CC BY
13
УДК 591.185.66
К. В. Барское1, И. С. Ерофеев1, К. И. Агладзе1,2
1 Московский физико-технический институт (государственный университет), Научно-образовательный центр «Вионанофизика» institute for Integrated Cell-Material Sciences, Kyoto University, Киото, Япония
Исследование влияния АзоТАБа на фототаксис
Planaria torva
Работа посвящена изучению действия производного азобензола с фотоконтролируе-мой структурой (АзоТАБа) на движение плоских червей вида Planaria Torva. В настоящее время известно, что тромс-АзоТАБ является эффективным ингибитором ионных каналов мембраны возбудимых клеток, нейронов и кардиомиоцитов. В то же время цис-АзоТАБ подобной активности не проявляет. Представлялось интересным исследовать, как влияет присутствие изомеров АзоТАБа на простейшее поведение многоклеточных организмов, обладающих зачатками дифференцированной нервной системы, таких как планарии. Были исследованы траектории движения планарий при освещении видимым и УФ-светом как в среде, содержащей АзоТАБ в различных концентрациях, так и в его отсутствии. Кроме того, были измерены скорости передвижения планарий в воде в свободном движении, при фототаксисе и в случае фототаксиса в присуствии АзоТАБа.
Также показана обратимость блокирования двигательных функций планарий под действием УФ в присутствии АзоТАБа.
Ключевые слова: АзоТАБ, Planaria torva, фотоконтроль, фототаксис.
1. Введение
В последние несколько лет было обнаружено, что, используя вещества на основе азо-бензена, можно обратимо подавлять активность ионных каналов возбудимых клеток с помощью света [1, 7, 9]. Наиболее эффективным для этой цели оказался бромида азобен-зен триметиламмония (АзоТАБ), который под действием света подвергается цис-транс-изомеризации. При этом трапе-изомер АзоТАБа блокирует возбудимые клетки, такие как кардиомиоциты, мышечные клетки и нейроны [7]. В данной работе исследовалось влияние АзоТАБа в целом на организм, и в качестве экспериментальной модели были выбраны планарии. Планарии — семейство плоских червей из подотряда Tricladida класса ресничных червей. Планарии удобны для работы во многих отношениях [2-6,10]. С одной стороны, они достаточно примитивны и неприхотливы, с другой стороны — планарии имеют зачатки мозга и нервной системы, а их тело представляет собой нервно-мышечный каркас. Таким образом, планария представляет собой удобный объект для изучения влияния различных веществ на возбудимые клетки. Планарии избегают ультрафиолетового излучения, так называемый отрицательный фототаксис. В растворе АзоТАБа с большой концентрацией трапе-изомера двигательная способность организма падает. При облучении ультрафиолетом АзоТАБ переходит в цме-форму, при этом двигательная функция планарии восстанавливается, и червь старается покинуть зону облучения. Целью данной работы было выявить эти эффекты, исследовать фототаксис планарии при различных интенсивностях ультрафиолета, исследовать влияние АзоТАБа на фототаксис, таким образом, описав действие вещества на организм. Необходимо было набрать статистику поведения планарий в различных условиях и описать эффекты количественно в таких параметрах, как скорость, траектория и время нахождения в том или ином участке планариума.
2. Материалы и методы
2.1. Содержание планарий
Планарии содержались в пресной воде при постоянной температуре 20 °С. Смена воды осуществлялась раз в неделю. Питание проводилось 2-3 раза в неделю свежим мясом или свежей печенью. В экспериментах использовались особи длиной более 5 мм.
2.2. Приготовление раствора АзоТАБа
АзоТАБ был синтезирован ЦВТ «ХимРар». Для работы были приготовлены водные растворы АзоТАБа концентраций 50 мкМоль/л, 100 мкМоль/л и 200 мкМоль/л. Сначала делался стоковый раствор концентрацией 10 мМоль/л, из которого путем разбавления в соответствующей пропорции получались требуемые растворы.
