CC BY
33
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
следовали кровь из хвостовой вены через 1, 3 суток и 1, 3, 6, 9, 12 недель. Стандартными методами определяли: общее число лейкоцитов; цитокинов (TNFa, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10); уровень гаптоглобина (Нр), церулоплазмина (Ср); иммуноглобулинов (Ig) А, М, G; адренокортикотропный гормон (АКТГ). В отдельной серии забирали образцы печени для гистологического анализа тканей. Уровень HSP73 (heat shock protein 73), HOx-2 (heme oxygenase-2) в печени определяли вестерн-блоттингом. Данные обрабатывали в Statistica 6.0.
Результаты. Ранние сроки (1, 3 недели) эксперимента сопровождались активацией клеточного иммунитета (лейкоцитоз на фоне сниженного числа лимфоцитов и увеличенного — моноцитов) с последующим запуском цитоки-нового каскада (гиперпродукция TNFa на фоне снижения уровня противовоспалительных цитокинов [IL-4, IL-10]). Уровень IL-6, 8 сохранялся в физиологических пределах. Двукратное повышение содержания АКТГ уже на 3-и сутки эксперимента выполняет регулирующую роль в ранней индукции TNFa, повлекшей за собой активацию синтеза Ср в печени, что следует рассматривать как защитную реакцию организма, направленную на предупреждение «окислительного стресса». Пусковым механизмом, инициирующим формирование процессов клеточной адаптации, является скачок синтеза белка с защитной функцией HSP73 и повышение в 2 раза уровня HOx-2 в печени на фоне гиперфункции ее ретикулоэндотелиальной системы на 1-й неделе. Усиление фагоцитарной функции системы органоспецифических макрофагов — клеток Купфера с 3-й недели, свидетельствовало об активном их участии в организации иммунного ответа. Выявленное утолщение базальной мембраны капилляров, связано с накоплением в ней иммунных комплексов и Ig. Адаптивным признаком гиперфункции на данном сроке также являлось скопление белка в цитоплазме, обусловленное компенсаторной активацией внутридолькового кровотока в печени, о чем свидетельствовало расширение синусоидальных капилляров и увеличение их массы, что обеспечивало лабильность метаболизма клеток печени. На начальной стадии развития ХФИ данные механизмы выступают первой линией защиты организма, что подтверждалось и отсутствием изменений в гуморальном звене иммунитета. Уровень Ig сохранялся в пределах физиологической нормы до 6-й недели. С 6-й недели запускался воспалительный процесс, развитие которого подтверждалось полуторакратным повышением уровня нейтрофилов и индукцией синтеза I1-6 на фоне достоверно высокого значения TNFa, свидетельствуя о развитии системного воспалительного ответа. Снижение иммунной реактивности с 9-й недели подтверждалось достоверным снижением уровня Ig^ M, G; лейкопенией на фоне лимфоцитоза, высоким уровнем Нр, доминированием воспалительной реакции и необратимыми деструктивными изменениями в печени, сопровождающимися скоплением лейкоцитов в синусоидах и развитием некроза к 12-й неделе ХФИ.
Заключение. Экспериментальные исследования показали, что начальная (1-3 недели) ответная реакция организма на фтористую агрессию характеризуется компенсаторной реакцией печени, активацией клеточного звена иммунитета, индукцией синтеза цитокинов; защитных белков в гепатоцитах. Шестая неделя сопровождается снижением иммунной реактивности, приобретающей к 9-й неделе патологический характер, протекающий с нарушением баланса между регенерацией гепатоцитов и их локальным воспалением, обусловленным снижением иммунной защиты организма.
ИССЛЕДОВАНИЕ СТАНДАРТНОСТИ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЭРИТРОПОЭТИНА НА НОРМОЦИТЕМИЧЕСКИХ МЫШАХ
Яковлев А.К., Алпатова Н.А., Постнова Е.Л., Симутенко Л.В., Батуашвили Т.А.
