CC BY
10Федерация, Московская область, 140015, Люберцы, Комсомольский проспект, 4, e-mail: [email protected], тел.: 8 (495) 503-76-66.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. для цитирования
Шпачук М. М., Андреева Е. И. Классификация санитарно-технических изделий в таможенных целях // Вестник Российской таможенной академии. 2023. № 4. С. 60-71.
УДК 543.632.9
исследование соматотропина в таможенных целях
А. р. Алискеров1, в. Е. гольева2
1 Центральное экспертно-криминалистическое таможенное управление, Москва, Российская Федерация
2 Экспертно-криминалистическая служба - региональный филиал Центрального экспертно-криминалисти-ческого таможенного управления, Ростов-на-Дону, Российская Федерация
Аннотация. В статье рассмотрены особенности определения наличия соматотропина в таможенных целях. Наблюдается существенное различие основных задач контроля соматотропина в медицине, при надзоре в сфере обращения лекарственных средств, допинг-контроле и при таможенном контроле, направленном на пресечение контрабанды сильнодействующего вещества - соматотропного гормона. Среди наиболее распространенных методов физико-химического анализа веществ белковой природы в качестве двух независимых методов, обладающих относительной простотой, экспрессностью и селективностью, для реализации в экспертно-криминалистических подразделениях Федеральной таможенной службы используют методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза со спектрофо-тометрическим детектированием. Методика определения наличия соматотропина дополняется способами предварительного исследования проб с целью отнесения их к веществам белковой природы. В качестве перспективного унифицированного метода идентификации веществ пептидной и белковой природы, в том числе соматотропина, представляется метод масс-спектрометрии высокого разрешения с ионизацией электрораспылением.
Ключевые слова: таможенная экспертиза, физико-химические методы анализа, соматотропин, идентификация.
examination of somatotropin for customs purposes
A. R. Aliskerov1, v. E. Goleva2
1 Central Expert-Criminalistic Customs Administration, Moscow, Russian Federation
2 Forensic Expert Service - Regional branch of the Central Forensic Customs Administration, Rostov-on-Don, Russian Federation
© Алискеров А. Р., Гольева В. Е., 2023
Abstract. The article discusses the features of the definition of somatotropin for customs purposes. There is a significant difference in the main tasks of somatotropin control in medicine, in the supervision of the circulation of medicines, doping control and customs control aimed at suppressing the smuggling of a potent substance - somatotropic hormone. Among the most common methods of physico-chemical analysis of substances of protein nature, the methods of high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis with spectrophotometry detection have been selected as two independent methods with relative simplicity, expressiveness and selectivity for implementation in the forensic units of the Federal Customs Service of Russia. The method of determining somatotropin is supplemented by methods of preliminary examination of samples in order to classify them as substances of a protein nature. The method of high-resolution mass spectrometry with electrospray ionization is presented as a promising unified method for the identification of substances of peptide and protein nature, including somatotropin.
Key words : customs examination, physico-chemical methods of analysis, somatotropin, identification. ВВЕДЕНИЕ
Соматотропин является гормоном, регулирующим процессы роста и развития человека. При нарушении секреции соматотропина возникает системный дефект в развитии организма и диагностируется тяжелая патология. В середине ХХ в. со-матотропный гормон впервые выделен путем экстракции из передней доли гипофиза трупов человека. Однако полученные подобным образом препараты дают побочные реакции, вызывая тяжелое, с летальным исходом, неврологическое осложнение. Это обстоятельство явилось основанием запрета использования препаратов соматотропного гормона, получаемых из трупного материала.
Острая социальная потребность в гормоне роста, особенно в детской эндокринологии, стимулировала разработку технологии получения генно-инженерного соматотропина (рекомбинантный белок). Для получения рекомбинантного гормона роста на первом этапе клонируют ДНК-копию матричной рибонуклеиновой кислоты и расщеплением эндонуклеазами получают последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, кроме 23 первых аминокислот. Затем клонируют синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Далее два фрагмента объединяют и подстраивают в плазмиду E.coli, после чего клетки бактерии начинают синтезировать гормон. С 90-х гг. минувшего столетия в практической медицине используют только ре-комбинантные препараты гормона роста человека [1, 2].
Для спортсменов интерес представляет способность гормона роста увеличивать мышечную массу и способствовать сжиганию жира. В то же время злоупотребление соматотропином приводит к серьезным проблемам со здоровьем - развиваются такие заболевания, как диабет, гипертония, сердечная недостаточность, наблюдается анормальный рост органов и др.
