CC BY
15УДК 612.12-092.4:546.284-31
O.B. Алексеева*, H.A. Багровская*, K.B. Иванов*, A.B. Агафонов*, О.Г. Ситникова**, С.Б. Назаров**
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ДИОКСИДА КРЕМНИЯ НА ПРОЦЕСС ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ IN VITRO
(*Институт химии растворов им. Г.А. Крестова РАН, **Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н.Городкова) e-mail: [email protected]
Изучены структура и текстурные свойства мезопористого диоксида кремния. Методом индуцированной хемилюминесценции исследовано влияние суспензий диоксида кремния на процесс перекисного окисления липидов сыворотки крови in vitro. Показано, что суспензии диоксида кремния обладают способностью проявлять как про-, так и ан-тиоксидантные свойства.
Ключевые слова: диоксид кремния, золь-гель синтез, суспензия, in vitro, мезопористая структура
ВВЕДЕНИЕ
Кремний входит в состав биологических тканей живых организмов и необходим для нормальной жизнедеятельности всех органов и систем человека. Соединения кремния, такие как высокодисперсный диоксид кремния, находят широкое применение в биологии и медицине в качестве носителей лекарственных веществ, энтеросорбен-тов и адсорбентов с широким спектром действия [1]. В последние годы в литературе появились работы [2,5], посвященные влиянию кремнезема (SÍO2) на интенсивность свободнорадикальных и оксидантных процессов в различных системах живых организмов. Однако, сведения о направленности этих процессов носят противоречивый характер.
Так авторами [2] установлено, что мезопо-ристый диоксид кремния снижает уровень активных форм кислорода в крови мышей, проявляя антиоксидантные свойства. В [3] отмечено развитие оксидантного стресса под влиянием нанораз-мерного диоксида кремния в бронхиальных эпителиальных клетках человека. Индукция оксидантного стресса выявлена в эпителиальных клетках in vitro и in vivo, при этом обнаружено, что наноразмерный диоксид кремния не стимулирует антиоксидантные ферменты [4]. Цитотоксический эффект аморфного диоксида кремния выявлен на примере человеческих гепатом, интенсивность которого повышается с уменьшением диаметра частиц [5].
Влияние же диоксида кремния на свободно-радикальное окисление липидов в сыворотке крови изучено недостаточно.
В связи с этим, целью данной работы является изучение структуры диоксида кремния и
исследование его влияния на процесс перекисного окисления липидов сыворотки крови in vitro.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Диоксид кремния SiCb получали золь-гель методом. В качестве прекурсора использовали тетраэтоксисилан (ТЭОС).
Предварительно ТЭОС (10 мл) растворяли в водно-этанольной (96%) смеси (молярное соотношение ТЭОС:вода = 1:2,5). Диэтиламин (2,5 г) использовали в качестве катализатора. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Полученную суспензию белого цвета четырежды промывали дистиллированной водой и центрифугировали. Осадок высушивали при 85°С до постоянной массы. Полученный продукт представлял собой порошок белого цвета
Размер частиц сухого порошка Si02 и в суспензии в физиологическом растворе определяли методом динамического рассеяния света на анализаторе "Zetasizer Nano ZS" (Malvern Instruments) в диапазоне 0.3 нм - 10 микр. и на атомно-силовом микроскопе Solver 47 PRO (NT-MDT).
Текстурные характеристики твердофазного кремнезема (удельная площадь поверхности, объем пор, распределение пор по размерам) определяли методом сорбции и капиллярной конденсации газов. Изотермы низкотемпературной сорбции и десорбции азота на порошке Si02 были получены на анализаторе сорбции газов Quanta-chrome NOVA 1200e. Удельную поверхность порошка рассчитывали по уравнению БЭТ [8].
Общий объем пор Si02, распределение пор по размерам определяли с применением модели BJH.
Структуру синтезированных порошков изучали методом дифракции рентгеновских лучей на дифрактометре ДРОН-2 с источником излуче-
ния CuKa и напряжением 40 В (погрешность измерений составила 0,02%).