ФГБУ«Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
Введение. За последние два десятилетия препараты рчЭПО использованы более чем у миллиона пациентов, их применение устраняет анемический синдром, уменьшает потребность в гемотрансфузиях, снижает инфекционную заболеваемость, повышает качество жизни. Данные средства входят в «Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов для медицинского применения». В РФ зарегистрировано 13 препаратов рчЭПО (6 отечественных и 7 зарубежных). Им-портозамещение в здравоохранении обострило вопросы повышения эффективности и безопасности лекарств. Отсутствие ОФС на эритропоэтин в ГФ РФ привело к различию в методиках определения качества препаратов у отечественных производителей, так как у препаратов рчЭПО, зарегистрированных в начале 1990-х гг., показатели качества и нормативные требования, отличаются от поступающих на регистрацию в настоящее время. По требованиям ЕФ основной показатель качества — специфическую активность определяют по стимуляции эри-тропоэза, у мышей линии B6D2F1, подсчитывая количество ретикулоцитов с помощью проточной цитометрии. Рассчитанная активность должна быть не менее 80 и не белее 125 %, доверительный интервал (Р = 0,95) — не менее 64 и не более 156%. В РФ определение проводят на линейных и беспородных мышах, подсчитывая ретику-лоциты с помощью проточной цитометрии и световой микроскопии. Требования к полученным результатам ограничиваются правильностью без учета их прецизионности, что влияет на точность. Условия, допускающие применение световой микроскопии, необходимы при разработке ОФС рчЭПО, гармонизированной с Европейской фармакопеей. Гармонизация с ЕФ позволит выйти на более высокий уровень контроля качества в соответствии с международными требованиями и повысит эффективность и безопасность лекарственных препаратов рчЭПО при клиническом применении.
Цель. Совершенствование и стандартизация методики определения специфической активности эритропоэ-тина для включения в ОФС ГФ РФ.
Задачи. 1) стандартизовать лабораторную модель определения активности эритропоэтина; 2) оценить правильность и прецизионность метода при подсчете ретикулоцитов проточной цитометрией и световой микроскопией; 3) изучить возможность гармонизации методик по показателям стандартности ЕФ.
Материалы и методы. Специфическую активность оценивали методом in vivo по стимуляции гемопоэза у мышей линий B6D2F1 и Balb/c, и беспородных в ответ на введение им в качестве испытуемого и стандартного образцов независимых разведений биологического ре-ференс препарата (BRP batch#3). Подсчет ретикулоцитов проводили на проточном цитофлуориметре (Navios, Beckman Coulter) и световом микроскопе (Axio Scope A1, Carl Zeiss). При выполнении работы учтены требования НД отечественных производителей и Европейской фар-
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
макопеи. Данные статистически обработаны методом параллельных линий.
Результаты. При статистической обработке методом параллельных линий результатов экспериментов на беспородных мышах, выявлено несоответствие обязательным критериям параллельности и линейности. Результаты на мышах линий B6D2F1 и Balb/с статистически не отличались.
Правильность результатов при подсчете ретикуло-цитов методом проточной цитометрии имеет смещение в пределах 1-8 %, световой микроскопии — 4-31%. Прецизионность результатов проточной цитометрии, в 2 раза выше, чем микроскопии. Доверительные интервалы рассчитанной активности, полученной подсчетом световым микроскопом, не соответствовали требованиям ЕФ.
Наличие обратной зависимости между величиной стандартного отклонения результатов и количеством подсчитанных клеток, свидетельствует о возможности повышения правильности и прецизионности результатов микроскопии путем увеличения количество подсчитываемых клеток.
Заключение. 1. Для определения специфической активности эритропоэтинов подходят линейные мыши. 2. Использование проточной цитометрии характеризуется высокой точностью и соответствует требованиям Европейской фармакопеи. Результаты световой иммерсионной микроскопии обладают меньшей точностью и не соответствуют требованиям Европейской Фармакопеи по доверительному интервалу. 3. В случае отсутствия проточного цитометра использование менее точной световой микроскопии требует отработки оптимальных условий (увеличения количества подсчитываемых клеток), что позволит соответствовать требованиям ЕФ, как по величине рассчитанной активности, так и по доверительному интервалу полученных результатов.