В связи с использованием соматотропина в качестве допинга в спортивной среде гормон роста включен в 2020 г. в так называемый запрещенный список - международный стандарт, устанавливающий перечень субстанций и методов, запрещенных к использованию спортсменами, который составляется Всемирным антидопинговым агентством [3]. Однако, поскольку соматотропин широко используется
как в профессиональном, так и в любительском спорте, постановлением Правительства Российской Федерации (РФ) от 22.11.2021 № 2003 «О внесении изменений в постановление Правительства Российской Федерации от 29 декабря 2007 г. № 964» соматотропин (гормон роста, СТГ) включен в список сильнодействующих и ядовитых веществ для целей ст. 234 и других статей Уголовного кодекса РФ [4]. В связи с этим с 23.05.2022 установлены меры государственного контроля в отношении соматотропина.
Согласно Государственному реестру лекарственных средств [5] в России производство соматотропина осуществляется ограниченным количеством предприятий, поэтому наблюдается значительный объем импорта препарата. В то же время в больших количествах соматотропин приобретается заинтересованными лицами в специализированных интернет-магазинах, пересылается в международных почтовых отправлениях (МПО) под видом других товаров и затем нелегально реализуется на территории РФ. Сертификаты на такую продукцию, как правило, отсутствуют, проверка качества не проводится. Поскольку для проведения таможенного контроля в отношении товаров, пересылаемых в международных почтовых отправлениях, МПО предъявляются таможенному органу назначенным оператором почтовой связи, экспертно-криминалистические подразделения Федеральной таможенной службы (ФТС России) должны обладать арсеналом средств для обнаружения всех контролируемых веществ, в том числе соматотропина.
НАПРАВЛЕНИЯ КОНТРОЛЯ СОМАТОТРОПИНА В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Организации и предприятия, осуществляющие анализ или контроль сомато-тропина, преследуют различные цели.
Так, для медицинских целей количественное определение соматотропина, а тем более его идентификация, не представляются актуальными. Уровень сома-тотропного гормона широко варьируется даже в нормальных условиях и единичное определение его концентрации для постановки диагноза мало информативно. Целесообразно измерение соматотропина в составе тестов, включающих фармакологические или физиологические стимулы секреции или супрессии гормона роста [1].
При проведении процедур допинг-контроля гормон роста можно обнаружить только в сыворотке крови. Существуют два типа методов анализа соматотропина -прямой метод обнаружения изоформ гормона роста и косвенный метод обнаружения по его биомаркерам. Прямой метод для целей антидопинговых организаций практически не используется, так как этот тест обнаруживает допинг соматотро-пина до 24-48 часов после введения, потому что гормон роста имеет плазменный период полужизни между 15-й и 20-й минутами после секреции или внутривенной инъекции. Тест на биомаркеры гормона роста включает измерение двух маркеров, чувствительных к нему, а именно инсулиноподобного фактора роста и N-концевого пропептида коллагена типа III, которые присутствуют в сыворотке крови. Эти маркеры оцениваются на наличие нескольких смешанных факторов,
которые могли повлиять на оценку дискриминантных функций, включая возраст, пол, этническую принадлежность, физические нагрузки, травмы костей и мягких тканей, телосложение и т. д. [6].
Контроль применения пептидных гормонов, в том числе соматотропина, для повышения продуктивности сельскохозяйственных животных также актуален для деятельности Россельхознадзора. Так, наряду с традиционными стероидными гормонами для увеличения прибыли используется рекомбинантный бычий сома-тотропин. Причем специальная экспертная комиссия при Организации Объединенных Наций и Всемирной организации здравоохранения несколько раз рассматривала опасность применения соматотропина в сельском хозяйстве. Несмотря на то, что имеются научные данные о непосредственном вреде для человека (попадание с пищей в кровь и нарушение эндокринной регуляции) и вреде для животных (развитие болезней суставов, эндокринной системы, маститов, вследствие чего возникает необходимость применения антибиотиков), специальная экспертная комиссия назвала рекомбинантный бычий соматотропин безопасным по всем пунктам. Однако Россия и некоторые страны с 2015 г. высказываются против бесконтрольного применения гормональной терапии соматотропином. В связи с этим Россельхознадзор, осуществляя функции по контролю и надзору в сфере ветеринарии, обращения лекарственных средств для ветеринарного применения, проводит контроль применения бычьего соматотропина для сельскохозяйственных животных.
