CC BY
121
рантийного шестимесячного срока хранения, даёт более сыпучие смеси в составе двойного суперфосфата с хлористым калием, способно к равномерному рассеву по полю при подкормках.
Этот тук не уступает аммиачной селитре по влиянию на азотный (нитратный) режим в посевах как при разовом (основном), так и при дробном использовании, а также по действию на урожайность и по качеству урожаев яровых и озимых зерновых культур.
Библиографический список
1. Позин М.Е. Технология минеральных удобрений. - Л.: Химия, 1974.
2. Смирнов И.В. Пожарная безопасность при хранении аммиачной селитры. - М.: Россельхо-зиздат, 1984. - С. 32-33.
3. Ильин В.А., Ненайденко Г.Н., Жаворонкова Н.Г., Акаев О.П. Получение и агрохимические испытания нового сложного азотно-фосфатного удобрения (САФУ) // Бюллетень ВНИИА им.
Д.Н. Прянишникова. .№120 «Вопросы стабилизации почвенного плодородия и урожайности в Верхневолжье». - М., 2004. - С. 73-80.
4. Ненайденко Г.Н., Сибирякова Т.В. Использование САФУ в подкормки // Плодородие. -2005. - №>6. - С. 20-21.
5. Ильин В.А., РустамбековМ.К., Акаев О.П., Ненайденко Г.Н. Исследования термостабильности сложного азотно-фосфорного удобрения (САФУ) // Сб. ВНИИА «Вопросы стабилизации плодородия и урожайности в Верхневолжье». -М., 2006. - С. 128-136.
6. Ненайденко Г.Н., Сибирякова Т.В. Сравнительное действие САФУ и аммиачной селитры при подкормке озимой пшеницы // Проблемы агротехнологии, механизации, электрификации и автоматизации сельского хозяйства. - Иваново: Изд-во Ивановской ГСХА, 2005.
7. Ненайденко Г.Н., Зотова Е.Ю., Сибирякова Т.В. Сравнительное действие САФУ и аммиачной селитры // Агрохимический вестник. - 2007. -№3. - С. 16-17.
Е.В. Казак
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ МЕСТНЫХ АНЕСТЕЗИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ НА ТРАНСПОРТНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ
Исследовано влияние анестетиков прокаина и лидокаина на проницаемость функциональной мембраны для ионов натрия и калия. Установлено блокирующее действие анестетиков на проницаемость мембраны для ионов. Проведен сравнительный анализ интенсивности и продолжительности действия исследуемых анестезирующих веществ на ионные потоки Ма+ и К+. Показана возможность применения метода для предварительной оценки наличия у вновь синтезированных веществ способности блокировать нервную проводимость.
Изучение влияния местных анестезирующих веществ на проницаемость функ. циональной мембраны открывает возможность применения использованных методов для тестирования вновь синтезированных соединений и представляет интерес не только для медицины.
К местным анестетикам относятся лекарственные средства, которые в определенных концентрациях блокируют нервную проводимость. Их место действия - электровозбудимая мембрана нервного волокна. Местноанестезирующее действие - многостадийный процесс, определяемый последовательностью лимитирующих стадий: растворение в клеточной жидкости, адсорбция на поверхности биомембраны, связывание с рецеп-
торами ионных каналов, выделение. Каждая лимитирующая стадия описывается своим физическим законом, в формулировку которого входят физико-химические параметры местных анестетиков, рецепторов ионных каналов, клеточной жидкости [1].
Большая часть местных анестетиков состоит из липофильной группы (часто в виде ароматического кольца), соединенной через промежуточную цепь (обычно включающую эфирную или амидную группу) с ионизируемой группой (как правило, третичным амином). Для оптимальной активности требуется баланс между гидрофильными и липофильными группами. Кроме общих физических свойств молекул, большое значение имеет их специфическая стереохимическая кон-
фигурация, что проявляется в различной степени выраженности эффекта у стереоизомеров некоторых соединений.
Возбудимые мембраны поддерживают трансмембранный потенциал на уровне от -90 до -60 мВ. Во время возбуждения натриевый канал открывается, и ток натрия внутрь быстро деполяризует мембрану до потенциала равновесия натрия (+40 мВ). Вследствие этой деполяризации натриевые каналы закрываются (инактивируются) и открываются калиевые каналы. Ток калия наружу ре-поляризует мембрану до потенциала равновесия калия (около -95 мВ); реполяризация возвращает натриевые каналы в состояние покоя. Трансмембранные ионные градиенты поддерживаются натриевым насосом. Проведение возбуждения в значительной мере определяется согласованностью действия натриевых и калиевых каналов, обеспечивающих деполяризацию и реполяризацию мембран. Действие местных анестетиков обусловлено нарушением функции ионных каналов.
