CC BY
16УДК 544.355-122:547.466
В.Г. Баделин, Е.А. Венедиктов, В.П. Баранников
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КОФЕРМЕНТА ПИРИДОКСАЛЬ-5'-ФОСФАТА С L-ЛИЗИНОМ В ВОДНОМ БУФЕРНОМ РАСТВОРЕ
(Институт химии растворов РАН, г Иваново) E-mail: [email protected]
Спектрофотометрическим методом изучено взаимодействие пиридоксаль-5-фосфата с L-лизином в водном буферном растворе при pH=7,35. Показано, что взаимодействие является многостадийным процессом, приводящим к образованию основания Шиффа. Определены энергия активации процесса и константа взаимодействия.
Пиридоксаль-5'-фосфат является обязательным компонентом активного центра многих ферментов в реакциях метаболизма аминокислот. Известно, что во всех пиридоксальфосфатзависи-мых реакциях аминокислот начальным этапом является образование основания Шиффа. При протекании данной реакции in vitro выделяют несколько стадий процесса: разрыв внутримолекулярной водородной связи (кето-енольная таутомерия) [1], образование промежуточного продукта -карбиноламина [2] и, наконец, образование основания Шиффа [3]. Особенностью реакции с лизином является участие аминогруппы в е-положении в отличие от а-аминокислот.
(OH)2POH2q
н O
HO
(OH)2POH2qi
XNH3+ HO ^NH(CH2)4qH
(OH)2POH2q
+ +Lys":
k2 _ (OH^OHC.
N
XNH3" HO 7NH(CH2)4qH NqH XCOO"
+
(OH)2POH2q
OH
k3 , (OH)2POH2qi
N
XNH3+ xN(CH2)4qH qH NqOO"
OH
(1)
(2)
(3)
В данной работе изучено взаимодействие пиридоксаль-5'-фосфата (ПОФ) с L-лизином в фосфатном буферном растворе с pH=7,35 методом спектрофотометрии в видимой и УФ - областях спектра.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали реактивы фирмы Sigma: пиридоксаль - 5 - фосфат с долей основного вещества 0,97 и L-лизин (0,98), осушенные в вакууме. Водный буферный раствор с концентрацией Na2HPO4 0,25488 моль/л и 0,18793 моль/л NaH2PO4 обеспечивал постоянство кислотности среды pH=7,35 в условиях эксперимента. Спек-
тральные исследования были проведены в интервале температур от 12,5 до 60°С (± 0,3°С). Концентрация ПОФ в растворе составляла 7,8-10- 5 моль/л, максимальная концентрация лизина не превышала 156,4-10- 5 моль/л. Зависимость выхода основания Шиффа от концентрации лизина измеряли через 12 часов после приготовления растворов при комнатной температуре (20оС). Измерение скорости накопления основания Шиффа проводили в зависимости от температуры через 100 - 200 с после смешения термостатированных растворов ПОФ (3,89-Ш-4 моль/л) и лизина (4,89-10- 4 моль/л) в объемах 0,5 и 2,0 мл соответственно.
Электронные спектры поглощения записывали на двухлучевом спектрофотометре SPECORD - M 40 в интервале длин волн от 337 до 600 нм с использованием кювет из кварца размером 1^1 см. Изменение разностного электронного спектра поглощения во времени проводили через 20 с после смешения растворов. Время сканирования одного спектра составляло около 90 с.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Измерения электронных спектров поглощения показали, что при комнатной температуре первая полоса пиридоксаль-5'-фосфата (ПОФ) в водном буферном растворе при рН 7,35 имеет максимум поглощения при 387 нм и характеризуется коэффициентом экстинкции 5180 см-1-л-моль-1. Согласно результатам работы [4], ее можно соотнести с поглощением биполярного иона или аниона ПОФ. С ростом температуры эта полоса претерпевает незначительные и полностью обратимые изменения, которые проявляются в бато-хромном сдвиге максимума поглощения до 389 нм при 60°С, в ее уширении и падении интенсивности.
В присутствии лизина полоса поглощения ПОФ претерпевает батохромный сдвиг, сопровождающийся падением ее интенсивности. Наблюдаемые изменения зависят от концентрации ами-
нокислоты (рис. 1). Интересно отметить, что при увеличении концентрации лизина до ~ 40-10- 5 моль/л эти изменения протекают с сохранением изобестических точек, которые нарушаются при дальнейшем увеличении содержания аминокислоты.
к снижению энергии электронного перехода в таких молекулах. Отсюда очевидно, что образование основания Шиффа является следствием взаимодействия равновесной «открытой» формы ПОФ с лизином.
Рис.1. Электронный спектр поглощения пиридоксаль-5'-фосфата в отсутствие (1) и в присутствии 19.5 • 10 - 5 (2), 39.1 • 10 - 5 (3) и 156.4 • 10 - 5 (4) моль/л L-лизина в фосфатном буферном растворе. Fig. 1. Electronic absorption spectrum of pyridoxal-5'-phosphate in the absence (1) and in the presence of L-lysine at concentrations of 19.5 • 10 - 5 (2), 39.1 • 10 - 5 (3) и 156.4 • 10 - 5 (4) mol/L.
По мере возрастания температуры наблюдаются изменения в спектрах поглощения, качественно аналогичные случаю ПОФ в отсутствие аминокислоты, однако имеющие более выраженный характер. Другой особенностью является частичная обратимость этих изменений. Эти данные свидетельствуют, что между ПОФ и лизином имеет место образование устойчивого продукта.