2.3. Измерения
Для проведения измерений было изготовлено два «планариума». Первый представлял собой ванночку из оргстекла размерами 7 х 13 см, высотой 10 см, с высотой бортиков 1 см. В ванночку наливалась вода или раствор АзоТАБа и запускалась планария. Концентрация раствора АзоТАБа варьировалась от 50 мкМ до 200 мкМ. Планариум имел два дна, между которыми находилась миллиметровая бумага для численного анализа траектории. Снизу осуществлялась подсветка из светодиодов. Часть планариума освещалась сверху ультрафиолетовым светодиодом. В эксперименте был использован светодиодный модуль (LC-L2, Hamamatsu) 365 нм, который освещал участок ванночки ультрафиолетом. Мощность излучения варьировалась от 0,7 мВт/см2 до 7 мВт/см2. Передвижения планарии фиксировались стандартной веб-камерой [12]. Съемка проводилась покадрово с одинаковым временным интервалом. Время между кадрами съемки варьировалось от 1 секунды до 5 секунд (рис. 1-2).
Для более удобного анализа скоростей, а также эффекта остановки планарии на границе луча ультрафиолета был также изготовлен «одномерный» планариум, в котором червь мог передвигаться только вдоль одной координаты. Длина планариума составляла 13 см при ширине около 0,5 см. Часть одномерного планариума также освещалась ультрафиолетом и исследовалась координата и скорость передвижения в зависимости от градиента и мощности излучения, а также для различных концентраций АзоТАБа (рис. 3-4).
Таким образом, меняя концентрацию АзоТАБа и мощность ультрафиолетового светодиода, мы исследуем статистику поведения планарий. Характеристики установки представлены в таблице 1.
Таблица 1
Характеристики установки
УФ-диод LC-L2, Hamamatsu
Длина волны Л, нм 365
Мощность, мВт/см2 0,7-7
Радиус пятна, см 2,5
Веб-камера
Разрешение, пиксели 320 х 240
Интервал между кадрами, с 1-5
АзоТАБ
Концентрация, мкМоль/л 50-200
Температура, °С 20
1
Рис. 2. Фотография двумерного планариума
4 ' '
Рис. 1. Схема установки: 1 ультрафиолетовый диод. 2 веб-камера. 3 миллиметровая бумага. 4 вода или раствор АзоТАБа. 5 светодиодная подсветка
Двумерный планариум
Толщина стенок, мм 5
Размеры ванночки, мм х мм 70 х 130
Высота, мм 100
Одномерный планариум
Толщина стенок, мм 2
Размеры ванночки, мм х мм 5 х 130
2.4. Обработка результатов
Набор последовательных изображений, полученных с веб-камеры, обрабатывался программой ImageJ [11]. Для автоматизации обработки изображений был написан плагин для ImageJ, который вычислял положение планарии методом «вычитания фона». Затем он вычислял координату планарии и записывал результат в файл, а также рисовал траекторию движения червя (рис. 5, 6).
Зная зависимость координаты от времени, можно посчитать скорость планарии от времени. Планариум разбивался на участки, часть которых была освещена ультрафиолетом, а часть нет. Из множества экспериментов производилась выборка время пребывания в освещенном и неосвещенном участках.
Для численного анализа скоростей планарии использовался одномерный планариум. Плагин для Image.J вычислял координату в зависимости от времени и записывал результат в файл. Далее считалась статистика скоростей в зависимости от координаты для множества планарий и разброс координат положений планарий.
Рис. 3. Одномерный планариум. Червь может двигаться только вдоль координаты х. В результате фототаксиса планария старается покинуть освещенную зону. С возрастанием х возрастает концентрация ггфшге-изомера. который замедляет движение планарии вплоть до полной её остановки
Рис. 5. Траектория движения планарии в воде
Рис. 4. Вид с веб-камеры. Чёрный указатель обозначает текущее положение планарии
Рис. 6. Траектория движения планарии на координатной плоскости
3. Результаты и обсуждение
3.1. Схема эксперимента
Для исследования влияния АзоТАБа на фототаксис необходимо было сравнить движение нланарий при различных условиях. Принципиальных схем эксперимента было две.
