CC BY
21
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ИНДУЦИБЕЛЬНОЙ ИЗОФОРМЫ NO-СИНТАЗЫ В СТРЕССПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТА ЭТИЛМЕТИЛГИДРОКСИПИРИДИН СУКЦИНАТА
Балашов В.П.2, Смирнов Л.Д.1, Балыкова Л.А.2, Герасимова Н.Г.2,МаркеловаИ.А.2,Кругляков П.П.2, Таланова Е.В.2
Институт биохимической физики имени Н.М. Эмануэля РАН1, Москва; Мордовский государственный университет имени Н.П.Огарева2, Саранск
Резюме
Проведен анализ экспрессии Ж-синтазы на белых мышах, подвергнутых хроническому иммобилизационному стрессу и получавших сукцинат 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина (ЭМГПС) при внутрибрюшинном введении. Проводили иммуногистохимическое исследование миокарда левого желудочка по традиционной методике с использованием первичных антител к индуцибельной изоформе Ж-синтазы. Экспрессия индуцибельной изоформы в кар-диомиоцитах при применении ЭМГПС значительно снижается по сравнению с животными, подвергнутыми хроническому иммобилизационному стрессу без введения ЭМГПС.
Ключевые слова: антиоксидант- этилметилгидроксипиридин сукцинат, КО-синтаза, хронический стресс.
Сегодня в литературе широко обсуждается участие КО-синтазной системы в реализации стрессорного и ишемического повреждения различных органов и систем организма [1, 2, 3, 4]. В связи с этим энзимы семейства КО-синтаз рассматриваются как вероятная мишень при изыскании новых кардиотропных средств и объяснения механизмов действия уже известных лекарственных препаратов. В этом плане особое внимание привлекает отечественный препарат, относящийся к группе водорастворимых азотистых гетероциклов — сукцината 2-этил-6-метил-3-гидро-ксипиридина (ЭМГПС), выпускаемый под коммерческими названиями «мексидол» и «мексикор». Препарат эффективен при остром инфаркте миокарда, стабильной стенокардии напряжения, гипертоническом кризе и ряде других состояний [5,6]. Механизм его действия, в перечисленных клинических ситуациях, опосредован не только наличием энергообеспечивающих и противоишемических свойств [7], но и предположительной способностью модулировать эффекты КО-синтазной системы [8]. Однако это предположение на сегодня не подтверждено прямыми исследованиями. В связи с этим, учитывая общность патогенеза стрессорного и ишемического повреждения миокарда [9], целью нашей работы явилось изучение участия индуцибельной изоформы КО-синтазы в реализации кардиопротекторного эффекта ЭМГПС при экспериментальном хроническом стрессе.
Материалы и методы
Исследование выполнено на 30 белых мышах (2024 г). Животные были разделены на три группы: 1-интактные мыши (контроль); 2 — животные, подвер-
гнутые хроническому иммобилизационному стрессу (25%, 30 суток, 6 раз в неделю); 3 — животные, подвергнутые хроническому иммобилизационному стрессу и получающие ЭМГПС (внутрибрюшинно, 20 мг/кг, 30 суток, 6 раз в неделю).
Количественный учет NO проводили по методу Голикова А.П. с соавт. с применением реактива Грис-са [6]. Для анализа экспрессии NO-синтазы животных гильотинировали под легким эфирным наркозом. Проводили иммуногистохимическое исследование миокарда левого желудочка по традиционной методике (авидин-биотиновый метод) с использованием первичных антител к индуцибельной изоформе NO-синтазы (iNOS, Santa Cruz, в концентрации 1: 400). В качестве контроля использовали инкубацию без первичных антител.
Результаты и обсуждение
Количественный анализ содержания оксида азота в миокарде мышей (табл 1.) свидетельствует о заметном дисбалансе этого важного мессенджера в условиях стрессорного повреждения. ЭМГПС, как показывают полученные нами результаты, эффективно нормализует количество NO в ткани сердца подопытных животных. Иммуногистохимическое исследование миокарда подопытных животных подтверждает важную роль индуцибельной изоформы NO-синтазной системы в развитии наблюдаемых колебаний NO.
У животных контрольной группы, находящихся в условиях стандартного двигательного режима, выявляется слабая иммунопозитивная реакция к индуци-бельной изоформе NO-синтазы. Однако топография
Российский кардиологический журнал № 2 (64) / 2007
Таблица 1
Влияние стресса и ЭМГПС на содержание оксида азота в миокарде мышей
Условия опыта N0, нмоль/г
Стандартная двигательная активность(контроль) 20,06+2,76
Иммобилизационный стресс 13,23+0,76*
Иммобилизационный стресс + ЭМГПС, 20 мг/кг 24,27+3,15**
Примечание: * - отличия от контроля достоверны при р<0,05; ** - отличия от иммобилизационного стресса достоверны при р<0,05.
реакции с антителами неоднородная. Энзим выявляется в рабочем миокарде, тогда как в эндотелии сосудов экспрессии данной изоформы не отмечается (рис.1).