Показано, что местные анестетики (третичные амины) блокируют №-каналы. Существуют два типа блокировки: 1) связывание непосредственно в поре канала, предшествующее прохождению через нее иона; 2) аллостерическое связывание агента макромолекулярными структурами в канале, которое стабилизирует конформацию поры в закрытом состоянии и препятствует тем самым открыванию канала [2; 3]. Оба вида блокировки могут одновременно иметь место при действии химических веществ.
В основе механизма блокирующего действия лежит способность анестетиков уменьшать проницаемость электровозбудимых мембран для ионов натрия. Они оказывают это действие после протонирования аминогруппы и перехода молекулы в заряженное состояние.
Школой Б.И. Ходорова [4] предложена теория действия местных анестетиков на натриевые каналы электровозбудимых мембран. В натриевых каналах имеются четыре вида рецепторов (Я1, Я2, Я3, Я4), с которыми могут взаимодействовать анестетики. Рецепторы Я1 и Я2 расположены в наружном устье канала, Я3 и Я4 - во внутреннем (рис. 1).
Прокаин, лидокаин и другие третичные амины, при наружном применении взаимодействуют с рецепторами Я1 и Я2. Связываясь с рецептором Я1, анестетики снижают максимальную натриевую проницаемость, не устраняемую гиперполяризацией мембраны. При этом активной
Рис. 1. Схематическая модель ионного канала мембраны нервной клетки и различные места связывания (Я R2, Я3, R4) местных анестетиков
в реакции с R1 является основная (нейтральная) форма анестетика. Взаимодействие третичных анестетиков с рецептором R2 вызывает медленную натриевую инактивацию, рассматриваемую как переход канала из быстрого в медленное инактивированное состояние. С R1 и R2 взаимодействует только одна молекула анестетика. Нейтральный анестезин не способен вступать во взаимодействие с рецептором R в то время как он свободно связывается с рецептором R1 и вызывает иммобилизацию воротных диполей.
Третичные местные анестетики легко взаимодействуют с рецепторами R3 и R расположенными во внутреннем устье каналов. Для этого они в нейтральном состоянии проникают через липидный матрикс внутрь аксона, где аминогруппа про-тонируется, после чего связывается с указанными рецепторами. С этими рецепторами взаимодействуют только заряженные молекулы анестетика. Образование комплекса, в свою очередь, влияет на эффективность воротного механизма, оставляя ворота открытыми и сильно замедляя процесс инактивации канала. Попадая в открытые каналы, анестетик блокирует их и фиксирует ворота в открытом положении так, что они не могут закрыться до тех пор, пока блокатор не покинет канал. Таким образом, доступ блокатора к рецептору возможен лишь при открытых воротах. При закрытии ворот, после образования комплекса анестетик-
рецептор, анестетик оказывается запертым в канале. Влияние анестетиков на воротный механизм не прямое, а обусловлено их связью с другими молекулами, способствующими закрытию ворот (аллостерический механизм) [5; 6].
При прогрессивном повышении концентрации местных анестетиков на поверхности нервного волокна порог возбуждения повышается, проведение импульсов и скорость возникновения потенциалов действия замедляются, амплитуда потенциалов действия снижается, способность генерировать потенциал действия исчезает. Такой нарастающий эффект связан с последовательной блокадой анестетиком все большего числа каналов; в каждом канале связывание приводит к блоку натриевого тока. Если ток ионов натрия заблокирован на определенном отрезке длины нерва, проведение по нерву невозможно [7; 8].
Блокада натриевых каналов большинством местных анестетиков зависит от времени и потенциала: каналы в состоянии покоя (доминирующее состояние при более отрицательных потенциалах мембраны) имеют значительно меньшую аффинность к местным анестетикам, чем активные (открытые) или инактивированные каналы (доминирующее состояние при более положительных потенциалах мембраны). Таким образом, эффект препарата в какой-либо концентрации более выражен в активных действующих аксонах, чем в находящихся в состоянии покоя.
Между деполяризациями аксона часть натриевых каналов восстанавливается от блокады местными анестетиками. Это восстановление идет в 10-1000 раз медленнее, чем восстановление каналов от нормальной физиологической инактивации. В результате удлиняется рефрактерный период, и нерв может проводить меньшее количество импульсов.