Государственный контроль (надзор) в сфере обращения лекарственных средств включает в том числе выборочный контроль качества лекарственных средств, который заключается, прежде всего, в обработке сведений о сериях, партиях лекарственных средств, поступающих в гражданский оборот в РФ, отборе образцов лекарственных средств и проведении испытаний на их соответствие требованиям нормативных документов. По результатам проведенных испытаний принимается решение о дальнейшем гражданском обороте лекарственного средства или о переводе лекарственного средства на посерийный контроль качества препарата в случае повторного выявления несоответствия качества лекарственного средства установленным требованиям [7].
Одной из приоритетных задач ФТС России является выявление и пресечение контрабанды наркотических средств, психотропных веществ, их прекурсоров и сильнодействующих веществ. В последние годы отмечается рост объемов незаконного перемещения сильнодействующих веществ на территорию РФ с использованием канала МПО. Это связано с минимальными затратами на транспортировку, обилием интернет-магазинов, отсутствием элементарной правовой грамотности населения, а также с возможностью сокрытия запрещенных веществ в большом потоке поступающих почтовых отправлений.
ФТС России предпринимает конкретные меры по обеспечению безопасности границ, совершенствованию эффективности таможенного контроля, направленного на пресечение контрабанды наркотических средств, психотропных веществ, их прекурсоров и сильнодействующих веществ. Важной составляющей
деятельности таможенных органов в этом направлении является экспертно-кри-миналистическое обеспечение, осуществляемое Центральным экспертно-крими-налистическим таможенным управлением - специализированным управлением ФТС России (ЦЭКТУ).
Материально-техническое и научно-методическое обеспечение ЦЭКТУ в настоящее время позволяет успешно решать комплекс задач в области выявления и пресечения контрабанды различных наркотических средств, психотропных веществ, их прекурсоров и сильнодействующих веществ. Широкий спектр химических соединений и разнообразие форм их переправки требуют от экспертов и специалистов ЦЭКТУ высокого профессионализма в части идентификации и определения подконтрольных веществ.
Таким образом, проведение экспертизы для таможенных органов в отличие от других видов надзора предполагает исследовательский подход - под видом любого товара может быть скрыто вещество, подлежащее контролю. При этом его качество, соответствие характеристик требованиям нормативных документов, источник происхождения, метаболизм в живом организме и другие показатели, определяемые, например, при надзоре в сфере обращения лекарственных средств, ветеринарии, медицинскими или антидопинговыми организациями, не имеют значения.
Для эффективного экспертного обеспечения таможенных органов необходима методика определения соматотропина, адаптированная для целей ФТС России, с учетом имеющегося материально-технического оснащения экспертно-кримина-листических подразделений ЦЭКТУ.
методические аспекты исследования веществ пептидной природы
Анализ научно-практической литературы показывает, что при химико-биологическом изучении пептидов и белков возникает необходимость разработки новых методов их анализа и требуется владение всеми известными методами. Следует отметить, что в настоящее время эта область развивается весьма интенсивно, новые достижения в методологии анализа белков представлены в огромном количестве статей в журналах биологического, химического, медицинского и даже технического профиля. Поэтому в обзоре представлены наиболее распространенные методы исследования соматотропина, которые могут быть адаптированы для целей экспертно-криминалистических подразделений ЦЭКТУ.
Все методы определения пептидов, в том числе соматотропина, можно условно разделить на несколько групп.
I. По применению:
1) идентификация или установление подлинности;
2) исследование и описание структуры пептида;
3) изучение различных производных (дериватов), метаболитов, механизмов биорегуляции.
II. По способу представления результатов:
1) качественный анализ;
2) количественное определение.
III. По лежащим в основе методов процессам:
1) хроматографические методы;
2) масс-спектрометрия;
3) электрофорез;
4) прочие (спектрофотометрические, пиролитические, тесты по ответу организма на введение препарата и др.).
В научной литературе, посвященной исследованию соматотропина, особое место занимает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), который основан на разделении компонентов смеси под высоким давлением вследствие различия в равновесном распределении веществ между двумя несме-шивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна (элю-ент). Метод сверхпроизводительной хроматографии является развитием метода высокоэффективной хроматографии и характеризуется увеличением эффективности хроматографического разделения за счет применения сорбентов с размером частиц менее 3 мкм. Применение малых частиц кроме увеличения эффективности приводит к увеличению разрешения между пиками, чувствительности (за счет сужения пиков), пиковой емкости, что в результате позволяет проводить большее число исследований за единицу времени по сравнению с ВЭЖХ.
