CC BY
30
ПРЕПАРАТЫ
S Исследование возможности индукции
£ рекомбинантными аденовирусными
£ векторами гетеросубтипического
| иммунного ответа против вируса гриппа А
•О
^ Шмаров М.М., Седова Е.С., Верховская Л.В., Богачева Е.А., Барыкова Ю.А., Щербинин Д.Н.,
Св Лысенко А.А., Тутыхина И.Л., Неугодова Г.Л., Логунов Д.Ю., Смирнов Ю.А., Народицкий Б.С.,
5 Гинцбург А.Л.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт им.
S почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития
^ Российской Федерации, Москва, [email protected]
О
Studying the opportunity of recombinant adenoviral vectors heterosubtypical immune response induction against influenza A virus
Shmarov M.M., Sedova E.S., Verkhovskaya L.V., Bogacheva E.A., Barykova Y.A., Scherbinin D.N., Lysenko A.A.,TutykhinaI.L., Neugodova G.L., LogunovD.Y.,Smirnov Y.A., Narodizkiy B.S., GinzburgA.L.
Federal State Budgetary Institution «Gamaleya Scientific Research Institute» of The Ministry of Health and Social Development of The Russian Federation, Moscow, [email protected]
Для обеспечения защиты от вируса гриппа А созданы рекомбинантные аденовирусные векторы, несущие гены гемагглютининов вирусов гриппа птиц субтипа H5. На мышах линии BALB/c было показано, что интраназальная иммунизация рекомбинантными аденовирусами индуцирует протектив-ный иммунный ответ, защищающий мышей не только от летальной дозы вируса гриппа H5 другого субтипа, но и от летальной дозы вирусов гриппа подтипа H1 и H2, относящихся к тому же клайду, что и H5. Однако иммунизация не обеспечивает защиту мышей против вируса гриппа подтипа H3, относящегося к другому клайду. Показано что наличие предсуществующего иммунного ответа на аденовирус не существенно влияет на эффективность интраназальной иммунизации. Ключевые слова: аденовирус, генетическая иммунизация, гемагглютинин.
Библиографическое описание: Шмаров М.М., Седова Е.С., Верховская Л.В. с соавт. Исследование возможности индукции рекомбинантными аденовирусными векторами гетеросубтипического иммунного ответа против вируса гриппа А // Биопрепараты. — 2011. — № 1. — С. 31-35.
In order to ensure protection against influenza A virus there have been developed adenoviral vectors, bearing subtype H5 avian influenza virus haemagglutinins genes. Studying mouse line BALB/c it was demonstrated that intranasal immunization with recombinant adenoviruses induces protective immune response, which protects mice not only form a lethal dose of H5 influenza virus of another subtype, but also form a lethal dose of subtypes H1 and H2 influenza viruses, related to the same clyde as H5. However the immunization does not protect the mice against subtype H3 influenza virus, realted to a different clyde. It is demonstrated that the presence of preexisting immune response against adenovirus does not significantly influence the efficacy of intranasal immunization. Key words: adenovirus, genetic immunization, haemagglutinin
Bibliographical entry: Shmarov M.M., Sedova E.S., Verkhovskaya L.V. etal. Studying the opportunity of recombinant adenoviral vectors heterosubtypical immune response induction against influenza A virus // Biopreparats (Biopharmaceuticals) — 2011. — № 1 — P 31-35.
Для корреспонденции:
Седова Е.С. — младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ
Адрес: ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ, 123098, Москва, ул. Гамалеи,18; [email protected], тел. 8(499)193-61-35. Статья поступила 21.11.2010 г, принята к печати 23.12.2010 г
Грипп — высококонтагиозное заболевание людей, ных штаммов вируса гриппа А [1, 20]. Одним из новых
птиц и млекопитающих вирусной этиологии. Для эф- подходов к вакцинации являются использование гене-
фективной борьбы с распространением вируса гриппа тических вакцин на основе вирусных векторов [11, 16].
необходимы безопасные вакцины, обеспечивающие Наиболее перспективными представляются генетиче-
гетеросубтипический иммунный ответ против различ- ские вакцины, созданные с использованием аденовиру-
С-
—март 2011 г.
са человека пятого серотипа (Ад5) [6, 7]. Иммунизация рекомбинантным Ад5 является безопасной, так как вирус содержит делетированный геном и неспособен к размножению в нормальных клетках, что подтверждено многочисленными клиническими испытаниями [9,19]. Возможно интраназальное введение аденовирусных векторов и как следствие, индукция иммунного ответа на слизистой дыхательных путей, то есть именно там, где находятся входные ворота гриппозной инфекции. Аденовирусные вектора не требуют применения адъю-вантов, так как сами являются активаторами врожденного иммунитета [12, 13].
