CC BY
71
УДК 579.222.3
М. В. Винтер, Э. Г. Дедюхина, А. Ю. Крыницкая
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ИСТОЧНИКА АЗОТА НА РОСТ, СИНТЕЗ ЛИПИДОВ И АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ ГРИБАМИ MORTIERELLA ALPINA LPM-301
Ключевые слова: арахидоновая кислота, нитрат калия, нитрат аммония.
Было изучено биохимическое поведение (производство биомассы, накопление и жирно-кислотный состав липидов) мицелиальных грибов Mortierella alpina LPM-301, являющихся высокоактивными продуцентами арахидоновой кислоты, выращенных на средах, содержащих различные источники азота. Установлено, что нитрат калия является лучшим источником азота для синтеза арахидоновой кислоты, чем нитрат аммония. Доля арахидоновой кислоты в липидах на среде с нитратом калия на треть выше, чем на среде с нитратом аммония.
Keywords: arachidonic acid, potassium nitrate, ammonium nitrate.
Was studied the biochemical behavior (biomass production, accumulation and fatty acid composition of lipidsl) of filamentous fungi Mortierella alpina LPM-301 which are highly active producers of arachidonic acid, were grown on media containing various nitrogen sources. Established that potassium nitrate is the best source of nitrogen for the synthesis of arachidonic acid than ammonium nitrate. Proportion of arachidonic acid in lipids in the medium with potassium nitrate to one-third higher than in medium with ammonium nitrate.
Арахидоновая кислота (АК) 5,8,11,14-эйкозатетраеновая (ю-6-типа) благодаря своим уникальным биологическим свойствам находит широкое применение в медицине, фармакологии, косметике, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и других областях [1-3].
В последние годы значительно возрос интерес к микробиологическому получению арахидоновой кислоты. Известно, что способность микроорганизмов синтезировать полиненасыщенные жирные кислоты ю-6- или ю-3-типов является таксономическим признаком. Обнаружено, что представители классов Ascomycetes и Basidiomycetes способны синтезировать полиненасыщенные жирные кислоты преимущественно ю-3-типа, а представители класса Phycomycetes (подклассов Oomycetes и Zygomycetes) синтезируют полиненасыщенные жирные кислоты преимущественно ю-6-типа [4].
Наиболее перспективным продуцентом арахидоновой кислоты считаются грибы рода Mortierella. Ранее, при исследовании более 100 штаммов грибов рода Mortierella был обнаружен синтез арахидоновой кислоты у 65 штаммов, относящихся к 32 видам [5,6]. Был селекционирован штамм Mortierella alpina LPM-301 - высокоактивный продуцент арахидоновой кислоты, который характеризуется уникальной способностью к интенсивному синтезу липидов в период активного роста мицелия.
Известно, что интенсивный синтез липидов у микроорганизмов является, как правило, двухфазным процессом и происходит после завершения активного роста продуцента. Имеются сведения лишь о нескольких штаммах дрожжей, обладающих уникальной способностью сопряженного с ростом синтеза липидов [7,8]. Механизмы, регулирующие интенсивный синтез липидов параллельно с ростом клеток, до настоящего времени не изучены.
Перспектива микробиологического получения арахидоновой кислоты ставит задачу регуляции синтеза АК. Как известно, существенную роль в синтезе микробных метаболитов может играть природа источника азота [9].
Целью работы было исследование влияния природы источника азота (нитрата калия или нитрата аммония) на показатели роста, синтеза липидов и арахидоновой кислоты штаммом Mortierella alpina LPM-301 в условиях периодического культивирования на глюкозо-минеральной среде.
Экспериментальная часть
Микроорганизмы и среда роста
Объектом исследования был выбран штамм грибов Mortierella alpina LPM-301 -высокоактивный продуцент арахидоновой кислоты. Для поддержания культуры использовали скошенный сусло-агар. Грибы выращивали на минеральной среде, содержащей (г/л): KH2PO4 - 2,0; MgSO 4 ■ 7H2O - 153,1; CaCl2 ■ 6H2O - 120,2; дрожжевой экстракт «Difco» - 2,5; глюкоза - 60; FeSO4 • H2O - 14,9; MnSO4 ■ 4H2O - 0,2; ZnSO4 ■ 7H2O - 8,1; CUSO4 ■ 5H2O - 3,9; KNO3 - 2,9; NH4NO3 - 1,2. Суммарная концентрация азота в обоих вариантах сред составляла 0,42 г/л. Начальное значение рН = 6,0. Фосфат калия, нитрат аммония или нитрат калия растворяли в 1 л воды и разливали в колбы по 100 мл. Стерилизовали при 1 атм 1 час. Концентрированные растворы MgSO4 ■ 7H2O и CaCl2 ■ 6H2O и микроэлементов стерилизовали при 1 атм 1 час, добавляли в колбы перед посевом. Дрожжевой экстракт и глюкозу стерилизовали при 1 атм 30 мин, также добавляли в колбы перед посевом.