Местные анестетики блокируют не только натриевую, но и калиевую проводимость. С помощью техники внутриклеточного диализа и фиксации потенциала изучено влияние прокаина, тримекаина и карбизокаина на натриевые и калиевые токи и установлено, что анестетики угнетали как токи №+, так и К+. Однако, для угнетения входящего тока №+ требовались концентрации анестетиков в 10-100 раз меньше, чем для угнетения быстрого и медленного компонентов выходящего тока К+ [9].
В данной работе исследовали влияние местных анестезирующих веществ лидокаина и про-
каина на проницаемость функциональной мембраны для ионов №+ и К+.
Прокаин - прокаина гидрохлорид - сложный эфир диэтиламиноэтанола и парааминобензой-ной кислоты.
■ШШ20
Лидокаин - лидокаина гидрохлорид, химическое название: 2-диэтиламино-2, 6-ацетоксианилидида.
•НОН2О
Экспериментальная часть
Работа проводилась согласно методике описанной в [10], которая предназначена для определения зависимости ионных потоков № и К от времени. Наша модификация заключалось в том, что водные растворы хлоридов натрия и калия соответствующей концентрации (2, 5, 10, 20, 40 мМ,) содержали анестетик лидокаин или прокаин концентрацией 0,01 моль/л.
Результаты и их обсуждение
Исследования показали, что величины ионных потоков (ИП) №+ и К+ значительно изменяются в присутствии анестетиков, причем сила действия анестетиков связана с концентрациями растворов хлоридов натрия и калия. Как правило, с постоянной концентрацией анестетиков в растворах и с увеличением концентрации ионов натрия и калия в этих растворах наблюдается усиление выявленных действий лидокаина и прокаина. Эти факты позволяют использовать данный метод для предварительной оценки и прогноза способности вновь синтезированных веществ блокировать нервную проводимость.
На рисунках 2 и 3 представлены зависимости входящих и выходящих ионных потоков №+ из раствора №С1 с концентрацией 5 мМ от времени, определенные в стандартных условиях [11] и в присутствии анестетиков.
Ьа+*10
t мин
Рис. 2. Сравнение входящих ионных потоков №+ в стандартных условиях и в присутствии анестетиков (См №С1 = 5 мМ)
В присутствии анестетиков входящие ионные потоки №+ увеличились в 1,5-2 раза. Возможно, в этом случае происходит взаимодействие анестетика с аминокислотными остатками рецептора вблизи устья канала. Образование комплекса анестетик -рецептор влияет на эффективность воротного механизма [12; 13], оставляя ворота открытыми. Это сильно замедляет процесс инактивации (закрытия) канала, и увеличивает поток ионов №+ по сравнению с потоком из растворов без анестетиков.
Выходящие ионные потоки №+ под действием анестетиков в первые 15-30 минут уменьши-
лись в 2-4 раза по сравнению с величинами потоков в стандартных условиях. С увеличением времени опыта происходит выравнивание ионных потоков, и на протяжении последних двух часов эксперимента значения ИП практически совпадают. В этом случае, вероятно, что молекула анестетика входит в открытый канал с внутренней стороны мембраны [14] и образует связи с рецепторами находящимися на этой стороне канала, тем самым, угнетая активацию (открытие) канала. Впоследствии, комплекс рецептор-анестетик разрушается, и влияние анестетика исчезает:
Т^+*10-1
t мин
Рис. 3. Выходящие потоки №+ в стандартных условиях и в присутствии анестетиков (См №С1 = 5 мМ)
Ik+*10 42
36
30
24
18
12
15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180
Рис. 4. Входящие потоки K+ в стандартных условиях и в присутствии анестетиков (CM KCl = 20 мМ)
величины ионных потоков №+ совпадают с контрольными значениями. Вероятно, анестетики вымываются из канала и переходят либо назад во внутренний раствор, либо растворяются в липидном матриксе мембраны.
Результаты исследования показали, что анестетики оказывают выраженное влияние на проницаемость мембраны для ионов №+ посредством изменения работы ионных каналов. Интенсивность входящих потоков возрастает на 30-80%, а выходящих снижается на 10-50%. В зависимости
от того, с какой стороны мембраны (наружной или внутренней) они контактируют, зависит их способность вызывать более длительное открытие или закрытие канала, что в свою очередь, вызывает увеличение или угнетение ионных потоков.