В настоящее время для разделения и очистки пептидов и белков активно используются хроматографические методы в таких вариантах, как обращено-фазо-вая, нормально-фазовая, гель-фильтрационная, аффинная, иммунная. Наиболее универсальным методом определения чистоты пептидов и белков является обра-щено-фазовая хроматография, основанная на использовании широкого спектра гидрофобных неподвижных фаз с различными размерами пор [8-10].
Метод капиллярного электрофореза (КЭ) вошел во все современные фармакопеи и реализован в фармакопейных статьях для решения многих задач, в том числе для анализа соматотропина, его производных и примесей [11, 12]. Это обусловлено тем, что многочисленные варианты метода КЭ используются для разделения заряженных частиц и комплексов, нейтральных молекул, позиционных и оптических изомеров, белков и олигонуклеотидов. Для разделения белков с разной молекулярной массой в настоящее время широко используется метод электрофореза в полиакриламидном геле. Важной альтернативой ему является капиллярный гель-электрофорез, в котором используется капилляр, заполненный буфером с полимерными добавками. Как и в классическом гель-электрофорезе, разделение достигается за счет различий в молекулярных массах (так называемый ситовый эффект). Кроме того, метод капиллярного электрофореза обладает рядом преимуществ, среди которых необходимо отметить высочайшую уникальную эффективность разделения компонентов смесей, экспрессность, низкую стоимость прибора и единичного анализа, а также низкий расход реактивов и растворителей.
Большое количество публикаций посвящено применению метода масс-спек-трометрии. В настоящее время в основном используется ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией [8-10, 13, 14].
Для белков используют такие методы ионизации, как электрораспыление или электроспрей и лазерная десорбционная ионизация в присутствии матрицы.
Характерной особенностью электрораспылительной ионизации является образование многозарядных ионов. Достоинство многозарядных ионов состоит в возможности получения масс-спектров вторичных ионов при фрагментации ионов-предшественников с различным зарядовым состоянием, что увеличивает степень идентификации аминокислотной последовательности. Тем не менее, при анализе белков с помощью данного метода обычно применяют продукты их ферментативного распада, позволяющие получать более короткие пептиды. В связи с этим метод требует анализа большого массива данных для установления структуры молекул. Кроме того, определение моноизотопной молекулярной массы для больших белков может быть невозможным вследствие отсутствия пика моноизотопной массы в кластере молекулярного иона из-за вероятности присутствия нескольких более тяжелых изотопов.
Дополнительная структурная информация о пептидах и белках может быть получена при помощи тандемного масс-спектрометрического анализа, который проводится в несколько стадий: разделение ионов-предшественников; фрагментация этих ионов с образованием вторичных ионов; анализ фрагментных ионов.
Однако, очевидно, что обработка экспериментальных данных в масс-спектро-метрических исследованиях пептидов и белков представляет собой весьма сложную задачу, для решения которой требуются наличие и обширные знания многих пакетов программ, имеющих различные алгоритмы, требования к формату данных и пользовательские интерфейсы.
В работе [13] рассмотрены физико-химические методы с высоким разрешением (ВЭЖХ, КЭ, масс-спектрометрия), которые широко используются для характеристики рекомбинантного гормона роста и его производных. Указано, что ни один метод не может дать полное представление о качестве любого продукта. Это отражено в действующих фармакопеях, в которых используется комбинация методов.
Метод прямого спектрофотометрического определения практически не используется для определения соматотропина, так как этот метод основан на поглощении в диапазоне длин волн 230-300 нм остатками ароматических аминокислот (триптофан, тирозин, фенилаланин и гистидин), а также при образовании дисуль-фидных связей между молекулами цистеина.
В работах [13, 15] описаны метод Лоури, основанный на биуретовой реакции белков с солями меди (II) в щелочном растворе и восстановлении фосфорномо-либдено-вольфрамового реактива в гетеромолибденовый краситель с максимумом поглощения при длине волны 750 нм в результате окисления ароматических аминокислот белка, и метод Бредфорда, основанный на реакции красителя кумас-си с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками (связанная форма имеет голубую окраску с максимумом поглощения при 595 нм). Так, увеличение оптической плотности раствора при определенных длинах волн пропорционально количеству белка в растворе. Однако вследствие низкой селективности данные методы имеют ограниченное применение.
