., фланкированных инвертированным повтором (GA)9C, обнаруживается повышенная плотность нуклеотидных последовательностей, потенциально предрасположенных к формированию G4 квадруплексов, что, вероятно, может быть обусловлено повышенной активностью рекомбинаций в этих участках.
ЛИТЕРАТУРА
1. Глазко В.И., Гладырь Е.А., Феофилов А.В., Бардуков Н.В., Глаз-к о Т.Т. ISSR-PCR маркеры и мобильные генетические элементы в геномах сельскохозяйственных видов млекопитающих. Сельскохозяйственная биология, 2013, 2: 71-75 (http://www.agrobiology.ru/2-2013glazko-eng.html).
2. Глазко В.И., Феофилов А.В., Бардуков Н.В., Глазко Т.Т. Видоспецифичные ISSR-PCR-маркеры и пути их формирования. Известия ТСХА, 2012, 1: 118-125.
3. Зыбайлов Б.Л., Глазко В.И. Геномная нестабильность и неканонические структуры ДНК. Известия ТСХА, 2012, 5: 108-122.
4. The state of the world’s animal genetic resources for food and agriculture /B. Rischkowsky,
D. Pilling (eds.). FAO, Rome, 2007.
5. Феофилов А.В., Бардуков Н.В., Глазко В.И. Дифференциация генофондов алтайской и рысистых пород лошадей по ISSR-PCR маркерам. Генетика, 2011, 37(9): 1230-1235.
6. Caetano-Anoll e s G., Gresshoff P.M. Generation of sequence signatures from DNA amplification fingerprints with mini-hairpin and microsatellite primers. Biotechniques, 1996, 20(6): 1044-1048.
7. Caetano-Anoll e s G., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting using arbitrary mini-hairpin oligonucleotide primers. Biotechnology, 1994, 126(6): 619-623.
8. Capra J.A., Paeschke K., Singh M., Zakian V.A. G-Quadruplex DNA sequences are evolutionary conserved and associated with distinct genomic features in saccharomyces cerevisiae. PLoS Comput. Biol., 2010, 6(7): 1-13.
9. Cook G.W., Konkel M.K., Major III J.D., Walker J.A., Han K., Bat-zer M.A. Alu pair exclusions in the human genome. Mobile DNA, 2011, 2: 10 (http://www.mobilednajournal.com/content/2/1/10).
10. Garcia-Etxebarria K., Jugo B.M. Genome-wide detection and characterization of endogenous retroviruses in Bos taurus. J. Virol., 2010, 84: 10852-10862.
11. Greaves M., Maley C.C. Clonal evolution in cancer. Nature, 2012, 481(7381): 287-294.
12. Mei L., Ding X., Tsang S.-Y., Pun F.W., Ng S.K., Yang J., Zhao C., Li D., Wan W., Yu C.H., Tan T.C., Poon W.S., Leung G.K., Ng H.K., Zhang L., Xue H. AluScan: a method for genome-wide scanning of sequence and structure variations in the human genome. BMC Genomics, 2011, 12: 564 (http://www.biomedcentral.com/1471-2164/12/564, doi: 10.1186/1471-2164-12-564).
13. S h a r m a S. Non-B DNA secondary structures and their resolution by RecQ helicases. Journal of Nucleic Acids, 2011, 2011: Art. ID 724215 (doi: 10.4061/2011/724215).
14. Wade C.M., Giulotto E., Sigurdsson S., Zoli M., Gnerre S., Imsland F., Lear T.L., Adelson D.L., Bailey E., Bellone R.R., Bl o cker H., Distl O., Edgar R.C., Garber M., Leeb T., Mauceli E., MacLeod J.N., Penedo M.C., Raison J.M., Sharpe T., Vogel J., Andersson L., Antczak D.F., Biagi T., Binns M.M., Chowdhary B.P., Coleman S.J., Della Valle G., Fryc S., Gu e rin G., Hasegawa T., Hill E.W., Jurka J., Kiialainen A., Lindgr-en G., Liu J., Magnani E., Mickelson J.R., Murray J., Nergadze S.G., Onofrio R., Pedroni S., Piras M.F., Raudsepp T., Rocchi M., R 0 ed K.H., Ryder O.A., Searle S., Skow L., Swinburne J.E., Syv a nen A.C., Tozaki T., Va l b e r g S.J., Va u d i n M., W h i t e J.R., Z o d y M.C. Genome sequence, comparative analysis, and population genetics of the domestic horse. Science, 2009, 326(5954): 865-867.
15. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by seguence repeat (SSR) anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, 1994, 20: 176-183.