1. Сравнение траекторий, скоростей и направлений движения нланарий в обычной воде, в воде при облучении видимым светом и в воде при облучении ультрафиолетом различной интенсивности (рис. 7). Данные но фототаксису планарии сравнивались с контролем: свободными передвижениями планарии в отсутствие освещения. Для тох'о чтобы отличить влияние ультрафиолета от влияния обычнох'о видимох'о света, эксперименты проводились с лучом видимох'о света и траектории движения планарии сравнивались для всех трех случаев. Таким образом, можно было статистически показать влияние ультрафиолета на поведение нланарий.
Рис. 7. Схема эксперимента 1. Сравнение влияния видимого света и ультрафиолета на планарию в воде
2. Сравнение траекторий, скоростей и направлений движения нланарий в обычной воде, в растворе с различной концентрацией (50 200 мкМоль/л) АзоТАБа в транс-изомере и в н,н,с-изомере при облучении ультрафиолетом (рис. 8). При этом в области освещения ультрафиолетом у нланарий начинается отрицательный фототаксис, а АзоТАБ переходит в н,н,с-изомер, что позволяет организму двигаться. При достижении границы освещенной области нланария попадает в область с транс-изомером АзоТАБа, который блокирует возбудимость нервных и мышечных клеток, и червь оетаналиваетея на границе освещенной области. Так можно исследовать интегральный эффект, оказываемый веществом на организм в целом. Таким образом, можно статитически показать влияние АзоТАБа в трапе-изомере на поведение нланарии, обратимость погашения активности возбудимых клеток, а также влияние цис- и транс-изомеров на фототаксис нланарий.
Рис. 8. Схема эксперимента 2. Сравнение движений планарии в воде и растворе АзоТАБа различных концентраций (50 200 мкМоль/л) в транс- и и/ие-изомерах
3.2. Исследование траекторий движения планарии
Влияние видимого света и ультрафиолета на планарию в воде
В воде движение нланарии достаточно хаотическое. Доползая до края нланариума, червь, как правило, некоторое время двигался вдоль бортика, после чего снова выползал к центральной части нланариума (рис. 9). При освещении видимым светом принципиально поведение нланарии не меняется. Первое время нланария избегает света, но через время, порядка минуты, свет никак не влияет на траекторию (рис. 10). При освещении ультрафиолетом мощностью 3,5 мВт/см2 планария старается избегать зоны освещения. Покидая зону освещения, нланария начинает двигаться хаотически (рис. 11). Разделим нланариум на два участка: правый и левый. Левый участок будет освещаться видимым светом или ультрафиолетом. Сравним время пребывания нланарий в левой части в трех случаях: в воде без освещения, в воде при освещении видимым светом и в воде при освещении ультрафиолетом. В каждом из трех тестов суммарное время движения составляло Т 2400 с. В воде процент пребывания в левой части Рв = 0,49 ± 0,05; при освещении левой части видимым светом Рс = 0,52 ± 0,05; при освещении ультрафиолетом Руф = 0,29 ± 0,03.
Рис. 10. Набор траекторий нланарий в воде при освещении видимым светом. Жёлтым обозначена освещённая область. Процент времени пребывания в левой части Рс = 0,52 ± 0,05
Рис. 11. Набор траекторий нланарий в воде при освещении ультрафиолетом. Синим обозначена освещенная зона. Планарии избегают зоны ультрафиолета, т.н. отрицательный фототаксис. Процент времени пребывания в левой части Руф = 0,29 ± 0,03
Влияние АзоТАБа на движение планарии
При увеличении концентрации АзоТАБа двигательные способности планарии резко падали. При этом АзоТАБ находится в транс-изомере. Сравнительные траектории для воды и растворов АзоТАБа концентрацией 50 мкМоль/л, 100 мкМоль/л и 200 мкМоль/л приведены на рис. 12. Во всех четырёх случаях траектории получены за одинаковое время I = 300 с.
Из зависимости пути, пройденного план арией за 300-секундный тест, от концентрации раствора АзоТАБа видно, что уже при концентрации 100 мкМоль/л активность практически полностью гасится (рис. 12).