Опыты по исследованию потоков ионов К+ под действием анестетиков показали, что ИП К+ внутрь и наружу уменьшаются по сравнению со значениями потоков К+ определенных в стандартных условиях (рис. 4, 5). Входящие потоки К+ в первые 15 минут уменьшились в 4 раза, в пос-
6
0
0
Ik+*10
20 т 18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 -0 —
♦ ИП в стандартных условиях ■ о— ИП в присутствии лидокаина -•— ИП в присутствии прокаина
-S-
t мин
15
30
45
60
75
90
105
120
135
150
165
180
Рис. 5. Выходящие потоки K+ в стандартных условиях и в присутствии анестетиков (CM KCl = 20 мМ)
0
ледующее время отличие в 2 раза. Причем ионный поток К+ из раствора с прокаином через два часа после начала эксперимента возрастает, и его величины совпадают с контрольными значениями. По-видимому, происходит разрушение комплекса анестетик-рецептор. Аналогичная зависимость наблюдаются и в случае с выходящим ионным потоком К+.
Таким образом, в присутствии анестетиков значения ионных потоков К+ уменьшаются: входящие на 20-50%, а выходящие на 30-70% по сравнению со значениями в стандартных условиях.
С увеличением концентрации ионов натрия и калия, усиливается блокирующее действие анестетиков и, как следствие, происходит снижение интенсивности ионных потоков.
Сравнение ионных потоков из растворов с разными анестетиками показало, что прокаин обладает менее выраженной интенсивностью и продолжительностью действия по сравнению с ли-докаином. Особенно ярко это проявляется в случае с исследованием ионных потоков К+. Прокаин действует в первые 90 минут, после чего наблюдается увеличение ионного потока К+, значения которого приближаются к контрольным. Ионный поток К+ из раствора с лидокаином на протяжении всего эксперимента меньше контрольных величин. Различие действий молекул лидокаина и прокаина связано с наличием амидной группы в лидокаине, образующей более устойчивые связи с рецепторами ионных каналов, и с наличием эфирной группы в прокаине, которая легче гидролизуется [15; 16]. Отметим, что выраженность действия исследованных анестетиков на ионные потоки К+ совпадает с выраженностью их фармакологического действия. Лидокаин обладает более выраженным и продолжительным местным действием по сравнению с прокаином.
Выявленные в результате исследования закономерности влияния местных анестезирующих веществ на проницаемость функциональной мембраны позволяют применить использованную методику для тестирования вновь синтезирован-
ных соединений и выявления среди потенциальных ФАВ веществ обладающих свойствами местных анестетиков, т.е. блокирующих передачу нервного импульса.
Библиографический список
1. Исаева Г.А., Дмитриев А.В., Исаев П.П. // Биофизика. - 2002. - Т. 47. - №>3. - С. 506-511.
2. Физиология человека: В 3 т. / Под ред. Р. Шмидта, Г. Тевса. Т. 1. - М.: Мир, 1996.
3. Рубин А.Б. Биофизика: В 2 т. Т 2. Биофизика клеточных процессов. - М.: Университет, 2000. - 468 с.
4. Ходоров Б.И. Общая физиология возбудимых мембран. - М.: Наука, 1975. - 408 с.
5. Рецепторы клеточных мембран для лекарств и гормонов: междисциплинарный подход: Пер. с англ. / Под ред. Р.У. Штрауба, Л. Болис. - М.: Медицина, 1983. - 368 с.
6. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л. // Фармо-кол. и токсикол. - 1990. - Т. 53. - №2. - С. 4-8.
7. Neumcke B., Schwarz W., Stämpfli R. // Pflügers Arch. - 1981. - V. 390. - P 230-236.
8. Ulbricht W // Physiol. Rev. - 1981. - V. 61. -P. 785-828.
9. Назаров Е.И., Прянишникова Н.Т., Павлова Л.И. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1985. - Т. 4. - Вып. 11. -С. 574-576.
10. КазакЕ.В., Исаев П.П., Исаева Г.А. // Вестник КГУ им. Н.А. Некрасова. - 2000. - №4. -С. 9-15.
11. КазакЕ.В. Дис. ... канд. хим. наук. - Иваново: ИХР РАН, 2003. - 137 с.
12. Armstrong C.M. // Physiol. Rev. - 1981. -V 61. - P 644-683.
13. Hille B. // Biophys. J. - 1978. - V 22. - P 283-294.
14. Schwarz W., Pallade P. T., Hille B. // Biophys. J. - 1977. - V 20. - P 343-368.
15. Ходоров Б.И., Шишкова Л.Д., Пега-нов Э.М. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1974. - №3. - С. 10-14.
16. Нестеров П.П., Матвеев В.В., Демина И.Н. // Биофизика. - 1996. - Т. 41. - №>1. - С. 110-115.