Условия роста
Музейную культуру грибов M. alpina LPM-301 стерильно пересевали на скошенный сусло-агар и выдерживали в термостате 5 суток. Для получения инокулята смывы культур со скошенного агара в количестве 1-2 мл переносили в стерильные колбы на 750 мл со 100 мл стерильной жидкой питательной среды и культивировали при температуре 28 °С в течение 3 суток на качалке при 150-200 об/мин. Полученный инокулят в количестве 5 мл вносили в стерильные колбы на 750 мл со 100 мл стерильной жидкой ПС и культивировали при температуре 28 °С в течение 12-15 суток на качалке при 150-200 об/мин.
Методы анализа
Пробы отбирали один раз в сутки. В питательной среде определяли содержание глюкозы, концентрацию ионов NO3 и NH4+.
Концентрацию глюкозы определяли глюкозооксидазным методом. Содержание ионов NO3 и NH4+ в питательной среде определяли потенциометрическим методом с помощью ионоселективного электрода «Эком-NO3».
Биомассу фильтровали, взвешивали, высушивали под вакуумом при 70 °С до постоянного веса и подвергали метанолизу [10]. Метиловые эфиры жирных кислот анализировали газожидкостной хроматографией на хроматографе Chrom-5 (Чехославакия) с пламенно-ионизационным детектором на стеклянной колонке (200х0,3 см) с 15 % Reoplex-400, нанесенным на Chomaton N-AW (0,16-0,20 мм), при температуре 200 °С. В качестве газа носителя использовали аргон. Содержание липидов рассчитывали по сумме жирных кислот, на основании площади использованного внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта использовали гептадекановую кислоту или н-докозан.
Результаты и обсуждения
Данные о накоплении биомассы, потреблении глюкозы и источника азота в процессе роста M. alpina LPM-301 на среде с нитратом калия или нитратом аммония представлены в таблицах 1 и 2 соответственно.
При росте на среде с нитратом калия интенсивное потребление глюкозы началось только с третьих суток. К концу третьих суток потребилось только 12% глюкозы, а уже на четвертые сутки - 53% (табл. 1). На 7 сутки остаточная концентрация глюкозы составляла только 2,5 г/л. Полностью глюкоза потребилась на 9 сутки. После полного потребления глюкозы наступила стационарная фаза роста биомассы.
Интенсивное потребление азота началось также только с третьих суток (табл. 1). На третьи сутки потребилось 25% азота, а уже на четвертые обнаруживались только следовые количества азота. Такое интенсивное потребление нитрата азота в период между 3-4 сутками сопровождалось резким подщелачиванием питательной среды, значение рН изменилось от 6,24 до 8,50.
На среде с нитратом аммония потребление глюкозы было более растянуто во времени, и полностью глюкоза потребилась только на 10 сутки (табл. 2). Стационарная фаза роста биомассы наступила на 11 сутки.
Таблица 1 - Показатели роста M. alpina LPM-301 на среде с нитратом калия
Время культивирования, сут PH Биомасса, г/л Глюкоза, г/л NO3 , мг/л
0 4,80 н/о 61,1 ± 0,7 1998,40 ± 3,45
1 4,48 н/о 57,5 ± 1,6 н/о
2 6,64 6,1 55,8 ± 2,5 1606,50 ± 1,14
3 6,24 7,6 53,9 ± 1,6 1501,00 ± 6,00
4 8,50 (до 5,95) 15,8 32,5 ± 1,7 5,00 ± 0,20
5 6,54 16,3 32,8 ± 2,1 5,30 ± 0,02
6 6,63 19,6 18,3 ± 1,5 5,40 ± 0,30
7 7,68 (до 5,04) 25,0 2,46 ± 0,1 3,94 ± 0,02
8 6,93 18,5 2,06 ± 0,2 4,30 ± 0,02
9 6,48 24,3 0 3,80 ± 0,10
10 6,52 25,9 0 4,20 ± 0,03
11 6,80 28,4 0 5,40 ± 0,02
15 7,55 26,7 0 10,70 ± 0,07
Примечание: н/о означает «не определяли».