В разностных спектрах поглощения, записанных с кюветой сравнения, заполненной раствором ПОФ (рис. 2), по мере возрастания добавок лизина наблюдается убыль поглощения в полосе ПОФ и одновременное появление поглощения с максимумом при 430 нм, которое устойчиво в течение нескольких дней. По данным [3,5] эти изменения указывают на образование основания Шиффа (равновесия (2) и (3)). При этом обнаружено, что полоса при 374 нм (рис. 2) сдвинута в коротковолновую область относительно максимума поглощения раствора ПОФ на 13 нм (рис. 1). Эти данные указывают на присутствие в растворе различных состояний, указанных в равновесии (1). Этот вывод находится в согласии с результатами работ [1,6]. Известно также, что образование внутримолекулярной водородной связи приводит
Рис. 2. Разностные электронные спектры поглощения растворов пиридоксаль-5'-фосфата при различных добавках L-лизина: 7,8 • 10-5 (1), 19.5 • 10 - 5 (2), 39.1 • 10 - 5 (3), 78.2 • 10 - 5
(4), 117.3 • 10 - 5 (5) и 156.4 • 10 - 5 (6) моль/л при 20оС. Fig. 2. Differential electronic absorption spectra of pyridoxal-5'-phosphate solution at various concentrations of L-lysine: 7,8 • 10-5 (1), 19.5 • 10 - 5 (2), 39.1 • 10 - 5 (3), 78.2 • 10 - 5 (4), 117.3 • 10 - 5 (5) и 156.4 • 10 - 5 (6) mol/L and 200C.
AD374 0.04 -
0.03 -
0.02
0.01 -
0.00 -
0.00 0.04 0.08
Рис.3. Зависимость D430 от D374 в фосфатном буферном растворе ПОФ в присутствии различных добавок L-лизина при 20оС.
Fig.3. The dependence of D430 on D374 for phosphate buffer solution of pyridoxal-5'-phosphate.
The concentrations are the same as in Fig. 2.
Для определения константы взаимодействия и выхода реакции образования основания Шиффа были использованы разностные спектры поглощения. Как видно из рис. 3, значения D374 и D430 связаны между собой линейным соотношением. Угол наклона этой зависимости равен 0,35 ± 0,2. Согласно закону Ламберта - Бугера - Бера, он связан с отношением молярных коэффициентов экстинкции в максимумах этих полос (г374/г430).
Принимая для s
374
387
найдем s
430
14800
s
см1 л моль1. Используя эту величину, из спек-трофотометрических данным определены равновесные концентрации основания Шиффа. При концентрациях ПОФ и лизина, равных 7,8-10-5 и 156,410-5 моль/л соответственно, она составляет 8,4-10-6 моль-л-1 или 10 % в пересчете на концентрацию ПОФ. Отсюда следует, что константа взаимодействия равна 77 л-моль-1.
Полученные результаты об изменении разностного спектра поглощения во времени, представленные на рис. 4, свидетельствуют об образовании короткоживущего (до 300 с) интер-медиата с максимумом поглощения в области 400 нм. В дальнейшем это поглощение исчезает, а вслед за ним появляется более длинноволновое поглощение, характерное для основания Шиффа. Эти данные подтверждают наличие промежуточного соединения - карбиноламина (уравнение (2)) [2], предшествующего образованию основания Шиффа.
Рис. 4. Изменения разностного спектра поглощения раствора пиридоксаль-5'-фосфата в присутствии 39,1 • 10-5 моль/л L-лизина во времени при 17°С: 1 - 300, 2 - 480, 3 - 680, 4 - 885 секунд.
Fig.4. Changes of differential electronic absorption spectrum of pyridoxal-5'-phosphate solution at the 39.1 • 10-5 concentration of L-lysine over the time at 17°C: 1 - 300, 2 - 480, 3 - 680, 4 - 885 seconds.
Скорость образования основания Шиффа (уравнения (1)-(3)) заметно падает с понижением температуры (рис. 5). Энергия активации этого процесса, рассчитанная по начальным участкам кинетических кривых в приближении уравнения Аррениуса [7], равна 52,3 кДж/моль.
A D 0.050.04 0.03 0.020.01 -
0.000 200 400 600 800 1000 1200
I, с
Рис.5. Изменение оптической плотности во времени для полосы поглощения основания Шиффа в растворе пиридоксаль-5-фосфата в присутствии лизина при различных температурах.
Fig.5. Kinetics of the Shiff base band absorbance in the solution of the pyridoxal-5'-phosphate at the L-lysine presence at various temperatures.
На основании полученных данных можно заключить, что исследованный процесс образования основания Шиффа связан со свойствами «открытого» равновесного состояния пиридоксаль-5-фосфата и протекает как двухступенчатая реакция, имеющая положительный температурный коэффициент.
Авторы выражают благодарность РФФИ и правительству Ивановской области за финансовую поддержку данной работы, грант РФФИ 06-03-96312-р_центр_а.
ЛИТЕРАТУРА
1. Diaz I. et al. J. Mol. Structure (Teochem). 1998. V. 433. P. 279-290.
2. Jencks W. P. In: Catalysis in Chemistry and Enzymology. New York: McGraw-Hill. 1969.
3. M. Angees Garcia del Vado et al. J. Mol. Catalysis A: Chemical. 1997. V. 123. P. 9-13.
4. Морозов Ю. В. Журн. прикл. спектроскопии. 1980. Т.32. Вып. 6. С.1030 - 1035.
5. Mahon M. M. et al. Federation of European Biochemical Societies Letters. 1998. V. 427. P. 74-78.
6. Bartl F., Urjasz H., Brzezinski B. J. Mol. Struct. 1998. V. 441. P. 77 - 82.
7. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М.: Мир. 1978. 541 с.