Как известно, нелетучие органические соединения анализируют с помощью пи-ролитической газовой хроматографии. При этом образцы подвергаются термической фрагментации в потоке инертного газа, продукты реакции разделяются на колонке и затем детектируются различными способами (масс-спектрометр, пламенно-ионизационный детектор и др.). В результате анализа ряда аминокислот и пептидов [16] установлены часто встречающиеся фрагменты, такие как диоксид углерода, ацетонитрил, пропенилнитрил. Кроме того, представлены уникальные продукты пиролиза аминокислот (например, для серина - пиразин, метионина - метилпро-пилсульфид, цистина - метиотиофен) и дипептидов. Однако наблюдаются отклонения пиролиза пептидов по сравнению с пиролизом индивидуальных аминокислот, что связано с положением аминокислоты в пептиде. Это обусловливает ограниченность метода пиролитической газовой хроматографии для исследования аминокислотной последовательности и анализа природных пептидов и белков.
Таким образом, для анализа соматотропина, в том числе установления подлинности лекарственных средств, исследования структуры молекулы, обнаружения модифицированных производных, применяются различные физико-химические методы: жидкостная хроматография, КЭ, масс-спектрометрия, пиролитическая газовая хроматография, спектрофотометрия, каждый из которых имеет как преимущества, так и недостатки.
сущность методики определения соматотропина в экспертно-криминалистических подразделениях фтс россии
Результаты анализа научных данных показали, что для проведения исследований по оценке подлинности лекарственных средств на основе рекомбинант-ных пептидов и белков наиболее информативны методы пептидного картирования и масс-спектрометрического секвенирования. Однако кроме необходимости наличия дорогостоящего оборудования, продолжительного времени анализа к существенным недостаткам данного метода относится то, что полная или даже частичная интерпретация масс-спектра возможна лишь в том случае, когда серии пиков представлены достаточно полно. Кроме того, вещества пептидной и белковой природы характеризуются ограниченным набором масс-спектрометрических данных вследствие ферментативного расщепления, а также выбора определенного иона-прекурсора для дальнейшей фрагментации.
В то же время метод обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием широко используется для определения подлинности и количественного определения соматотропи-на в форме растворов для инъекций и лиофилизата для приготовления растворов.
Также метод КЭ, который сравнивают с методом ВЭЖХ, потому что у этих методов много общего: разделение происходит в среде жидкой фазы (буфере или подвижной фазе), в ограниченном пространстве (капилляре или колонке) и с использованием одинаковых принципов детектирования, представляется весьма перспективным для идентификации соматотропина.
Сравнительный анализ различных физико-химических методов определения соматотропина представлен в табл. 1. Как видно из приведенных данных, в экс-пертно-криминалистических подразделениях ФТС России реализуемы практически все методы.
Таблица 1
Сравнение методов определения соматотропина
Метод Наличие оборудования в ЦЭКТУ Экспрессность Селективность
ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием (оборудование находится только в двух подразделениях ЦЭКТУ) +/- - +
ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием + + +
Капиллярный электрофорез + + +
Пиролитическая газовая хроматография с масс-спектро-метрическим детектированием + + -
Спектрофотометрия + - -
Спектрофотометрический метод в случае анализа соматотропина с учетом возможного наличия в исследуемых образцах различных добавок и неидентифици-руемых примесей представляется неподходящим.
С учетом многокомпонентности объектов необходимо предварительное хрома-тографическое или электрофоретическое разделение смеси.
Как было указано ранее, несмотря на высокое разрешение таких физико-химических методов, как ВЭЖХ, КЭ, масс-спектрометрия, ни один метод не может дать полное представление о характеристиках рекомбинантного гормона роста и его производных, поэтому целесообразно использовать комбинацию как минимум из двух методов.
В связи с этим в качестве двух независимых методов, обладающих относительной простотой, экспрессностью и селективностью, для реализации в экспертно-криминалистических подразделениях ФТС России выбраны методы ВЭЖХ и КЭ.
С использованием опубликованных научных данных разработчиками методики определения соматотропина проведены собственные исследования, направленные на оптимизацию процесса химического анализа.
Так, для определения соматотропина методом обращено-фазовой ВЭЖХ с УФ-детектированием в качестве исходных данных применяли метод, изложенный в работах [8, 13].
В качестве образца сравнения использовали образец субстанции соматотропи-на с содержанием 15 МЕ/мл (5,0 мг/мл). Образец имеет стандартный состав: со-матотропин 5,0 мг/мл и раствор плацебо, содержащий полисорбат-20, фенол, натрия хлорид и лимонную кислоту.