В данной питательной среде имелось два источника азота - это ион аммония и нитрат-ион. Из табл. 2 видно, что до третьих суток интенсивно потреблялся ион аммония. Это объясняется тем, что ион аммония является более легкодоступным субстратом, чем нитрат-ион, так как не требует затрат энергии на ассимиляцию. Потребление иона аммония сопровождалось подкислением питательной среды, значение рН изменилось от 4,80 до 2,38. На четвертые сутки начиналось интенсивное потребление нитрат-иона, сопровождающееся подщелачиванием среды от 5,54 до 7,00. Концентрация нитрат-иона на 6 сутки составляла 4,9 мг/л.
Интересно отметить, что полного потребления иона аммония и нитрат-иона не произошло. Остаточная концентрация иона аммония составила 26,5-38,7 мг/л до конца культивирования. Остаточная концентрация нитрат-иона на среде с нитратом калия составила 3,8-10,7 мг/л, а на среде с нитратом аммония - 4-10,4 мг/л.
На обеих средах концентрация биомассы достигала своего максимального значения на 11 сутки (табл. 1, 2). На среде с нитратом калия или нитратом аммония максимальная концентрация биомассы составляла 28,4 г/л и 34,3 г/л соответственно. Таким образом, выход биомассы на питательной среде с нитратом аммония на 17,2% больше, чем на среде с нитратом калия. Возможно это объясняется тем, что затраты энергии на потребление нитрат-иона выше, чем на ассимиляцию иона аммония.
На рис. 1 представлены данные о росте M. alpina LPM-301, синтезе липидов и арахидоновой кислоты на среде с нитратом калия или нитратом аммония. В обоих случаях интенсивный синтез липидов совпадал по времени с периодом активного роста культуры.
Из рисунка 1а мы видим, что на среде с нитратом калия основная масса липидов (27,5 % от абсолютно сухой биомассы (АБС)) была синтезирована уже к 6 суткам, в период активного роста мицелия, и далее их количество возросло незначительно - до 29,3 % к концу ферментации (15 суток).
Таблица 2 - Показатели роста M. alpina LPM-301 на среде с нитратом аммония
Время культивирования, сут PH Биомасса, г/л Глюкоза, г/л NO3 , мг/л NH4+, мг/л
0 4,80 н/о 70,4 ± 1,9 1058,90 ± 1,04 181,90 ± 0,7
1 4,42 н/о 68,7 ± 0,8 н/о н/о
2 2,38 (до 5,80) 4,02 66,6 ± 0,8 993,60 119,2 ± 0,8
3 2,82 (до 5,54) 6,0 62,6 ± 0,8 937,10 ± 9,40 53,3 ± 0,3
4 6,04 7,97 56,0 ± 0,1 843,80 ± 220 54,2 ± 0,3
5 7,00 12,1 52,7 ± 0,3 298,90 ± 1,60 53,7 ± 2,4
6 6,86 15,7 35,1 ± 1,1 4,90 ± 0,02 26,5 ± 0,1
7 8,00 (до 5,52) 24,1 15,9 ± 1,4 5,00 ± 0,04 33,2 ± 0,2
8 5,77 23,2 18,6 ± 0,7 14,90 ± 0,06 35,6 ± 0,7
9 6,93 29,1 3,8 ± 0,9 4,02 ± 0,05 38,7 ± 0,2
10 7,49 30,5 0 5,50 ± 0,30 29,4 ± 0,2
11 7,18 34,3 0 10,40 ± 0,09 68,2 ± 0,3
15 6,70 28,6 0 20,70 ± 0,05 38,5 ± 0,4
Примечание: н/о означает «не определяли».
На среде с нитратом аммония накопление липидов происходило также одновременно с ростом гриба (рис. 1б), их основная масса (27 % от АСБ) была синтезирована еще до наступления стационарной фазы (8 сутки), когда концентрация глюкозы в среде оставалась довольно высокой (18,6 г/л).
Таким образом, можно сделать вывод, что синтез липидов на средах с нитратом калия или нитратом аммония мало различается.
Кривые, изображенные на рисунке 1, показывают, что в процессе роста M. alpina LPM-301 на средах с нитратом калия или нитратом аммония доля арахидоновой кислоты постоянно увеличивалась. На 11 сутки количество АК на среде с нитратом калия достигало 32,1% от суммы жирных кислот (9,21% от массы мицелия) (табл. 3). На среде с нитратом аммония содержание АК к концу ферментации составило 24,9 % от суммы ЖК (6,42 % от массы мицелия) (табл. 4). Таким образом, видим, что синтез АК на среде с нитратом калия выше на 22,4 %, чем на среде с нитратом аммония.
