CC BY
62
УДК573.6.086.83.582.28
ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ВЫДЕЛЯЕМЫХ ПРИ СОВМЕСТНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ PLEUROTUS PULMONARIUS И LENTINUS EDODES
Е.А. Мельникова, Е.Б. Мельников, П.В. Миронов
ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет» 660049, Красноярск, пр. Мира, 82; е-mail: [email protected]
В работе исследованы особенности роста и взаимодействия базидиомицетов Pleurotus pulmonarius и Lentinus edodes, а также Pleurotus pulmonarius и грибов рода Trichoderma при их совместном культивировании в поверхностных условиях в чашках Петри. Показано, что в данных условиях Pleurotus pulmonarius выделяет соединения, ингибирующее рост мицелия как Lentinus edodes так и грибов рода Trichoderma. В результате исследований показана перспективность выделения из мицелия Pleurotus pulmonarius веществ, обладающих противогрибковой активностью.
Ключевые слова: базидиомицеты, культивирование, мицелий, вешенка легочная, шиитаке, противогрибковая активность.
This paper contains a research on growth and development of basidiomycota fungi - Pleurotus pulmonarius, Lentinus edodes, Pleurotus pulmonarius and fungi of Trichoderma genus, when cocultivated in Petri dishes using surface cultivation technique. The research has shown that in given conditions Pleurotus pulmonarius releases compounds that inhibit mycelium growth in Lentinus edodes as well as in fungi of Trichoderma genus. Results of this research evidence possibilities to extract antifungal compounds from Pleurotus pulmonarius mycelium.
Keywords: basidiomycоtа fungi, cultivation, mycelium, Pleurotus pulmonarius, Lentinus edodes, antifungal compounds.
ВВЕДЕНИЕ
Успехи экспериментальной микологии, а также результаты исследований химического состава клеток грибов и их субклеточных фракций на различных стадиях онтогенеза позволяют рассматривать высшие грибы как перспективные продуценты в фармакологии и биотехнологии. Метаболиты высших грибов составляют более половины от вновь открываемых физиологически активных соединений. Они содержат в своем составе антибиотики, полисахариды, ферменты, терпеноиды, флавоноиды, витамины и другие соединения, которые давно применяются в качестве лекарственных средств в народной медицине (Ли Юй и др., 2009). Грибы представляют собой автономные природные экосистемы, в которых генетически заложены механизмы защиты от некоторых неблагоприятных для их развития факторов. Одним из таких механизмов является выделение базидиомицетами в неблагоприятных для них условиях соединений, обладающими антибиотическими свойствами. Таким образом, грибы защищают себя от инфицирования низшими грибами или бактериями и согласно закону конкурентного исключения, сформулированным Г.Ф. Гаузе, обеспечивают свой таллом пищевыми ресурсами (Чернова и др., 1988).
В настоящее время, несмотря на точное знание структуры практически всех известных веществ, обладающих антибиотическим действием, их чисто химический синтез громоздок и неэффективен.
Поэтому при получении соединений, обладающих данным свойствами действием, все более перспективным является применение биотехнологических методов с использованием в качестве возможных продуцентов природных антибиотиков высших ба-зидиальных грибов (Тихонова, 2008).
В последнее время перспективным направлением поиска природных антибиотиков является способ, основанный на совместном культивировании высших грибов с бактериями или с другими видами высших грибов (Тихонова и др., 2007; Шульга, 2005; Камзолкина и др., 2005).
Значительный интерес в качестве продуцентов биологически активных веществ представляют такие ксилотрофы, как Р1еигоШя ри1топапш (вешенка легочная) и Ьепйпш еЗоЗея (шиитаке). Помимо уникальной природной способности синтезировать в процессе своей жизнедеятельности различные биологически активные соединения, данные базидиомицеты также удовлетворяют основным принципам современной биотехнологии. Так, использование их в качестве продуцентов биологически активных веществ с применением метода глубинного культивирования дает возможность обеспечивать оптимальные условия для синтеза целевых продуктов. Это, в свою очередь, позволит получать экологически чистые продукты с воспроизводимыми свойствами в короткие сроки (3-5 суток) и с использованием дешевого сырья. Данные процессы могут стать экономически целесообразными при
создании технологий полного использования биомассы и получения биологически активных метаболитов углеводной, липидной, белковой природы, терпеноидов, стероидов, алкалоидов, фенольных соединений, витаминов.