Хроматографические параметры были изучены на различных сорбентах: ZORBAX Eclipse Plus C18, Hypersil BDS-C18, Pursuit 200Á C8. Наилучшие
характеристики получены на сорбенте Eclipse Plus C18, поэтому в качестве неподвижной фазы выбран сорбент Eclipse Plus C18.
Исследованы подвижные фазы - вода, ацетонитрил - вода, метанол - вода, изопропанол - вода (рН 2,00, 6,86) - с различным соотношением компонентов. Использование воды в качестве подвижной фазы показало, что время анализа в этом случае составляет более 30 минут. Для систем ацетонитрил - вода, метанол - вода, изопропанол - вода характерна незначительная зависимость времени удерживания соматотропина и сопутствующих веществ от соотношения компонентов подвижной фазы. При этом хроматографические пики веществ соответствуют форме гауссова распределения лишь в случае системы ацетонитрил - вода (0,1% трифторуксусная кислота).
Изучение влияния скорости элюирования на форму хроматографического пика и время анализа показало, что оптимальная скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин. Увеличение скорости элюирования до 1,4 мл/мин приводило к незначительному уменьшению времени анализа при нарушении симметричности хроматографических пиков. При уменьшении скорости элюирования до 0,6 мл/ мин наблюдалось размывание хроматографических пиков веществ, что значительно искажало результаты хроматографического анализа.
В качестве оптимальной температуры анализа выбрали температуру плюс 30°C, так как при повышении температуры возможна частичная денатурация белка, при уменьшении температуры наблюдается увеличение времени анализа.
Детектирование соматотропина проводили при двух длинах волн - 215 нм и 275 нм. Однако с учетом того, что в области 215 нм поглощается значительная часть органических веществ и может наблюдаться матричный эффект (рис. 1), в качестве оптимальной выбрана область 275±5 нм. Как видно, в подобранных условиях компоненты хорошо разделяются и полисорбат не мешает идентификации соматотропина.
В состав смесей, содержащих соматотропин в качестве стабилизатора, наряду с полисорбатом входит маннитол. Поэтому оценено влияние маннитола на возможность идентификации соматотропина. Экспериментально установлено, что маннитол не мешает определению соматотропина.
Разработанная методика определения соматотропина методом ВЭЖХ реализуется следующим образом. В инжектор жидкостного хроматографа последовательно вводят стандартный раствор соматотропина, раствор плацебо и испытуемый раствор, регистрируя не менее двух хроматограмм каждого из растворов. Пики, принадлежащие раствору плацебо, в дальнейшем не учитывают. Время удерживания основного пика соматотропина на хроматограмме испытуемого раствора должно соответствовать времени удерживания пика соматотропина на хроматограм-ме стандартного раствора соматотропина (время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора в пределах ± 0,5 мин соответствует среднему значению времени удерживания для двух проб стандартного раствора).
20 22
10 12 14
0 2
Примечания. В области 200-220 нм на протяжении всего времени анализа наблюдается интенсивное поглощение.
Цифрами 1, 2, 3 соответственно обозначены хроматографические пики фенола, полисорбата и сома-тотропина, входящих в состав препарата.
Рис. 1. Трехмерная хроматограмма препарата соматотропина
Для детектирования соматотропина методом КЭ подобраны оптимальные условия анализа (капилляр: £эфф/£общ = 50/60 см, Ю = 75 мкм; ввод пробы: 150 мбар-с; напряжение: +20 кВ; температура: +25°С; длина волны детектирования: 215 нм), при которых полисорбат не мешает определению соматотропина (рис. 2).
Рис. 2. Электрофореграмма контрольного образца соматотропина
В качестве рабочего буферного раствора (фонового электролита) использовался боратный буфер с добавками додецилсульфата натрия. Выбор борат-ного буфера обусловлен тем, что он обладает достаточной буферной емкостью,
незначительным поглощением при длине волны детектирования, низкой подвижностью ведущего иона, может использоваться в широком диапазоне концентраций без существенного увеличения тока, что позволяет применять максимально высокие напряжения в ходе анализа. Использование в составе фонового электролита додецилсульфата натрия в концентрации, превышающей критическую концентрацию мицеллообразования, позволяет получить эффект, при котором нейтральные компоненты пробы могут распределяться между фазой раствора и мицеллярной фазой. В результате на выходе капилляра регистрируется элек-трофореграмма нейтральных компонентов.
По результатам среднеквадратичного отклонения при исследовании растворов концентрации 1мг/мл рассчитан предел обнаружения (детектирования) сомато-тропина предложенными методами: методом ВЭЖХ - 0,03 мг/мл; методом КЭ -0,4 мг/мл.