Как видно из таблиц 3 и 4, где представлены данные об изменении жирно-кислотного состава липидов в процессе культивирования M. alpina LPM-301 на среде с нитратом калия или нитратом аммония соответственно, природа источника азота не повлияла на качественный состав липидов. В обоих вариантах опыта в составе липидов обнаруживались жирные кислоты, содержащие от 14 до 22 углеродных атомов, в том числе насыщенные, моноены, диены, триены и тетраены. В составе липидов преобладали пальтиминовая, олеиновая и арахидоновая кислоты. Когда доля арахидоновой кислоты была максимальна, содержание пальмитиновой и олеиновой кислот было наименьшее.
Начальное содержание АК в биомассе, выросшей на среде с нитратом калия, заметно выше, чем на среде с нитратом аммония, и составило на вторые сутки 3,37% от АСБ (табл. 3). Интенсивный синтез АК начался с 5 суток после исчерпания в среде источника азота.
2 4 6 9 10 12 14 16 Время, сут
Биомасса -о-Липиды
О 2 4 6 а 10 12 14 16 Бремя, сут
-Биомасса -п-Липиды
■ АК
б
а
Рис. 1 - Рост M. alpina LPM-301, синтез липидов и АК на среде с нитратом калия (а) или нитратом аммония (б)
На среде с нитратом аммония содержание АК на вторые сутки составило всего 0,24% от АСБ (табл. 4). Напомним, что при росте M. alpina LPM-301 на этой среде в течение первый четырех суток происходило потребление главным образом иона аммония. Синтез АК в этот период практически не наблюдался, а начался только на 5 сутки. Возможно, что присутствие иона аммония в среде подавляет синтез АК.
Таблица 3 - Изменение содержания жирных кислот в биомассе M. alpina LPM-301 в процессе роста на среде с нитратом калия
Кислоты, % от суммы ЖК Время культивирования, сут
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 15
С14 2,1 1,8 1,2 1,3 0,6 0,5 1,5 0,3 0,3 0,3 0,2
С15 0,2 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1
С16 23,5 22,8 19,4 22,0 17,9 15,4 25,0 14,5 13,2 13,2 12,5
Cl8:0 16,3 16,5 16,6 17,4 16,9 16,0 17,8 15,0 14,4 13,7 13,2
Cl8:1 19,7 19,1 23,3 26,6 20,0 21,9 31,4 19,7 19,3 19,0 18,4
С18:2 13,4 14,4 12,7 11,7 14,5 14,9 9,5 16,1 16,6 15,5 15,2
С18:3 3,5 3,2 2,6 2,3 2,5 2,3 1,7 3,1 2,5 2,3 2,5
С20:0 0,5 0,5 0,6 0,6 0,6 0,6 0,5 0,5 0,6 0,5 0,6
С20:1 0,3 сл 0,5 0,4 0,5 0,4 0,3 0,4 0,4 0,4 0,7
С20:2 0,2 сл 0,4 0,3 0,5 0,5 сл 0,6 0,8 0,9 0,4
С20:3 1,7 1,2 2,0 1,5 1,9 2,0 0,6 1,8 1,6 1,8 1,4
С20:4 17,9 20,3 19,6 14,8 22,9 24,3 10,7 27,3 29,9 32,1 34,3
С22 0,7 сл 1,0 1,0 1,1 1,1 0,8 0,6 0,3 0,2 0,5
Коэф. ненас. 1,34 1,42 1,42 1,22 1,55 1,63 1,00 1,77 1,86 1,93 1,99
Липиды, % от биомассы 18,8 24,6 24,2 25,1 27,5 27,1 25,1 29,2 35,2 28,7 30,0
С20:4, % от биомассы 3,37 4,99 4,74 3,71 6,30 6,58 2,68 7,97 10,52 9,21 10,29
Примечание: сл означает «следы».