В ответ на длительное стрессорное воздействие обнаруживается заметное усиление экспрессии индуци-бельной изоформы в различных участках миокарда (рис. 2). Однако остается открытым вопрос о разно-направленности тенденций влияния длительного стресса на содержание КО в миокарде и интенсивности экспрессии индуцибельной изоформы КО-синта-зы. На наш взгляд, данное обстоятельство свидетельствует о стресс-опосредованной разобщенности молекулярно-генетических процессов, лежащих в основе экспрессии изучаемой изоформы энзима и биохимических механизмов поддержания активности фермента. Вследствие этого стресс провоцирует выработку большого количества индуцибельной изоформы КО-синтазы, но к концу периода наблюдения фермент оказывается малоактивным, поскольку может быть частично инактивирован токсическими продуктами распада мембран и развивающимся метаболическим ацидозом.
Правильность этого предположения косвенно подтверждается способностью ЭМГПС корригировать стресс-опосредованный дисбаланс активности КО-синтазной системы.
ЭМГПС, обладающий антиоксидантными, энергообеспечивающими, антиацидотическими свойствами [7], способствует некоторому снижению экспрессии индуцибельной изоформы в кардиомиоцитах (рис. 3) по сравнению с животными, подвергнутыми хроническому иммобилизационному стрессу без применения препарата. Однако, как свидетельствуют данные табл. 1, КО-синтетическая активность этого пула фермента оказывается достаточно высокой.
Таким образом, при длительном стрессорном воздействии в эксперименте возникает характерный дисбаланс КО-синтазной системы. Стресс вызывает усиление экспрессии индуцибельной изоформы КО-синтазы, но синтезируемый фермент, по-видимому, является дефектным, вследствие чего обладает более низкой активностью, что сопровождается снижением суммарного количества КО в миокарде. Полученные нами результаты можно признать важными для харак-
Рис.2. Экспрессия 1Ы08 в миокарде мышей при хроническом стрессе х 260. Авидин-биотиновый метод.
Рис. 3. Экспрессия 1Ы08 в кардиомиоцитах сердца мышей при хроническом стрессе и применении ЭМГПС х 260. Ави-дин-биотиновый метод.
теристики механизмов стрессорного и, по-видимому, ишемического повреждения миокарда. Это предположение согласуется с данными других авторов о протекторной роли КО при экспериментальном инфаркте миокарда [8].
Заключение
При применении ЭМГПС содержание КО в миокарде заметно нормализуется, что может объясняться повышением синтетической активности индуцибель-
Литература
1. Голиков П.П. Оксид азота в клинике неотложных заболеваний. М: Медпрактика-М, 2004; 61-75.
2. Ивашкин В.Т., Драпкина О.М. Клиническое значение оксида 8.
азота и белков теплового шока. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001; 1418. 9.
3. Малышев И.Ю., Манукина Е.Б.// Биохимия 1998, 63, №7; 992-1006.
4. Реутов В.П. //Успехи биол. химии 1995, 35; 189-228. 10.
5. Михин В.П., Михайлова Т.Ю., Харченко А.В. и др. Клинические исследования лекарственных средств в России 2003, №2; 11.
23-26.
6. Голиков А.П., Михин В.П., Полумисков В.Ю. и др.// Терапев- 12.
тический архив 2004, 76, №4; 70-74.
7. Сернов Л.Н., Смирнов Л.Д., Шапошникова Г.И. и др. Клини-
ной изоформы NO-синтазы. Кроме того, нельзя не учитывать теоретическую возможность усиления, под действием ЭМГПС, экспрессии эндотелиальной изоформы NO-синтазы, которая также может вносить определенный вклад в реализацию фармакологического эффекта сукцината 2-этил-6-метил-3-гидрокси-пиридина.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты: 05-04-49461-а).
ческие исследования лекарственных средств в России. 2004, №1; 24-28.
Голиков А.П., Бойцов С.А., Михин В.П. и др.// Лечащий врач 2003, №4; 70-74.
Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. — М.: Медицина, 1984, с. 272.
Kasem Nithipatekom, Phillip F. Pratt.// Eur. J. Clin. Biochem. 1996, №34, 133- 137.
Котляров А.А., Смирнов Л.Д., Куркина Н.В. и др.// Экспериментальная и клиническая фармакология. 2002, №5, 31-34. Липина Т.В.// Природа 2005, №8, 81-82.
Abstract
The authors analyzed NO-synthase expression in white mice exposed to chronic immobilization stress and receiving intraperitoneal 2-ethyl-6-methyl-3-hydroxypyridine succinate (EMHPS). Immune-hystochemical analysis of left ventricular myocardium was performed by standard method, with primary inducible NO-synthase isoform antibody use. Inducible isoform expression in cardiomyocytes exposed to EMHPS was significantly lower than in chronic immobilization stress without EMHPS administration.
Keywords: Antioxidant ethyl-methyl-hydroxypyridine succinate, NO-synthase, chronic stress.
Поступила 10/11-2006