В последние годы появились работы, согласно которым генетические вакцины на основе Ад5, несущих ген гемагглютинина вируса гриппа А, способны индуцировать перекрестный иммунитет как в пределах одного субтипа [10], так и между разными субтипами вируса, включающими один и тот же подтип гемагглютинина [18].
Такой эффект объясняется тем, что при вакцинации аденовирусными векторами, в организм вводится ген гемагглютинина вируса гриппа, эффективно экспресси-рующийся в клетке и экспонирующийся на плазматической мембране, что позволяет сохранить его нативную третичную структуру. При этом индуцируется как клеточный, так и гуморальный ответ на консервативные эпитопы гемагглютинина вируса гриппа. В 2008 г. были опубликованы данные, согласно которым вирусы гриппа по наличию высококонсервативных конформацион-ных эпитопов в составе гемагглютинина для антител широкого спектра действия можно разделить на четыре подгруппы, или клайда: Н1 (Н1, Н2, н5, Н6, Н11, Н13 и Н16 гемагглютинины), Н9 (Н9, Н8 и Н12), Н7 (Н15, Н7 и Н10) и Н3 клайд (Н3, Н14 и Н4). Антитела против антигенных детерминант вирусов одного клайда в разной степени обеспечивают нейтрализацию этих подтипов, но не обеспечивают нейтрализацию подтипов из другого клайда [17].
Нами было высказано предположение о том, что вакцинация аденовирусным вектором, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа А, может приводить к образованию антител к его консервативным эпитопам гемагглютинина, что обеспечит перекрестный иммунный ответ не только против вирусов гриппа А внутри одного подтипа, но и против вирусов гриппа А разных подтипов, относящихся к одному клайду. Поэтому цель данной работы — исследование возможности индукции рекомбинантными аденовирусными векторами гетеро-субтипического иммунного ответа против вируса гриппа А.
В работе использовались рекомбинантные аденовирусы человека пятого серотипа, несущие гены гемаг-глютининов вируса гриппа птиц Н5Ы2 и Н5Ы1. Показано, что иммунизация рекомбинантными аденовирусами обеспечивает индукцию протективного иммунного ответа, защищающего иммунизированных мышей не только от летальной дозы вируса гриппа «своего» штамма Н5, но и от летальной дозы вируса гриппа Н5 другого субтипа, а так же летальной дозы вирусов, относящихся к тому же клайду, что и Н5, но не обеспечивает протекцию мышей против вируса гриппа другого клайда.
Экспериментальная часть
ли вирусы гриппа птиц A/Mallard duck/ Pennsylvania/10218/84 (H5N2), A/black duck/New Jersey/1580/78(H2N3) вирусы гриппа человека A/ USSR/90/77 (H1N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2), адаптированные для мышей [15], любезно предоставленные проф., д.б.н. Ю.А. Смирновым (лаборатория субвирусных структур ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.М. Ивановского» Минздравсоцразвития РФ).
Получение рекомбинантного аденовируса. Рекомбинантные аденовирусы, несущие гены гемаг-глютининов вирусов гриппа птиц A/Mallard duck/ Pennsylvania/10218/84 (H5N2) и A/Duck/ Novosibirsk/56/2005 (H5N1) (Ad5-H5-2 и Ad5-H5-1, соответственно), были получены как описано ранее [3].
Определение уровня гемагглютинин-связыва-ющих антител в сыворотках крови мышей. Проводилось использованием реакции торможения гемагглютинации (РТГА), в соответствии с протоколом WH0/CDS/CRS/NCS/2002.5.
Определение уровня антител к вирусу гриппа и аденовирусу человека пятого серотипа с помощью реакции вируснейтрализации. Реакцию вирус-нейтрализации (РВН) проводили как описано ранее [4] на
Вирусы. Для инфицирования животных использова-
Рис. 1. Выживаемость и изменение веса мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ас15-НА5-2 и Ас15-НА5-1 после заражения 50 ЛД50 вируса гриппа птиц Н5Ы2 А - диаграмма выживаемости, Б - кривая падения веса.
ПРЕПАРАТЫ
линиях клеток A549 (для постановки реакции нейтрализации аденовируса человека пятого серотипа) и MDCK (для постановки реакции нейтрализации вируса гриппа А).