В связи с изложенным, целью данной работы являлось исследование процесса совместного культивирования Pleurotus pulmonarius с высшими и низшими грибами в условиях конкуренции за субстрат.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектами настоящего исследования являлись: штамм РР-3.2 базидиального гриба Pleurotus pulmonarius и штамм LT-2.2 базидиального гриба Lentinus edodes. Чистые культуры исследуемых базидиомицетов были выделены из плодовых тел. Также в работе был использован микромицет рода Trichoderma штамма М99/1. Все используемые в работе штаммы взяты из коллекции кафедры химической технологии древесины и биотехнологии СибГТУ.
Для изучения особенностей роста в условиях конкуренции за субстрат и определения особенностей взаимодействия Pleurotus pulmonarius с высшими и низшими грибами было проведено их совместное культивирование в поверхностных условиях. Культивирование осуществляли на сусловом агаре в чашках Петри при температуре 25±2 оС. В качестве посевного материала использовали воздушный мицелий, выращенный в поверхностных условиях на аналогичной среде.
Изучение химического состава экссудата было проведено методом газовой хромато-масс-спектрометрии на приборе «Shimadzu» (Япония) модели GCMS-OP2010 Ultra. Колонка капиллярная CsBP-5MS, длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм. Программное обеспечение - GCMSsolution Version X.X 2.70. Идентификацию компонентов и соединений осуществляли с использованием спектральных библиотек (Nist 08 mass spectral library, Wiley Registry of mass spectral daft 9th Edition, Mass Spectra of Designer Drags 2010/2011, AIPSIN, EK-BDRUGS).
Спектральный анализ экссудата проводили методом инфракрасной спектроскопии. ИК-спектры регистрировали в диапазоне 500-4500 см-1 на ИК-Фурье-спектрометре ИНФРАЛЮМ ФТ-02 фирмы «Люмэкс» (Россия).
Компьютерные изображения поверхностной культуры, полученные в процессе исследования, фиксировали с помощью цифровой камеры Canon Power Shot A650IS.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Одним из направлений поиска природных биологически активных соединений может стать способ индукции антибиотического синтеза, основан-
ный на взаимодействии между собой разных видов базидиомицетов. В данной работе были исследованы особенности совместного культивирования высших грибов Р1еиго1ш ри1топапш и Ьепйпш edodes. При совместном культивировании в ограниченных пространственных условиях (чашка Петри) между базидиомицетами Р1еигои ри1топапш и Ьепйпш edodes, имеющих сходные экологические требования, закономерно возникает конкуренция за возможность в овладении субстратом. Предполагалось, что в создавшихся условиях в результате конкуренции один из базидиомицетов должен инги-бировать рост другого.
Таким образом, был создан искусственный биоценоз из Р1еигои ри1топапш и Ьепйпш edodes. Образующиеся в результате этого трофические и топические связи между этими базидиомицетами предоставили возможность стимулировать выделение биологически активных веществ обоими или одним из них. При встречном соприкосновении зон распространения культур Р1еигои ри1топапш и ЬепНпт edodes в области контакта наблюдали образование мицелиального валика (рис. 1б). Через 2-3 суток на образовавшемся мицелиальном валике со стороны колонии Р1еигои ри1топапш наблюдали выделение экссудата в виде капель желтого цвета (рис. 1а). После выделения экссудата граница колонии Р1еигоири1топапш продвигалась на несколько миллиметров вглубь области занимаемой Ьвпй-пш edodes и процесс образования мицелиального валика и выделение капель экссудата повторялся. В результате такого процесса Ьепйпш edodes приостанавливал свой рост, а в дальнейшем полностью прекращал свою жизнедеятельность.
Можно предположить, что Р1еигоири1топапш в процессе совместного культивирования выделяет активные метаболиты в питательную среду, чем и объясняется его антагонистическое воздействие на Ьепйпш edodes.
Для подтверждения фунгицидных свойств метаболитов, выделяемых Р1еигои ри1топапш, было проведено его совместное поверхностное культивирование с микромицетом рода Trichoder-та, обладающим высокими антагонистическими свойствами по отношению к фитопатогенным микроорганизмам (Алимова, 2011). Так как скорость роста микромицета Trichoderта значительно превышает скорость роста воздушного мицелия Р1еи-го1ш ри1топапш, штамм Trichoderта инокулиро-вался к уже сформировавшейся колонии Р1ешои ри1топапш. При соприкосновении двух культур на границе контакта также наблюдалось образование мицелиального валика (рис.2а). В течение 2-3 суток на образовавшемся валике со стороны колонии Р1ешои ри1топапш, как и в случае с Ьепйпш edodes, было зафиксировано образование экссудата в виде капель желтого цвета (рис. 2б).