ИК спектры диоксида кремния в виде таблеток с КВг регистрировали на спектрофотометре Avatar 360 FT-IR ESP в диапазоне волновых чисел 4000-500 см"1.
Суспензию кремнезема (0,3 г/30 мл) в 0,9%-ом водном растворе NaCl (физиологический раствор) готовили гравиметрически. Средний радиус (R) частиц диоксида кремния и количество частиц (N) в 1 м3 в суспензии, ранее определенные методом спектротурбидиметрии, составили R=6,5-10"8m и N=5,5-1017.
Агрегативная устойчивость суспензий кремнезема сохранялась в течение 30 сут.
В качестве объекта исследования процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) использовали так называемую «сливную» сыворотку крови от 10 пациенток клиники ФГБУ «Ив. НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова». Исследование влияния суспензии кремнезема на свобод-норадикальные процессы в сыворотке крови in vitro проводили методом индуцированной хеми-люминесценции (XJ1) на приборе БХЛ-07. Предварительно пробирки, содержащие 1 мл сливной сыворотки крови и определенный объем суспензии кремнезема (25, 50, 100 мкл), инкубировали при 4°С в течение 1 ч. После инкубации сыворотку крови с суспензией порошков центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин, затем жидкую фазу переносили в чистые сухие пробирки. Далее из пробирок отбирали пробы по 0,1 мл и вносили в измерительную кювету прибора БХЛ-07, туда же помещали 0,4 мл фосфатного буфера (рН 7,5), 0,4 мл 0,01 M раствора сульфата железа и 0,2 мл 2%-го раствора Н202. Перекись водорода и сульфат железа FeS04 выступали в качестве индукторов ХЛ. Регистрацию свечения проводили в течение 40 с. Количественно процесс ПОЛ характеризовали максимальной амплитудой свечения (ImaxX тангенсом угла наклона кинетической кривой ХЛ (tga), который характеризует скорость спада процессов свободно-радикального окисления; светосуммой свечения (S), являющейся интегральным показателем интенсивности ХЛ и коэффициентом К, рассчитанным из соотношения K=WS [9]. Кроме того, определяли безразмерный параметр (а), характеризующий полную относительную интенсивность излучения, и нормированную светосумму (Z). Для контроля использовали сливную сыворотку крови без добавления суспензии Si02.
Показатели сливной сыворотки (контроль) были приняты за 100%).
Статистическую обработку данных лабораторных исследований проводили методами вариационной статистики с помощью стандартного пакета программ SDS. Учитывая характер распределения, отличный от нормального, описание представлено в виде медианы - середины распределения изучаемого признака и интерквартильно-го интервала (ME[Q25; СЫ). Сравнение средних величин в группах проводили с использованием критерия Wilcoxona. Статистически значимыми считали различия при р<0,05 [10].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты морфологического исследования показали, что полученный кремнезем содержит агрегаты, имеющие несферическую форму с размером до 2 мкм, и полидисперсные агломераты - с размером до 5 мкм. По данным метода динамического рассеяния света распределение частиц кремнезема по размерам имеет бимодальный характер с максимумами при 96 нм и 535 нм. При этом средний размер частиц Si02 составляет 254 нм.
Химическая природа поверхности синтезированного порошка Si02. исследована методом ИК-спектроскопии. В спектре кремнезема в области 3800-2800 см"1 определены полосы поглощения поверхностных свободных, а также ассоциированных и внутриглобульных силанольных групп Si-OH. В этой же области проявляются колебания силанольных групп, связанных водородными связями с молекулами воды, и валентные колебания адсорбированных молекул Н20. Деформационные колебания молекул адсорбированной воды Н20 характеризуются полосой при 1654 см"1 [11-13]. Интенсивная полоса с максимумом при 1011 см"1 обусловлена антисимметричными валентными колебаниями силоксановой группы Si-O-Si. Симметричные валентные колебания связи Si-O в Si-O-Si проявляются в виде пика при 811 см"1. Слабоинтенсивный пик при 964 см"1 характеризует валентные колебания связи Si-OH [14,15].