Определение титра IgA и IgG. Использовали метод непрямого ИФА. В качестве антигена использовали сконцентрированный в сахарозе вирус гриппа птиц А/ Mallard duck/PA/10218/84 (H5N2). Концентрацию антигена для определения уровня IgG и IgA в исследуемых образцах определяли с помощью «шахматного титрования». Для проведения реакции использовали антитела к мышиным IgA и IgG, конъюгированные с пероксидазой "Sigma" и TMB-индикаторную смесь. Оптическую плотность окрашенного продукта определяли при длине волны 450 нм.
Мыши. В работе использованы мыши линии BALB/c, весом 7-9 г самки. Все работы выполняли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Иммунизация животных. Мыши были разделены на группы (по 10 особей в группе) и иммунизированы двукратно интраназально рекомбинантными аденовирусами Ad-HA5-1 и Ad-HA5-2 в количестве 108 БОЕ/мышь. Интервал между иммунизациями составил 21 день. Контрольных групп было две: первой введен аденовирусный вектор Ad-null; второй — фосфатный буфер PBS. Через три недели после иммунизации мышей опытной и контрольных групп заражали вирусом гриппа или у них отбирали биологические жидкости для определения титра антител к вирусу гриппа.
Заражение животных. Через 21 день после иммунизации мышам под легким эфирным наркозом интраназально вводили высокую летальную дозу (50 ЛД50) вируса гриппа штаммов A/Mallard duck/ Pennsylvania/10218/84 (H5N2), или летальные дозы (10 LD50) вирусов гриппа A/USSR/90/77 (H1N1), A/black duck/New Jersey/1580/78(H2N3) и A/Aichi/2/68 (H3N2). Выживаемость и изменение веса мышей оценивали в течение 16 дней после заражения.
Результаты и обсуждение
Нами было показано, что двукратная интраназальная иммунизация лабораторных мышей рекомбинантным аденовирусом Ad5-HA5-2, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа H5N2, обеспечивает индукцию высокого уровня специфических антител к вирусу гриппа H5N2 и полную защиту мышей от заражения летальной дозой вируса H5N2 (50 ЛД50) [2, 3].
Для изучения перекрестного иммунного ответа на той же модели летальной инфекции вируса гриппа H5N2, использовали рекомбинантной аденовирус Ad5-
Рис. 2. Защита мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом Ас1-НА5-2, от заражения летальными дозами вирусов гриппа Н11\11, Н2Ы3 и Н3Ы2. А - диаграмма выживаемости, Б - кривая падения веса.
НА5-1, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц Н5Ы1. Гомология аминокислотной последовательности гемагглютининов этих вирусов гриппа составляет 94,6% (http://align.genome.jp/).
Через три недели после двукратной интраназальной иммунизации аденовирусом АС5-НА5-1 у животных отбирали кровь для определения уровня перекрестных антител к вирусу гриппа птиц Н5Ы2 методами ИФА, РТГА и РВН. Установлен высокий уровень 1дО к вирусу гриппа Н5Ы2, а так же вируснейтрализующих и гемаг-глютинин-связывающих антител, что свидетельствует
Уровень антител к вирусу гриппа H5N2 в сыворотках крови мышей, иммунизированных аденовирусом Ad-HA5-1
Группа мышей Уровень IgG к вирусу гриппа H5N2, ИФА Уровень антител к вирусу гриппа H5N2 в РВН Уровень антител к вирусу гриппа H5N2 в РТГА
Ad-null <3,3 log2 <3,3 log2 4 log2
PBS <3,3 log2 <3,3 log2 3,3 log2
Ad-HA5-1 10,5 log2 8,5 log2 9,5 log2
^Январь
-март 2011 г.
Рис. 3. Уровень вируснейтрализующих антител к аденовирусу человека пятого серотипа в сыворотках крови мышей, иммунизированных интраназально, внутримышечно и внутрибрюшинно рекомбинантным аденовирусом Ас15-пи11.
Рис. 4. Выживаемость и изменение веса мышей, имевших (Ad5-null) и не имевших (PBS) предсуществующий иммунный ответ к аденовирусу человека пятого серотипа, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом Ad5-HA5-2 и зараженных летальной дозой вируса гриппа птиц H5N2. А - диаграмма выживаемости, Б - кривая падения веса.
об индукции перекрестного гуморального иммунитета, специфичного к вирусу гриппа H5N2 (таблица).
Изучение протективных свойств аденовируса Ad5-HA5-1 так же проводили на лабораторных мышах. Через 21 день после иммунизации мыши были заражены вирусом гриппа птиц H5N2 (50 ЛД50). В качестве положительного контроля использовалась группа мышей, иммунизированная аденовирусом Ad-HA5-2. На рис. 1. представлены кривые выживаемости мышей и изменения их веса. В результате эксперимента установлено, что мыши, интраназально иммунизированные рекомби-нантным аденовирусом Ad5-HA5-1 не восприимчивы к заражению 50 ЛД50 вируса гриппа птиц H5N2.