1ФГБОУ ВПО Российский государственный Поступила в редакцию
аграрный университет—МСХА им. К.А. Тимирязева, 31 марта 2014 года
127550 Россия, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, e-mail: [email protected];
56
2ГНУ Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий,
127422 Россия, г. Москва, ул. Костикова, 12, стр. 4, e-mail: [email protected]
ISSR-PCR MARKERS AND MOBILE GENETIC ELEMENTS IN HORSE (Equus caballus) GENOME
N.V. Bardukov1, AV. Feofilov1, T.T. Glazko1, 2, V.I. Glazko1, 2
1K.A. Timiryazev Russian State Agrarian University, 49, ul. Timiryazeva, Moscow, 127550 Russia, e-mail vglazko@ yahoo.com;
2Center for Experimental Embryology and Reproductive Biotechnology, str. 4, 12, ul. Kostyakova, Moscow, 127422 Russia, e-mail [email protected]
Received March 31, 2014 doi: 10.15389/agrobiology.2014.4.42eng
Abstract
The patterns and causes of the differences in the polymorphism of individual microsatellites, and species specificity of this variability are still not enough studied. Test systems developed by the International Association of Animal Genetics (ISAG) for genetic certification of agricultural animals, assessment of interbreed relations, the level of animal group consolidation, include a small number of genetic markers. The use of microsatellite loci fragments as PCR primers for polylocus genotyping and genome scan of agricultural animal species is more simple and effective methodical approach. We proposed a method for identifying positioning of microsatellite inverted repeat areas in genome sequences and for comparisons of this calculated areas to experimental DNA spectra amplified in PCR with the use of microsatellite loci as primers (ISSR-PCR markers). Here we report the results of the comparisons carried out for domestic horses (Equus caballus) of Altai breed (n = 96), Trotter breed (n = 48), Karachai breed (n = 34). The DNA fragments (99 sites) in the sequenced genome of the domestic horse, flanked by inverted repeat (GA)9C, were revealed and the presence of homologous sequences to mobile genetic elements was analyzed. The nucleotide sequences were examined in the DNA fragments (expected size/obtained size) of different location: 1250-1350/1326 bp (chromosome 17), 1250-1350/1302 bp (chromosome 2), 1250-350/1296 bp (X-chromosome), 1250-1350/1287 bp (chromosome 20), 980/986 bp (chromosome 23), 800-900/900 bp (chromosome 24), 800-900/876 bp (X-chromosome), 800-900/871 bp (chromosome 18), 800-900/857 bp (chromosome 3), 800-900/832 bp (chromosome 6), 800-900/823 bp (chromosome 19), 740/739 bp (chromosome 16), 580/585 bp (chromosome 1), 550/637 bp (X-chromosome), 550/572 bp (chromosome 10), 500/494 bp (chromosome 1), 490/489 bp (chromosome 28), 380/378 bp (chromosome 11), 380/377 bp (chromosome 21), 360 (370)/364 bp (chromosome 5), 310/309 bp (chromosome 5). The PIC (polymorphic information content) values for loci were calculated. In the representatives of several breeds, the conservative and polymorphic DNA fragments were observed in the amplification product spectra obtained in the polymerase chain reaction with a primer sequence (GA)9C. It was turned out that the polymorphous DNA fragments in different animals, in most cases, contained the homologous sequences to fragments of retrotransposons (to ERV III, particularly), while the conservative ones contained homologous sequences to DNA transposons. An increased density of nucleotide sequences, potentially prone to the G4 quadruplex formation, was observed in the studied horse genomic DNA fragments, flanked by the inverted repeat (GA)9C, that could be associated with an increased recombination in these areas. A secondary structure in the DNA regions flanked by a microsatellite repeat can influence the results of genotyping in case the ISSR-PCR markers are used. The data obtained suggest the relationship between the polymorphism of DNA fragments, flanked by inverted repeats of microsatellites, and a mobility of retrotransposons.
Keywords: ISSR-PCR, anonymous DNA markers, Equus caballus, DNA transposons, retrotransposons, noncanonical DNA structures.
Новые книги
Студенцов А.П., Шипилов В.С., Никитин В.Я. и др. Акушерство, гинекология и биотехника репродукции животных.
М.: изд-во «КолосС», 2012, 439 с.
Рассмотрены анатомия и физиология органов размножения, способы осеменения животных, физиология и патология беременности, родов и послеродового периода. Изложены вопросы иммунологических взаимоотношений при оплодотворении и бере-
менности, взаимосвязи нервной, эндокринной и иммунной систем в регуляции гомеостаза. Даны сведения по акушерской терапии, болезням молочной железы, гинекологии домашних животных. Внесены изменения и дополнения в разделы трансплантации зародышей, физиологии размножения пушных зверей, импотенции производителей, профилактики бесплодия животных и т.д. Для студентов вузов, обучающихся по специальностям «Ветеринария» и «Зоотехния».
57