Рис. 1. Рентгенограмма синтезированного Si02 Fig. 1. XRD pattern of the synthesized Si02
Рентгенофазовый анализ позволяет получить информацию о структурных особенностях синтезированных порошков. На дифрактограмме (рис. 1) в области 29 от 10° до 70° обнаружен рефлекс при 20=23,6, соответствующий тетрагональной фазе Si02. Наличие только одного рефлекса свидетельствует о слабой степени кристалличности синтезированного порошка.
Важнейшие параметры дисперсной фазы -величина удельной поверхности и пористости -были определены методом низкотемпературной (77К) адсорбции и десорбции паров азота. Изотерма адсорбции азота на диоксиде кремния имеет петлю гистерезиса (рис. 2), что обусловлено объемной конденсацией пара в капиллярах пористого материала: опорожнение капилляра происходит при меньшем давлении, чем его заполнение. Такой вид изотермы по классификации IUP АС относятся к НЗ типу, что характерно для материалов с щелевидными порами [16]. На основании изотерм сорбции и десорбции были определены общая удельная поверхность Si02 и диаметр пор порошка, которые составили Svl=397 м2/г и d=3,63 нм со отв етств енно.
300-
реакции на кинетических кривых наблюдается всплеск свечения ХЛ, связанный с выходом свободных радикалов Я, ОН", ЯО . Я02 . 02.
160-, 140120-ш 100— 806040-
20
30
40
0 10 20 время, с
Рис. 3. Кривые хемилюминесценции систем в зависимости от количества суспензии кремнезема: 1 - сливная сыворотка;
2-25 мкл; 3-50 мкл; 4-100 мкл Fig. 3. Curves of chemiluminescence of systems, depending on the amount of the silica suspension: 1 - draining serum; 2-25 ц1; 3-50 ц1; 4 - 100JJ.1
Таблица
Влияние суспензии высокодисперсного диоксида кремния на показатели индуцированной хемилюминесценции «сливной» сыворотки крови Table. Effect of suspension of high dispersion silica on the parameters of induced chemiluminescence of drain-
0,4 0,6
P/P0
Рис. 2. Изотермы сорбции - десорбции азота на образцах Si02 Fig. 2. Sorption -desorption isotherms of nitrogen on Si02 samples
Таким образом, исследования текстуры и химической природы порошков Si02 показали, что кремнезем имеет мезопористую структуру, развитую удельную поверхность и содержит элек-тронодонорные функциональные группы.
Биологическая активность полученных порошков Si02 была изучена в тесте пероксидного окисления липидов в сливной сыворотке крови. На рис.3 представлены кинетические хемилюми-несцентные зависимости, характеризующие протекание ПОЛ в исследуемых системах. Как видно из рис.3, в течение первых двух секунд от начала
Объем сус- Показатели хемилюминесценции
пензии, Медиана [25; 75 перцентели]
мкл, и
количество частиц I max, мВ S, мВ-сек а Z, сек tga, мВ/сек
Si02
132 1922 0,374 14 [14; 15] 22 [17; 26]
0 [115; 147] [1826; 2195] [0,356; 0,382]
25 мкл, 5-108 151 2331 0,371 14 [14; 15] 24 [21; 29]
[128; 179] [1913; 2511] [0,357; 0,379]
50 мкл, 10-108 147* 2148* 0,359 14 [14; 15] 23 [21; 29]
[139; 181] [2029; 2530] [0,353; 0,373]
100 мкл, 20-108 157* 2274* 0,362* 15* [14; 15] 26* [26; 30]
[137; 183] [1981; 2493] [0,347; 0,365]
Примечание: здесь и далее звездочкой * отмечены достоверные отличия по отношению к контролю, таким образом: *р < 0,05
Note: hereinafter the significant differences with respect to to the control are marked as follows: * p <0.05
В таблице приведены показатели хемилюминесценции сливной сыворотки крови после воздействия суспензии с различным содержанием кремнезема. Анализ табличных данных показал, что при добавлении суспензии мезопористого диоксида кремния в объеме 25 мкл к эксперимен-
тальной системе достоверных изменений в показателях хемилюминисценции, отражающих интенсивность ПОЛ и антиоксидантную активность, не выявлено (табл.). Обнаружено, что при внесении в систему 50 суспензии диоксида кремния происходит повышение показателей быстрой вспышки Imax и светосуммы свечения S - соответственно на 11 % и 12 % (р=0,05) по сравнению с контролем, что свидетельствует о проявлении прооксидантных свойств частиц кремнезема.