Таким образом!, интраназальная иммунизация рекомбинантным аденовирусом, несущим гемагглютинин вируса гриппа А обеспечивает перекрестную защиту мышей против вирусов гриппа А разных субтипов, объеденных одним типом гемагглютинина.
Для проверки предположения об индукции у иммунизированных рекомбинантным аденовирусом мышей антител широкого спектра действия, способных нейтрализовать вирусы гриппа разных подтипов, относящихся к клайду H1 (H1, H2, H5, H6, H11, H13 и H16), нами были использованы вирусы гриппа A/USSR/90/77 (H1N1) и A/black duck/New Jersey/1580/78(H2N3), относящееся к данному клайду, и A/Aichi/2/68 (H3N2), не входящий в него [3]. В этом эксперименте для иммунизации мышей использовали аденовирус, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N2.
После иммунизации аденовирусом Ad5-HA5-2 мыши были заражены летальными дозами (10 LD50) вирусов гриппа A/USSR/90/77 (H1N1), A/black duck/New Jersey/1580/78 (H2N3) и A/Aichi/2/68 (H3N2). Эксперимент показал, что иммунизация животных ре-комбинантным аденовирусом Ad-HA5-2 обеспечивает протекцию мышей против заражения летальной дозой вируса гриппа А H1N1. При заражении мышей летальной дозой вируса гриппа А H2N3 выживаемость мышей составила 70%. При этом иммунизация мышей аденовирусом Ad-HA5-2 не обеспечивала защиту мышей против заражения летальной дозой вируса гриппа А H3N2: иммунизированные мыши показали только 20% выживаемость и почти 40% потерю веса (рис. 2).
Полученные данные подтверждают, что иммунизация рекомбинантными Ад5, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа, приводит к экспрессии на клеточной поверхности антигена с сохраненной третичной структурой, что позволяет добиться формирования гетеросубтипического иммунитета.
Применение Ад5 для создания кандидатных вакцин сталкивается с такой проблемой, как наличие антител к Ад5 у большой части населения [4]. Присутствие в крови таких антител может существенно снизить эффективность иммунизации. На сегодняшний момент существует ряд публикаций, согласно которым наличие в крови лабораторных животных антител к Ад5 не оказывает влияния на эффективность интраназальной иммунизации рекомбинантными аденовирусами [7, 13]. Для проверки этой гипотезы нами была получена модель предсуществующего иммунного ответа к Ад5 на мышах линии Balb/c. Для этого животным двукратно внутри-
*
ПРЕПАРАТЫ
брюшинно, внутримышечно или интраназально вводили рекомбинантный аденовирус Ad5-null, не несущий трансгена. Через три недели в сыворотках крови мышей был определен уровень вируснейтрализующих антител к Ад5. Результаты РВН показали, что наиболее существенный прирост антител наблюдался у мышей, получавших Ad5-null внутрибрюшинно (рис. 3).
Проведенные ранее исследования показали, что однократная интраназальная иммунизация аденовирусом Ad5-HA5-2 обеспечивала защиту иммунизированных животных от заражения 50 ЛД50 вируса гриппа птиц H5N2. Поэтому мыши, имевшие (получавшие Ad5-null) и не имевшие (получавшие физиологический раствор PBS) предсуществующий иммунный ответ к Ад5, были интраназально однократно иммунизированы аденовирусом Ad5-HA5-2. Через три недели после иммунизации мыши были заражены вирусом гриппа H5N2. Показано что все иммунизированные Ad5-HA5-2 животные были полностью защищены от заражения (рис. 4).
Литература:
1. Стратегический план действий ВОЗ в отношении пандемического гриппа WHO/CDS/EPR/ GIP/2006.2a // Всемирная организация здравоохранения. — 2007. — С. 28.
2. Седова Е.С., Шмаров М.М., Тутыхина И.Л. и др. Протективные свойства кандидатных генно-инженерных вакцин против вируса гриппа птиц, созданных на основе рекомбинантных аденовирусных векторов // Журн. микробиол. — 2010. — №3. — С. 44-48
3. Шмаров М.М., Седова Е. С., Верховская Л. В. и др. Индукция протективного гетеросубтипического иммунного ответа против вируса гриппа при иммунизации рекомбинантными аденовирусными векторами, экспрессирующими гемагглютинин вируса гриппа H5 // Acta Naturae. — 2010. — V. 2, № 1 (4). — С. 119-126.
4. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Соловьев Б.В. и др. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных. — M, 1986.
5. Abbink P., Lemckert A.A., Ewald B.A. et al. Comparative seroprevalence and immunogenicity of six rare serotype recombinant adenovirus vaccine vectors from subgroups B and D // J. Virol. — 2007. — Vol. 81, № 9. — P. 4654-4663.
6. Benihoud K., Yeh P., Perricaudet M. Adenovirus vectors for gene delivery // Curr. Opin. Biotechnol. — 1999. — Vol. 10, № 5. — P. 440-447.
7. Bett A.J., Prevec L.A., Graham F.L. et al. Packaging capacity and stability of human adenovirus type 5 vectors // J. Virol. — 1993. — Vol. 67. — P. 5911-5921.
8. Croyle M.A., Patel A., Tran K.N. et al. Nasal delivery of an adenovirus-based vaccine bypasses preexisting immunity to the vaccine carrier and improves the immune response in mice // PLoS One. — 2008. — Vol. 3, № 10. — P. 3548.
9. Hoelscher M.A., Garg S., Bangari D.S. et al. Development of adenoviral-vector-based pandemic influenza vaccine against antigenically distinct human H5N1 strains in mice // Lancet. — 2006. — Vol. 367, № 9509. — P. 475-481.
Таким образом, предсуществующий иммунный ответ к аденовирусу человека пятого серотипа не влияет на эффективность интраназальной иммунизации реком-бинантными аденовирусами.
Выводы:
1. Доставка гена гемагглютинина вируса гриппа птиц в составе аденовирусного вектора в клетки животных индуцирует протективный гетеросубтипический перекрестный иммунный ответ не только против вирусов гриппа внутри одного подтипа, так и против вирусов гриппа разных подтипов, относящихся к одному клайду.
2. Наличие у мышей предсущетсвующего иммунного ответа к аденовирусу человека пятого серотипа не оказывает значительного влияния на эффективность иммунизации против вируса гриппа птиц с помощью рекомбинантного аденовируса Ad5-HA5-2.
3. Аденовирусные векторы могут служить универсальной платформой для получения вакцин, как от сезонных, так и от пандемических штаммов вируса гриппа.
10. Hoelscher M.A., Singh N., Garg S. A broadly protective vaccine against globally dispersed clade 1 and clade 2 H5N1 influenza viruses // J. Infect. Dis. — 2008. — V. 197, № 8. — P. 1185-1188.
11. Kopecky-Bromberg S.A., Palese P. Recombinant vectors as influenza vaccines // Curr. Top. Microbiol. Immunol. — 2009. — Vol. 333. — P. 243-267.
12. Lagace-Wiens P.R., Rubinstein E., Gumel A. Influenza epidemiology--past, present, and future // Crit. Care. Med. — 2010. — Vol. 38. — P. 1-9.
13. Lochmuller H., Jani A., Huard J. et al. Emergence of early region 1-containing replication-competent adenovirus in stocks of replication-defective adenovirus recombinants (delta E1 + delta E3) during multiple passages in 293 cells // Hum. Gene Ther. — 1994. — Vol. 5, № 12. — P. 1485-1491.
14. Shi Z., Zeng M., Yang G. et al. Protection against tetanus by needle-free inoculation of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous vaccines // J. Virol. — 2001. — Vol. 75, № 23. — P. 11474-11482.
15. Smirnov YA, Lipatov A.S., Van Beek R. et al. Characterization of adaptation of an avian influenza A (H5N2) virus to a mammalian host // Acta Virol. — 2000. — Vol. 44, № 1. — P. 1-8.
16. Srivastava I.K., Margaret A.L. Gene Vaccines // Ann. Intcen. Med. — 2003. — Vol. 138. — P. 550-559.
17. Throsby M., van den Brink E., Jongeneelen M. et al. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells // PLoS ONE. — 2008. — Vol. 3, № 12. — Is. 12. — P. 942.
18. Toro H., Tang D.C., Suarez D.L. et al. Protection of chickens against avian influenza with non-replicating adenovirus-vectored vaccine // Vaccine. — 2008. — Vol. 26(21). — P. 2640-2646.
19. Van Kampen K.R., Shi Z., Gao P. et al. Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans // Vaccine. — 2005. — Vol. 23, № 8. — P. 1029-1036.
20. Webster R.G., Bean W. J., Gorman O.T. et al. Evolution and ecology of influenza A viruses // Microbiol. Rev. — 1992. — Vol. 56, № 1. — P. 152-179.
G
