CC BY
85
УДК 579.66:547.94
Л. Я. Калимуллина (к. техн. н., доц.), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), Д. Г. Ханнанова (студ.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Исследование стереоинверсии рацемического 1-фенилэтанола
с помощью микроорганизмов
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
L. Ya. Kalimullina, N. I. Petukhova, D.G. Khannanova, V. V. Zorin
Research of stereoinversion of racemic 1-phenylethanol
by microorganisms
Ufa State Petroleum Technical University 450062, Ufa, Kosmonavtov Str., 1; ph. (347)2431935, e-mail: [email protected]
Исследован процесс стереоинверсии (5)-1-фе-нилэтанола в (Л)-1-фенилэтанол с помощью клеток дрожжей Candida sake 777, Metschnikowia sp. 84-13 и дрожжеподобных грибов Geotrichum sp. 85-1. Показано, что при трансформации рацемической смеси 1-фенилэ-танола с помощью этих микроорганизмов в течение 5 сут может быть получен (RM-фенилэта-нол с оптической чистотой 45—70 % ее.
Ключевые слова: биотрансформация; микроорганизмы; оптически чистые энантиомеры; стереоинверсия; 1-фенилэтанол.
Оптически чистые энантиомеры широко используются в современном стереонаправлен-ном синтезе. R- и 5-энантиомеры 1-фенилэта-нола, а также их производные являются синто-нами лекарственных препаратов, обладающих антидиабетическим, антидепрессантным и ан-тирабическим действием 1, а также применяются при создании жидких кристаллов 2 и получении оптически активных полимеров, используемых для разделения рацемических смесей органических энантиомеров 2-4.
Показана возможность дерацемизации рацемических спиртов путем стереоинверсии одного из энантиомеров спирта в другой энанти-омер с помощью микроорганизмов 5-10. В частности, полагают, что дерацемизация 1-фенил-этанола с помощью грибов Geotrichum candidum связана с обратимым характером процесса окисления 5-энантиомера в ацетофе-нон и необратимостью восстановления последнего в R-энантиомер 8.
OH
OH
A process of stereoinversion of (S)-1-phenyl-ethanol into (R)-1-phenylethanol by yeasts Candida sake 777, Metschnikowia sp. 84-13 and fungus Geotrichum sp. 85-1 was researched. It is shown that these microorganisms are able to transform racemic 1-phenylethanol into the (R)-1-phenylethanol with enantiomeric excess 45—70 % during 5 days.
Key words: biotransformation; microorganisms; optically pure enantiomers; 1-phenylethanol; stereoinversion.
В настоящей работе исследована возможность дерацемизации рацемического 1-фенилэ-танола культурами микроорганизмов, эффективно восстанавливающих ацетофенон: Candida sake 777, Metschnikowia sp. 84-13 и Geotrichum sp. 85-1.
Установлено, что исследуемые микроорганизмы осуществляют дерацемизацию рацемического 1-фенилэтанола с накоплением (RM-фенилэтанола в реакционной смеси. В качестве промежуточного продукта в реакционной смеси образуется ацетофенон (до 0.07 г/л). Выход 1-фенилэтанола, обогащенного R-энан-тиомером, составляет 91—95 % (рис. 1).
В случае культур микроорганизмов Geotrichum sp. 85-1, Metschnikowia sp. 84-13; Candida sake 777 оптическая чистота (R)-1-фенилэтанола составляет до 45—70 % ее за 5 сут трансформации (рис. 2).
Таким образом, показана принципиальная возможность получения (RM-фенилэтанола с высоким энантиомерным избытком с помощью культур микроорганизмов.