Концентрация азотаба, мкМоль/л
Рис. 12. Сравнительные траектории планарии в
воде и растворах АзоТАБа в транс-форме раз- Рис- 13- Зависимость пути 5, пройденного пла-личной концентрации. Время движения 300 с нарией за 300-секундный тест от концентрации
раствора АзоТАБа
Влияние АзоТАБа на фототаксис планарий
Из п. 3.2 становится понятно, что в растворе АзоТАБ а 50 мкМоль/л нланария более заторможена, чем в воде, однако способна двигаться. При освещении ультрафиолетом мощ-
ностью 3,5 мВт/см2 начинается отрицательный фототаксис, планария старается избегать зоны освещения (рис. 14). Ситуация схожа с обычной водой, только скорость нланарии в АзоТАБе меньше (для оценки скоростей был поставлен опыт с одномерным нланариумом, см. н. 3.3). В растворе АзоТАБа 100 мкМоль/л планария прекращала двигаться и находилась на одном месте. При освещении ультрафиолетом АзоТАБ переходил в н,н,с-изомер, планария получала возможность двигаться и старалась покинуть зону освещения. На границе освещенной зоны транс-изомер АзоТАБа блокировал движение нланарии, червь или продолжал двигаться вдоль края луча или замирал на границе (рис. 15).
Рис. 14. Набор траекторий планарий в растворе АзоТАБа концентрации 50 мкМоль/л при освещении ультрафиолетом мощностью 3,5 мВ т/см2. Планария покидает освещенную зону: концентрации АзоТАБа недостаточно, чтобы заблокировать двигательные функции
Рис. 15. Набор траекторий планарий в растворе АзоТАБа концентрации 50 мкМоль/л при осве-
3,5 / 2
Планария доходит до границы луча и попадает в область с трапе-изомером АзоТАБа. который блокирует возбудимость нервных и мышечных клеток, и червь останаливается на границе луча
3.3. Анализ скоростей планарии
Для анализа скоростей был использован одномерный нланариум. Из графиков зависимости координаты от времени находилась скорость перемещения нланарии. В воде нлана-рия свободно перемещается из конца в конец (рис. 16). При облучении части нланариума ультрафиолетом планария выползает из области облучения и дальше двигается свободно (рис. 17). В 100 мкМоль/л растворе АзоТАБа при освещении ультрафиолетом мощно-
3,5 / 2
до полной остановки (рис. 18).
Рис. 16. Зависимость координаты х положения планарии от времени в воде
Из графиков находим среднюю скорость движения при спокойном движении, при осве-
3,5 / 2
цией 100 мкМоль/л в цис- и трапе-изомерах. Результаты представлены на рис. 19.
Рис. 17. Зависимость координаты х положения планарии от времени в воде при освещении части
3,5 / 2
Рис. 18. Движение планарии в растворе АзоТАБа концентрации 100 мкМоль/л при освещении части планариума ультрафиолетом мощностью 3,5 мВт/см2
Из диаграммы видно, что скорость при фототаксисе возрастает практически в два раза. Трап,с-изомер практически полностью блокирует двигательные способности. АзоТАБ в цт-форме частично восстанавливает двигательную активность.
4. Выводы
При проведении исследования траекторий движения нланарий в воде, а также в воде при облучении видимым светом и ультрафиолетом было выявлено, что в неосвещенном планариуме процент пребывания планарии в левой половине Рв = 0,49 ± 0,05 процент пребывания планарии в освещенной видимым светом половине Рс = 0,52 ± 0,05, а процент пребывания планарии в освещенной ультрафиолетовым светом половине Руф = 0,29±0,03. Это подтверждает наличие отрицательного фототаксиса у Planaria Torva.
Исследование траекторий свободного движения нланарий в воде и в растворах АзоТАБа (транс-изомера) различной концентрации показало, что при увеличении концентрации АзоТАБа двигательная активность планарии снижается. В частности, характерные расстояния, пройденные планарией за 300-секундный тест в воде, — So = 420 ± 30 мм, а в растворе АзоТАБа 50 мкМоль/л — S50 = 180 ± 30 мм. Этот факт согласуется с существующими представлениями о влиянии трап,с-изомера АзоТАБа на возбудимые клетки.