Pleurotus pulmonarias
Lentinus edodes
Pleurotus^
pulmonarius
Lentintfsedodes
б в
Рисунок 1 - Конкурентное поверхностное культивирование Р1еиго1шри1топаг1ш и ЬепИпш еСоСея (а) капли экссудата на мицелиальном валике, х70 (б) мицелиальный валик в зоне контакта двух культур (в) конкурентное исключение ЬепИпш еСоСея
и начал процесс проникновения на область, занимаемую последней (рис. 3б). Таким образом, в результате конкуренции, воздушный мицелий Р1еиго1ш ри1то-папш постепенно распространился практически всю поверхность питательной среды в чашке Петри (рис. 3в).
Изучение экссудата, выделенного в результате конкурентного культивирования Р1еигоШ ри1то-папш и ЬепНпш ес1ос1е5, показало, что он хорошо растворим в воде и этиловом спирте и не растворим в неполярном органическом растворителе (хлороформе). Химический состав летучих соединений образцов экссудата, полученных в результате совместного культивирования Р1еигоШ риЫопагшя и ЬепЫпш еСоСех, исследовали с помощью метода газовой хромато-масс-спектрометрии. Полученные результаты хромато-масс-спектрометрии приведены на рисунке 4. Результаты расшифровки хроматограммы приведены в таблице 1.
Pleurotus pulmonarias Pleurotus pulmonarias
/', к* A
pjimpf
Trichoderma
Pleurotus pulmonarias
Trichoderma
а б
Рисунок 2 - Образование экссудата на границе контакта колоний воздушного мицелия Р1еигоШ$ ри1топапш и ТпскоСегта (а) граница контакта двух колоний (б) капли экссудата
При дальнейшем развитии искусственно созданного биоценоза воздушный мицелий Р1еиго1ш ри1-топапш не только приостановил распространение колонии микромицета рода ТпскоСегта (рис. 3а), но
^ШгР/
Trichoderma
Рисунок 3 - Конкурентное поверхностное культивирование на сусловом агаре Р1еигоШ$ ри1топапш и микромицета рода ТпскоСегта (а) граница контакта двух культур (б) образование мицелиального валика (в) конкурентное исключение микромицета рода ТпскоСегта
Время удержания, мин.
Рисунок 4 - Хроматограмма экссудата
Таблица 1 - Идентифицированные соединения в составе экссудата
№ пика
Наименование соединения *
Время удер- Эмпирическая Структурная
жания, мин. формула формула
1 З-метил-2 (5Н)-фуранон
2 2-гидрокси- гамма-бутиролактон
12 13
2(5Н)-фуранон
5 циклопропил карбинол
6 1,2,3-пропантриол 3-гидрокси тетрагидрофуран
8 3-бутен-2-ол
9 тетрагидро 2Н пиран-2-метанол
10 3-гидрокси-бутаналь
11 3,5октадиен-2-оне, (Е,Е)
тетрагидрофуран-2-ол
2-гидрокси-5-гидроксил-метил-тетрагидрофуран
3,344
3,408
3,510
4 метил 1-метилциклопропил кетон 4,527
4,924 5,390 5,838 б,399 б,б87 7,790
8,251
9,205 9,999
С5Н602 С4Н603 С4Н402
С6Н100
С4Н80
С3Н803
С4Н802
С4Н80
С6Н1202
С4Н802
С8Н120
С5Н1002 С5Нб03
* Примечание номенклатура соединений приведена в соответствии с используемыми спектральными библиотеками (Nist 08 mass spectral library, Wiley Registry of mass spectral daft 9th Edition, Mass Spectra of Designer
Drags 2010/2011, AIPSIN, EKBDRUGS).
Из таблицы 1 видно, что низкомолекулярные вещества, входящие в состав экссудата и идентифицированных данным методом, представляет собой сложную многокомпонентную смесь, состоящую из органических соединений различной природы, относящиеся к классам алифатического, циклического и циклоароматического рядов.
Для подтверждения наличия функциональных групп соединений определенных методом хромато-массспектрометрии в составе экссудата была проведена ИК-спектроскопия его пробы. Полосы поглощения исследуемой пробы экссудата были зарегистрированы в диапазоне волновых чисел от 1000 до 4000 см-1. Результаты данного исследования приведены в таблице 2.
Таблица 2 - Расшифровка ИК-спектров экссудата
№ пика
Волновое число V, см-1
Интервалы полосы
поглощения, см'
Происхождение полосы. Тип колебания и соответствующий структурный элемент
2
1035,42 1076,33 1223,57
1010-1050 1080-1150 1200-1250
Ароматические деформационные колебания в плоскости и деформационные колебания -С-О- первичных спиртов (валентное, -С-О-) Деформационное колебание -С-О-, (вторичные спирты и алициклические простые эфиры)
Ароматические деформационные колебания в плоскости -С-Н (валентное, —С-О, фенолы).