(8)-1-фенилэтанол
ацетофенон
(Я)-1-фенилэтанол
Дата поступления 03.12.09
£
sí
4 о
5 se
H
s s
о ■fr
«
о
и
s
со
loo
so
6o
4o
lo
o
12 3
1 — Geotrichum sp. 85-1; 2 — Metschnikowia sp. 84-13; 3 — Candida sake 777. Условия реакции: 0.1 М фосфатный буфер, рН= 7.0; субстрат — 5 г/л; биомасса — 300 г (сырой вес)/л; аэробные условия, температура реакции 30 оС, время реакции — 120 ч. Рис. 1. Выход 1-фенилэтанола, обогащенного R-энантиомером в результате стереоинверсии рацемического спирта покоящимися клетками микроорганизмов
loo
8o
S -- 6o S § s s
«S 4o
S
u s S s
= io
б
Время, сут
—•—Geotrichum sp. 85-1 —*— Metschnikowia sp. 84-13 x Candida sake 777
Условия реакции: 30 оС; 0,1М фосфатный буфер рН=7.0; 300 г (сырой биомассы)/л; 5 г/л рацемического 1-фенилэтанола
Рис. 2. Динамика изменения энантиомерного избытка R-энантиомера 1-фенилэтанола во времени
Материалы и методы
Дрожжи выращивали на агаризованной картофельно-сахарозной среде следующего состава (г/л): картофель — 90; сахароза — 10; агар-агар микробиологический — 15; вода водопроводная — 1 л. Грибы рода Geotrichum выращивали на комплексной среде следующего состава (г/л): глицерин — 30; дрожжевой экстракт — 10; пептон — 5; агар-агар микробиологический — 15; вода водопроводная — 1 л.
Питательные среды стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 оС. Выращивание микроорганизмов осуществляли на чашках Петри при температуре 30 оС в течение 72 ч.
Выращенную культуру собирали и отмывали от среды центрифугированием при 14000 об/ мин в течение 15 мин, промывая трижды 0.1М фосфатным буфером рН 7.0, и использовали для трансформации рацемического 1-фенилэтанола.
Трансформацию рацемического 1-фенилэ-танола покоящимися клетками осуществляли в
0.1. фосфатном буфере (рН 7.0), содержащем биомассу микроорганизмов в количестве З00 г (сырой биомассы)/л; субстрат с исходной концентрацией 5.0 г/л. Стереоинверсию проводили в течение 6 сут при З0 оС при энергичном перемешивании на возвратно-поступательном шейкере.
Выделение продуктов биотрансформации производили из осветленной центрифугированием реакционной смеси (15 мин при 5000 об/ мин). Целевые продукты трансформации высаливали NaCl и троекратно экстрагировали продукты диэтиловым эфиром в соотношении 1:1. Экстракт осушали над обезвоженным сульфатом натрия, пробу концентрировали, отгоняя растворитель.
Оптическую чистоту полученного продукта определяли с помощью автоматического поляриметра «Pe^in Elme^» Model 341, l = 589 нм.
1-Фенилэтанол был идентифицирован методом ЯМР 1Н и хроматографически по совпадению времени удерживания с заведомо синтезированным образцом. Спектр ЯМР 1Н 1-фе-нилэтанола удовлетворительно совпадает с описанным в литературе 6.
Литература
1. Hamada H., Miura T., Kumobayashi H., Matsuda T., Harada T., Nakamura K. // Biotechnol. Lett.- 2001.- V. 23.- P. 1603.
2. Raku T., Tokiwa Yu. // Biotechnol. Lett.-2004.- V. 26.- P. 665.
3. Krishnamurthy S., Chen S.H. // Macramolecules.-1991.- V. 24.- P. 3481.
4. Mastrangelo J.C, Chen S.H. // Macramolecules.-1993.- V. 26.- P. 6132.
5. Xie S.X., Ogawa J., Shimizu S. // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1999.- V. 52.- P. 327.
6. Ogawa J., Xie S. X., Shimizu S. // Biotechnol. Lett.- 1999.- V. 21.- P. 331.
7. Xie S. X., Ogawa J., Shimizu S. // Biosci.Biotech.Biochem.- 1999.- V.63.- P.1721.
8. Nakamura K., Inoue Y., Matsuda T., Ohno A. / / Tetrahedron Lett.- 1995.- V. 36.- P. 6263.
9. Mandal D., Ahmad A., Khan M.I., KumaT R. // J. Mol. Catal. B.- 2004.- V. 27.- P. 61.
10. Nakamura K., Matsuda T. // J. O^. Chem.-1998.- V. 63.- P. 8957.
o