Под действием ультрафиолетового излучения двигательная активность частично восстанавливается, что позволяет нам говорить об обратимости блокирования двигательных функций трап,с-изомером АзоТАБа.
Измерение скоростей передвижения планарии в воде в свободном передвижении и при фототаксисе, а также при фототаксисе в растворе АзоТАБа позволяет говорить нам о конкурирующем действии эффекта фототаксиса и блокирования активности трап,с-изомером АзоТАБа, что приводит к такому интересному эффекту, как «застревание» планарии на
Рис. 19. Средняя скорость передвижения планарии в различных средах. Скорость в воде vB = 0,6±0,2 мм/с, в воде при освещении УФ — -ууф = 1,2±0,2 мм/с, в 100 мкМоль/л растворе транс-АзоТАБа^ vtr = 0,12 ± 0,10 мм^ в 100 мкМоль/л растворе цмс-АзоТАБа — vcis = 0,30 ±0,15 мм/с
границе засвеченной ультрафиолетом области в растворе АзоТАБа.
Таким образом, данная работа рассматривает новый подход к фотосенсибилизации це-ло!'о организма и открывает перспективы в будущем разработать методы контроля поведения и передвижения многоклеточных организмов с нервной системой.
Данная работа была выполнена в рамках исследований, осуществляющихся но гранту № 11.G34.31.0015 от 30 ноября 2010 г. Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых иод руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях выешм'о нрофеесиональши'о образования, а также Министерством образования и науки Российской Федерации.
Литература
1. Fortin D. L., Banghart М. R. \e.t al.}. Photochemical control of endogenous ion channels and cellular excitability /7 Nature Methods. 2008. V. 5, N 4. P. 331 338.
2. Tupac Х.П., Сахарова Н.Ю. Прижизненная морфометрия нланарий /7 Онтох’енез. 1984. Т. 15, № 1. С. 42 48.
3. Agata К., Soejima Y., Kato К., Kobayashi С., Umesono Y., Watanabe К. Structure of the planarian central nervous system (CNS) revealed by neuronal cell markers /7 Zoological Science. 1998. V. 15. P. 433 440.
4. Carpenter K.S., Morita М., Andbest J.B. Ultrastructure of the photoreceptor of the planarian Dugesia dorotocephala /7 .Journal of Ultrastructure Research. 1974. N 148.
P. 143 158.
5. MacRae E. K. Observations on the fine structure of photoreceptor cells in the planarian Dugesia tigrina // .Journal of Ultrastructure Research. 1964. N 10. P. 334 149.
6. Inoue. Т., Kumamoto H., Okamoto K. \e.t al.}. Morphological and functional recovery of the planarian photosensing system during head regeneration /7 Zoological Science. 2004.
V. 21. P. 275 283.
7. Magome N., Agladze К. I. Patterning and excitability control in cardiomvocyte tissue culture // Phvsica D. — 2010. — V. 239. — P. 1560-1566. *
8. Donaldson S. H. Jr., Lee С. T. Jr., Chmelkaa B. F., Israelachvili J. N. General hydrophobic interaction potential for surfactant/lipid bilavers from direct force measurements between light-modulated bilavers 11 PNAS. - 2011. - V. 108, N 38. - P. 15699-15704.
9. Erofeev I. S., Magome N., Agladze К. I. Digital photocontrol of the network of live excitable cells // Письма в ЖЭТФ. - 2011. - Т. 94, № 6. - С. 513-516.
10. Cebria F., Kudome Т., Nakazawa М., Mineta К., Ikeo К., Gojobori Т., Agata К. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system // Mechanisms of development. — 2002. — V. 116, N 1 -
2. - P. 199-204.
11. Abramoff M.D., Magalhdes P.J., Ram S. J. Image processing with ImageJ. — Laurin Publishing, 2004. - ISSN 1081-8693.
12. Konyuiun A.C., Ветров Д. П., Воронин П. А., Синдеев М. С., Ломакина-Румянцева Е. И. Система видеонаблюдения за поведением лабораторных животных с автоматической сегментацией на поведенческие акты // Труды конференции Graphicon-2008. — 2008. - Р. 199-205.
Поступила в редакцию 29.08.2012.