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОВЕЗИКУЛ МАКРОФАГОВ ПЕРВОГО И ВТОРОГО ТИПА
Янковская А.А., Баторов Е.В., Шевела Е.Я.
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии», Новосибирск, Россия
Введение. Макрофаги являются гетерогенной популяцией клеток, и в зависимости от условий активации и функций можно выделить «классические», или провос-палительные, М1 и «альтернативные», или противоспали-
тельные М2 макрофаги. Исследованиями последних лет продемонстрирована значительная роль микровезикул (Мв) в реализации биологических эффектов различных типов клеток, однако спектр и свойства Мв, продуцируемых различными типами макрофагов и, в частности, М2, которые активно участвуют в процессах иммуномодуля-ции и репарации, остается неизученным.
Цель. Охарактеризовать Мв, секретируемые М1 и М2 макрофагами.
Материалы и методы. Макрофаги первого и второго типа генерировали из прилипающей фракции моно-нуклеарных клеток периферической крови доноров при культивировании в присутствии GM-CSF, в условиях нормального и сниженного содержания ростовых факторов сыворотки. Продукцию Мв оценивали в 48-часовых супернатантах М1 и М2 макрофагов, стандартизованных по количеству клеток. Мв получали методом препаративного ступенчатого ультрацентрифугирования, окрашивали моноклональными антителами (CD206, CD11c, HLA-DR, B7H1) и анализировали при помощи проточной цитофлуометрии.
Результаты. М1-специфичные Мв коэкспрессиру-ют характерные для М1 макрофагов маркеры — CD11c и HLA-DR, а также общие с М2 поверхностные структуры — маннозный рецептор (CD206) и коингибиторную молекулу B7H1. В ответ на стимуляцию эндотоксином спектр Мв значимо не изменялся. Среди Мв, продуцируемых М2 макрофагами, обнаруживалось достоверно меньше CD11c+ Мв в сочетании с увеличением относительного количества CD206+ Мв и коэкспрессирующих HLA-DR+ и B7H1+ Мв. При стимуляции ЛПС спектр также достоверно не менялся.
Заключение. Полученные предварительные результаты могут свидетельствовать о том, что М1 и М2 макрофаги продуцируют — спонтанно и при стимуляции эндотоксином — определенный спектр микровезикул, соответствующий определенному функциональному фенотипу.
КОМПЛЕКСНЫЙ ВАКЦИННЫЙ ПРЕПАРАТ ПРОТИВ ГЕМОФИЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ
Ястребова Н.Е., Овечко Н.Н., Токарская М.М., Елкина С.И.
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАН, Москва, Россия
В настоящее время не существует вакцины, которая была бы эффективной в защите одновременно от кап-
ТАБЛИЦА. ОТНОСИТЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ МВ В НЕСТИМУЛИРОВАННЫХ И ЛПС-СТИМУЛИРОВАННЫХ 48-ЧАСОВЫХ СУПЕРНАТАНТАХ, СТАНДАРТИЗОВАННЫХ ПО КОЛИЧЕСТВУ М1 И М2 КЛЕТОК (К ТЕЗИСАМ ЯНКОВСКОЙ А.А. И ДР.)
Исследуемый антиген М1 М2
0 ЛПС 0 ЛПС
CD11c 3,38 4,7 1,5* 1,57*
HLA-DR 14,0 28,6 14,1 18,3
CD206 16,7 23,8 23,1* 27,6
B7H1 31,7 30,2 28,9 33,3
HLA-DR+B7H1 25,7 25,8 43,95* 46,4*
Примечание. Представлены медианные значения данных, полученных в четырех экспериментах. * р№ < 0,05 — достоверные различия по сравнению с соответствующими показателями М1 макрофагов.