Таблица 4 - Изменение содержания жирных кислот в биомассе M. alpina LPM-301 в процессе роста на среде с нитратом аммония
Кислоты, % от суммы ЖК Время культивирования, сут
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 15
Cl4 3,1 1,9 2,6 2,4 1,8 0,8 1,0 0,7 0,6 0,5 1,0
С15 1,2 0,1 0,7 0,3 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Ci6 33,9 26,9 32,7 29,6 26,0 18,8 18,3 16,0 15,7 14,8 20,9
Cl8:0 10,3 13,6 9,1 16,6 16,1 15,7 14,6 14,5 16,7 14,2 15,5
Cl8:1 41,8 32,8 38,3 34,4 32,6 26,5 33,4 28,1 25,7 22,9 38,1
С18:2 3,0 9,2 6,9 7,7 9,0 14,0 11,1 14,8 16,4 17,0 5,8
Cl8:3 2,5 2,3 2,2 1,5 1,9 2,5 2,0 2,5 2,3 2,3 1,6
С20:0 сл 0,4 0,3 0,5 0,5 0,5 0,5 0,4 0,7 0,5 0,7
С20:1 сл 0,5 0,3 0,3 1,1 0,4 1,1 0,5 0,7 0,5 0,8
С20:2 сл 0,1 сл сл Сл 0,2 0,2 0,2 0,4 0,6 0,2
С20:3 сл 1,3 0,3 0,7 1,1 1,3 1,1 1,1 0,8 1,1 0,2
С20:4 4,2 9,9 6,1 5,3 8,9 18,3 16,0 20,7 19,6 24,9 14,7
С22 сл 1,0 0,5 0,7 0,8 0,9 0,6 0,4 0,3 0,6 0,4
Коэф. ненас. 0,72 1,02 0,84 0,78 0,96 1,40 1,30 1,52 1,48 1,68 1,15
Липиды, % от биомассы 5,7 11,6 15,1 17,7 18,6 26,5 28,0 30,7 26,5 25,8 33,8
С20:4, % от биомассы 0,24 1,15 0,92 0,94 1,66 4,85 4,48 6,35 5,19 6,42 4,97
Примечание: сл означает «следы».
Заключение
Показано, что нитрат аммония обеспечивает более высокий выход биомассы Mortierella alpina LPM-301 (на 17%) по сравнению с нитратом калия.
Обнаружено, что природа источника азота в среде (нитрат калия или нитрат аммония) не оказывает существенного влияния на синтез и качественный состав липидов грибов M. alpine LPM-301, но изменяет соотношения жирных кислот в их составе.
Установлено, что нитрат калия является лучшим источником азота для синтеза арахидоновой кислоты, чем нитрат аммония. Доля арахидоновой кислоты в липидах на среде с нитратом калия на треть выше, чем на среде с нитратом аммония.
Литература
1. Holman, S.F. Enzymes and polyunsaturated fatty acids / S.F. Holman // Food Enzymes. - Westport, Connekticut. - 1960. - P. 81-82.
2. Erwin, J. Comparative biochemistry of fatty acids in eukaryotic microorganisms / J. Erwin // Lipids and Biomembranes of Eukaryotic microorganisms. - New York, 1973. - P. 41-50.
3. Гамаюрова, В.С. Мифы и реальность в пищевой промышленности / В.С.Гамаюрова. // Вестник технологического университета. -2010. -№ 8. - С. 116-121.
4. Shaw, R. The polyunsaturated fatty acids of microorganisms / R. Shaw // Advanced in Lipid Research. New York, London. - 1996. - V. 4. - P. 107-111.
5. Eroshin, V. K. Arachidonic-acid production by species of Mortierella / V. K. Eroshin [and etae.] // World J. Microbiol. Biotechnol. - 1966. - V. 12. - P. 91-96.
6. Ерошин, В. К. Исследование синтеза арахидоновой кислоты грибами рода Mortierella: микробиологический метод селекции продуцентов арахидоновой кислоты / В. К. Ерошин [и др.] // Микробиология. - 1996. - Т. 65. - № 1. - С. 31-36.
7. Boulton, C. A. Regulatory studies on citrate synthase in Candida 107, an oleaginous yeast / C. A. Boulton, C. Ratledge // J. Gen. Microbiol. - 1980. - V. 121. - P. 441-447.
8. Дедюхина, Э. Г. Исследование синтеза липидов и состава биомассы конститутивного продуцента липидов Debaryomyces globosus в условиях непрерывного культивирования / Э. Г. Дедюхина, С. В. Камзолова, В. К. Ерошин // Микробиология. - 1994. - Т. 63. - Вып. 6. - С. 1060-1062.
9. Хисаметдинов, М.Р. Влияние состава питательной среды на рост культуры Xanthomonas campestris и синтез экзополисахарида ксантана / М.Р.Хисаметдинов, В.С.Гамаюрова, Р.Р.Сагдеева, А.Ю Крыницкая., М.Н. Астраханцева, П.П. Суханов // Вестник Казан. технол. ун-та. -2009. -№2. -С.104-111.
10. Султанович, Ю. А. Способ количественного определения жирно-кислотного состава липидов микроорганизмов / Ю. А. Султанович, А. П. Нечаев, И. А. Барсукова // А. С. 968072 СССР. Бюлл. Изобр. - 1983. - № 39. - С. 95-136.
© М. В. Винтер - магистрант кафедры пищевой биотехнологии КГТУ, [email protected]; Э. Г. Дедюхина - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г. Пущино, [email protected]; А. Ю. Крыницкая - канд. биол. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КГТУ, [email protected].