Несмотря на то, что предел детектирования соматотропина методом КЭ почти в десять раз выше предела определения методом ВЭЖХ, обе методики обеспечивают необходимый предел обнаружения: в практических целях используют со-матотропин в двух формах - раствор для инъекций (концентрацией 3-5 мг/мл) и лиофилизированный порошок.
Перед исследованием проб и образцов, поступивших на экспертизу, предложенными методами целесообразным представляется проведение предварительных испытаний с применением простых в исполнении и экспрессных методов для выявления продуктов, вообще не содержащих в своем составе пептидов и белков.
Для этих целей наиболее подходящими могут быть качественные химические реакции (биуретовая и/или нингидриновая реакции) и/или пиролитическая газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием.
Нингидриновая реакция характерна для аминогрупп, находящихся в а-поло-жении и входящих в состав белков, пептидов и свободных аминокислот. а-амино-кислоты, пептиды, белки при нагревании с раствором нингидрина дают синее или сине-фиолетовое окрашивание. Биуретовую реакцию способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей. Аминокислоты не дают положительную биуретовую реакцию, за исключением гистидина, серина, треонина при условии больших концентраций их в растворе. Реакция обусловлена образованием биуретового комплекса в результате соединения ионов меди с пептидной связью белка. Окраска биуретового комплекса зависит от количества ионов меди, от длины полипептидной цепи, концентрации белка и может варьировать от розового до сине-фиолетового цвета.
Обобщая полученные результаты по пиролизу соматотропина, необходимо отметить, что метод пиролитической газовой хроматографии не может использоваться для идентификации соматотропина, а должен применяться для предварительного исследования проб/образцов на наличие веществ белковой природы. Это обусловлено особенностями самого метода, так как состав продуктов пиролиза зависит не только от условий проведения анализа (время анализа, режим термостата колонки, режим ввода, поток газа-носителя, температура пиролитического
испарителя), но и определяется сложностью состава образца, наличием других компонентов (в состав препаратов соматотропина входит полисорбат, маннитол, причем в количестве, значительно превышающем количество активного белка) и возможностью протекания реакций между продуктами пиролиза.
При пиролизе соматотропина среди других часто встречающихся фрагментов (диоксид углерода, аммиак, азот, вода, ацетонитрил), получающихся при пиролизе многих азотсодержащих соединений, обнаружены характеристические соединения, обусловленные присутствием в составе молекулы аминокислотных остатков, прежде всего серосодержащих. Информация о структуре и масс-спектрах этих соединений может быть использована при первичной идентификации веществ белковой природы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенных исследований разработаны способы идентификации соматотропина методом ВЭЖХ и КЭ с УФ-детектированием.
Перед использованием данных методов рекомендуется проводить предварительные исследования, направленные на установление в составе исследуемых проб или образцов веществ пептидной природы: качественные химические реакции (нингидриновая и/или биуретовая) и/или пиролиз с масс-спектрометриче-ским детектированием продуктов.
Разработанные способы идентификации соматотропина апробированы на лекарственном средстве ^^кгорт производства Дании, бывшем на исследовании в ЦЭКТУ. Результаты апробации представлены в табл. 2.
Таблица 2
Результаты идентификации соматотропина в лекарственном средстве Norditropin
Метод Установлено методикой Получено
ВЭЖХ
Время удерживания, мин 17,6±0,5 17,6
Капиллярный электрофорез
Время выхода, мин 7,7±0,8 7,6
Как видно из представленных данных, результаты апробации вполне удовлетворительные, что позволяет в дальнейшем использовать разработанные способы идентификации соматотропина методом ВЭЖХ и КЭ с УФ-детектированием в экспертной практике ЦЭКТУ.
В качестве исследовательского метода для контроля соматотропина перспективен метод масс-спектрометрии высокого разрешения с ионизацией электрораспылением. Данный метод представляется унифицированным и позволит проводить идентификацию практически всех веществ пептидной и белковой природы путем установления аминокислотной последовательности в молекуле и определения
моноизотопной молекулярной массы. Это значительно расширит экспертные возможности и позволит осуществлять таможенный контроль различных гормональных препаратов при появлении такой задачи, обусловленной расширением списков наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ.