Однако в сливной сыворотке крови с содержанием суспензий диоксида кремния в объеме 100 мкл наблюдается достоверное увеличение тангенса угла наклона кинетической кривой на 18 % (р=0,0077) и снижение величин а и Z соответственно на 4% (р=0,0415) и на 3% (р=0,0468) по сравнению со сливной сывороткой, что можно связать с антиоксидантным влиянием порошков SiO:
Таким образом, исследуемые порошки кремнезема вызывают существенные изменения хемилюминесценции, которые обусловлены нарушением прооксидантного-антиоксидантного равновесия в плазме крови. Обнаружено, что в зависимости от концентрации диоксида кремния в сузпензии может оказываться как про- так и анти-оксидантное влияние на биологическую жидкость.
Кинетика индуцированной ХЛ, характеризующая окисление липидов, была исследована в присутствии суспензии кремнезема с различным содержанием частиц Si02.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 12-03-97528-р_центр_а
ЛИТЕРАТУРА
1. Айлер Р. Химия кремнезема. М.: Мир. 1982;
Aiyler R. Chemistry of silica. M.: Mir. 1982. P (in Russian).
2. Huang X., Zhuang J., Teng X., Li L., Chen D., Yan X., Tang F. // Biomaterials. 2010 V. 31. N 24. P. 6142.
3. Eom H.J., Choi J. // Toxicol In Vitro. 2009. V. 7. P. 1326.
4. Akhtar M.J., Ahamed M., Kumar S., Siddiqui H, Patil G., Ashquin M., Ahmad I // Toxicology. 2010. V. 276. N 2. P. 95.
5. Li Y., Sun L., Jin M., Du Z., Liu X., Guo C., Li Y., Huang
P., Sun Z. // Toxicol In Vitro. 2011. V. 7. P. 1343.
6. Dorcheh A.S., Abbasi M.H // Mater. Proc. Technol. 2008. V. 199. N1. P. 10.
7. Rao A V., Pajonk G.M., Haranath D., Wagh P.B. // Mater. Synth. Proc. 1998. V. 6. N 1. P. 37.
8. Brunauer St., Emmett P. H., Teller E. // Am. Chem. Soc. 1938. V. 60. N2. P. 309.
9. Алексеева O.B., Багровская H.A., Ситникова О.Г., Назаров С.Б. // Жидкие кристаллы и их практическое использование. 2011. Вып. 3. С. 90;
Alekseeva O.V., Bagrovskaya N.A, Sitnikova O.G., Nazarov S.B. // Zhidkie kristally I ikh prakticheskoe ispolzovanie. 2011. N 3. P. 90 (in Russian).
10. Реброва О.Ю. Применение пакета прикладных программ STATISTICA М.: МедиаСфера. 2002;
Rebrova O.Yu. Application package STATISTICA. M.: MediaSfera. 2002. (in Russian).
11. Zhuravlev L.T. // Colloids and surfaces. A: Physicochemi-cal and Engineering Aspects. 2000. V. 173. P. 1.
12. Тертых B.A., Белякова JI.A Химические реакции с участием поверхности кремнезема.Киев: Наукова Думка. 1991.264 е.;
Tertykh V.A., Belyakova L.A. Chemical reactions with participation of silica surface. Kiev: Naukova Dumka. 1991. 264 p. (in Russian).
13. Costa T.M.H, Gallas M.R., Benvenutti E.V., da Jornada J. AH //J. Non-Crystalline Solids. 1997. V. 220. P. 195.
14. Li X., King T.A. // J. Non-Crystalline Solids. 1996. V. 204. P. 235.
15. Panda S.K, Dash S., Patel S., Mishra B.K //Adv. Colloid and Interface Science. 2006. V. 121. P. 77.
16. IUPAC Manuel of Symbol and Terminilogy. // Pure Appl.Chem. 1972. V. 31. P. 578.