Окончание табл. 1
4 1417,8б 1340-1420
5 1б10,10 1590-1б10
б 1б10,10 1б00-1бб0
7 1б3б,б9 1580-1б50
8 2920,8б 2800-3000
9 33б9,30 3300-3500
Деформационные колебания, -ОН, (спирты, фенолы, карбоновые кислоты) Колебания ароматического скелета (связи -С-О- в ароматическом кольце) Колебания ароматического скелета (валентное, -С=С-, ароматические соединения, олефины)
Деформационные колебания, -Ы-Н, (первичные и вторичные амины) Валентные колебания -ОН (связанный -Н) метильной и метиленовой групп, (парафины, циклопарафины)
Валентные колебания -ОН (связанный -Н) метильной и метиленовой группы
По результатам идентификации полос поглощения, приведенных в таблице 2, можно сделать вывод, что в состав экссудата входят соединения, имеющие в своем строении двойную связь (-С=С-). Данные тип валентного колебания может соответствовать связям в ароматическом кольце и связям в алифатических структурах соединений. Подтверждено наличие в данном образце гидроксильных связей (-ОН) в первичных и вторичных спиртах. На ИК-спектре регистрируется широкая полоса поглощения валентных гидроксильных групп спиртового и фенольно-го характера. Результаты расшифровки ИК-спектра не противоречат структуре химических соединений, приведенных в таблице 1.
Основываясь на этом, а также принимая во внимание результат воздействия экссудата на биологические объекты предварительно можно предположить, что вещества, содержащиеся в экссудате, обладают не только противогрибковой, а возможно и общей антибиотической активностью.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что Р1ешо1ш ри1топапш в неблагоприятных условиях для своего развития может перенастраивать свой метаболизм в зависимости от влияния экологических факторов. В результате проведенных исследований было установлено, что при поверхностном совместном культивировании Р1еитШри1топапш и ЬепНпш edodes, происходит процесс выделения экссудата. Большинство, определенных в его составе соединений обладают токсическими в отношении микроорганизмов - свойствами. На практике показано, что вещества, выделяемые в результате совместного культивирования двух базидиомицетов, обладают противогрибковой, а возможно и общей антибиотической активностью.
Полученные результаты позволяют рассматривать Pleurotus pulmonarius в условиях совместного культивирования в качестве перспективного продуцента для получения биологически активных соединений.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Лекарственные грибы в традиционной китайской медицине и современных биотехнологиях / Ли Юй [ и др. ]. - под. ред. В.А. Сысуева / Киров : изд. О-Краткое. 2009. 320 с. Чернова, Н.М. Экология : учебное пособие для студентов биол. спец. пед. ин-тов. - 2-е изд., перераб / Н.М Чернова, Былова А.М. - М.: Просвещение, 1988. - 272 с. ил. Тихонова, О.В. Уфременкова, О.В. Катруха, Г.С. Оценка ба-зидиальных грибов в качестве продуцентов антибиотиков // Современная микология в России. Т.2. Материалы 2-го Съезда микологов России. / М.: изд. Национальная академия микологии, 2008 - 520 с.. Тихонова, О.В. Васильева, Б.Ф. Сумарокова, И.Г. Камзол-кина, О.В. Ефременкова, О.В. Индукция синтеза антибиотиков при совместном культивировании Pleurotus ostreatus и Pichiaholstii // Успехи медицинской микологии Т IX, гл. 5 / под ред. Ю.В. Сергеева / - М.: изд. Национальная академия микологии, 2007 - 187-189 с. Шульга, Е.В. Исследование антагонистического взаимодействия между Lentinus edodes и Trichoderma SPP., // Успехи медицинской микологии, Т. 5 / под ред. Ю.В. Сергеева / М.: Национальная академия микологии, 2005 - 45-47с.
Камзолкина О.В., Дьяков Ю.Т., Козлова М.В., Панчева Е.В., Дьяков М.Ю. Смешанные культуры вешенки и дрожжей. // Труды третьего съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Москва. 25-27 октября 2005. 109-110 с. Алимова, Ф.К., Антагонистическая активность биоконтрольных агентов Trichoderma аsperellum Burkholderia terrae/ Ф.К. Алимова, И.Р. Романова // Международная заочная научно-практическая конференция «Естественные науки: актуальные вопросы и тенденции развития», -г. Новосибирск, 2011г.- 41-45 с.
Поступила в редакцию 15.02.13 Принята к печати 03.12.13