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ
1. Туаева М. С., Ульяновская С. А., Дианов О. А., Баженов Д. В. Влияние соматотропно-го гормона на формирование структур челюстно-лицевой области и черепа // Современные проблемы науки и образования. 2020. № 5 [Электронный ресурс]. URL: https://science-education.ra/ru/article/view?id=30203 (дата обращения: 03.07.2023).
2. Дедов И. И. Клиническое использование ДНК-рекомбинантного гормона роста человека // Проблемы эндокринологии. 1993. № 39 (5). С. 65-67 [Электронный ресурс]. URL: https://doi.org/10.14341/probl11996 (дата обращения: 03.07.2023).
3. Запрещенный список 2020 года (приложение 1 к Международному стандарту Всемирного антидопингового кодекса) [Электронный ресурс]. URL: https://rusathletics.info (дата обращения: 03.07.2023).
4. Постановление Правительства РФ от 29.12.2007 № 964 «Об утверждении списков сильнодействующих и ядовитых веществ для целей статьи 234 и других статей Уголовного кодекса Российской Федерации, а также крупного размера сильнодействующих веществ для целей статьи 234 Уголовного кодекса Российской Федерации» [Электронный ресурс]. URL: government.ru/doct/all/62561/.
5. Государственный реестр лекарственных средств [Электронный ресурс]. URL: https://grls. rosminzdrav.ru/GRLS.aspx (дата обращения: 03.07.2023).
6. Laboratory Guidelines. Human Growth Hormone (hGH) Biomarkers Test [Electronic resource]. URL: https://www.wada-ama.org/en/resources/laboratory-guidelines-human-growth-hormone-hgh-biomarkers-test (дата обращения: 03.07.2023).
7. Федеральный закон от 12.04.2010 № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» [Электронный ресурс] // Официальный интернет-портал правовой информации. URL: www.pravo.gov.ru.
8. Karlsson G., Eriksson K., Persson A., Mansson H. and Soderholm S. The Separation of Recombinant Human Growth Hormone Variants by UHPLC // Journal of Chromatographic Science. 2013. Vol. 51. P. 943-949.
9. Varcheha N. N., Shafaatib A., Zarghib A., Aboofazelia R. Separation of Somatropin and Its Degradation Products by High-Performance Liquid Chromatography Using a Reversed-Phase Polymeric Column // Iranian Journal of Pharmaceutical Research. 2004. № 4. P. 209-213.
10. Riggin R. M., Dorulla G. K., Miner D. J. A Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatographic Method for Characterization of Biosynthetic Human Growth Hormone // Analytical Biochemistry. 1987. Vol. 167. P. 199-209.
11. Frenz John, Wu Shiaw-Lin, Hancock William S. Charactertzation of Human Growth Hormone by Capillary Electrophoresis // Journal of Chromatography. 1989. Vol. 480. P. 379-391.
12. Dupin P., Galinou F., Bayol A. Analysis of Recombinant Human Growth Hormone and its Related Impurities by Capillary Electrophoresis // Journal of Chromatography. 1995. Vol. 707. P. 396-400.
13. Березинская Е. И. Разработка унифицированного способа установления подлинности лекарственных средств пептидной и белковой природы методом масс-спектрометрии высокого разрешения: дис. ... канд. хим. наук. М.: МГУ им. М. В. Ломоносова, 2015.
14. Зверева И., Семенистая Е., Кротов Г., Родченков Г. Идентификация допинговых соединений пептидной природы, распространяемых через интернет // Аналитика. 2014. № 3. С. 58-70.
15. Кнорре Д., Мызина С. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 2000. 479 с.
16. Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков / пер. с англ. Ю. В. Алахова, Ц. А. Егорова, П. Д. Решетова, под ред. Ю. А. Овчинникова. М.: Химия, 1974. 464 с.
информация об авторах
Алискеров Абдурагим Рауфович - кандидат химических наук, первый заместитель начальника Центрального экспертно-криминалистического таможенного управления, Российская Федерация, 127591, Москва, Керамический проезд, 59, строение 2, e-mail: [email protected], тел.: 8 (985) 197-35-38;
Гольева Виктория Евгеньевна - кандидат химических наук, начальник отдела экспертизы товаров органического происхождения, Экспертно-криминалистическая служба - региональный филиал Центрального экспертно-криминалистического таможенного управления г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация, 344019, Ростов-на-Дону, проспект Шолохова, 50, e-mail: [email protected], тел.: 8 (863) 283-16-26.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. для цитирования
Алискеров А. Р., Гольева В. Е. Исследование соматотропина в таможенных целях // Вестник Российской таможенной академии. 2023. № 4. С. 71-85.
