CC BY
16
УДК 578.824.31+547.597
Ключевые слова: вирус везикулярного стоматита, вирус парагриппа Сендай, противовирусная активность, А-секотритерпеноиды, бетулин
Key words: vesicular stomatitis virus, parainfluenza virus Sendai, antiviral activity, A-secotriterpenoids, betulin
Волкова Л. В., Гришко В. В., Перевозчикова Е. Н., Толмачева И. А.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СВОЙСТВ АЦЕТИЛГИДРАЗОНА 1-ЦИАНО-19р,28-ЭПОКСИ-2,3-СЕКО-18а-ОЛЕАН-3-АЛЯ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VIVO В ОТНОШЕНИИ ВИРУСОВ РОДОВ PARAMYXO- И VESICULOVIRUS
IN VIVO INVESTIGATION OF THE ANTIVIRAL ACTIVITY OF ACETYLHYDRAZONE 1-CYANO-19p,28-EPOXY-2,3-SECO-18a-OLEAN-3-AL AGAINST PARAMYXO- AND VESICULOVIRUSES
'Филиал ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед» Адрес: 614089, г. Пермь, ул. Братская, 177
1 Scientific Production Association "Biomed", Branch of Federal State Unitary Enterprise "Scientific Production Association "Microgen" of the Ministry of Health of the Russian Federation
Address: 614089, Russia, Perm, Bratskaya street, 177 2ФГБОУ ВПО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет» Адрес: 614990, Пермский край, г. Пермь, Комсомольский проспект, 29 2National Research Perm Technical University, Perm Address: 614990, Russia, Perm kray, Perm, Komsomolsky prospect, 29
3Институт технической химии Уральского отделения РАН Адрес: 614013, Пермский край, Пермь, ул. Академика Королева, 3 3Institute of Technical Chemistry of Ural Department Russian Academia Sciences Address: 614013, Russia, Perm kray, Perm, Akademik Korolev street, 3
Волкова Лариса Владимировна, д. м. н., проф. каф. химии и биотехнологии2, начальник цеха препаратов крови1
Volkova Larisa V., Doctor of Medical Science, Professor of the Dept. of Chemistry and Biotechnology2,
Head of the Dept. of Blood Preparations1 Гришко Виктория Викторовна, к. х. н., доцент, зав. лабораторией биологически активных соединений3 Grishko Victoria V., Ph.D. in Chemistry, Associate Professor, Head of the Laboratory of Bioactive Compounds3 Перевозчикова Елена Николаевна, к. м. н., начальник отделения интерферона1 Perevozchikova Elena N., Ph.D. in Medical Science, Head of the Dept. of Interferon1 Толмачева Ирина Анатольевна, к. х. н., ст. научн. сотрудник лаборатории биологически активных соединений3 Tolmacheva Irina А., Ph.D. in Chemistry, Senior Research Scientist of the Laboratory of Bioactive Compounds3
Аннотация. Проведено сравнительное исследование in vivo противовирусной активности полусинтетического тритерпеноида ацетилгидразона 1-циано-19р,28-эпокси-2,3-секо-18а-олеан-3-аля в отношении представителя семейства Rhabdoviridae рода Vesiculovirus вируса везикулярного стоматита штамм «Индиана» (VSV) и возбудителя семейства Paramyxoviridae рода Paramyxovirus вируса парагриппа 1 типа Сендай с индикацией в куриных эмбрионах по профилактической и лечебной схемам. Установлено, что исследуемое соединение не токсично и оказывает на вирус инактивирующее действие при введении в дозе 0,5 мг в аллантоисную полость куриного эмбриона за 24 ч до внесения исследуемых вирусов. Наибольшая лечебная активность соединения проявляется при введении препарата в течение первых 3 ч после заражения эмбрионов вирусом VSV
Summary. In vivo comparative research on the antiviral activity of semisynthetic triterpenoid acetylhydrazone 1-cyano-19fi,28-epoxy-2,3-seco-18a-olean-3-al against vesicular stomatitis Indiana virus, a member of the genus Vesiculovirus of the family Rhabdoviridae, and parainfluenza virus type 1 (Sendai virus), a member of the genus Paramyxovirus of the family Paramyxoviridae, with the use of chick embryos as indicators in compliance with prophylactic and therapeutic regimen has been conducted. It has been established that the compound under investigation is nontoxic and has an inactivating effect on the virus in case of introduction in the doze of 0.5 mg into the allantoic cavity of the chick embryo 24 hours before the introduction of the viruses under study. The compound shows its highest therapeutic activity within the first 3 hours after the embryos have been infected with vesicular stomatitis virus.
Введение способностью к подавлению репликации ви-
Известные лекарственные препараты, руса. В связи с этим поиск новых высокоэф-как правило, обладают строго специфичной фективных препаратов с широким спектром
противовирусного действия - одна из актуальных проблем современной медицины.
Достижения медицинской химии свидетельствуют, что перспективной базой для разработки новых лекарственных средств являются доступные природные соединения и их производные, среди которых наиболее выгодно выделяется растительный тритерпеноид бетулин. Ключевые критерии активного использования бетулина в синтетических превращениях с целью получения биологически активных соединений (в том числе с противовирусным действием) -это высокое содержание бетулина в бересте березы, его безопасность и разнообразная фармакологическая активность [5, 7]. Опыт мировой практики свидетельствует, что полусинтетические производные бету-лина обладают более высоким фармакологическим, а в ряде случаев - мультимедика-ментозным действием [5-7]. Так, описаны А секотритерпеновые производные, активные в отношении ВИЧ-1, вирусов гриппа А и герпеса простого [3, 8]. Недавно нами получен 2,3-секотритерпеновый ацетилги-дразон 18аН-олеананового типа (рис. 1) [4], в экспериментах in vitro показавший высокую вирулицидную, профилактическую и лечебную активность в отношении вируса везикулярного стоматита (VSV) [1, 2]. Иммунотропные свойства и отсутствие токсического эффекта ацетилгидразона in vivo [2] обусловили интерес к дальнейшим исследованиям противовирусных свойств данного препарата in vivo в экспериментах. В качестве биологической модели нами были выбраны куриные эмбрионы, а в качестве вирусного материала - вирусы VSV штамм «Индиана» и парамиксовирус парагриппа Сендай, имеющий общий антиген с вирусом парагриппа. Известно, что действию вируса везикулярного стоматита и вируса парагриппа, как правило, подвержены крупный рогатый скот, свиньи, лошади. При этом вирусы VSV, наряду с вирусами чумы, бешенства, ящура и птичьего гриппа, внесены в Список возбудителей заболеваний животных для экспортного контроля [9].
Цель настоящей работы - сравнительное исследование противовирусной активности
Рис. 1. Структура ацетилгидразона 1-циано-19р,28-эпокси-2,3-секо-18а-олеан-3-аля.
ацетилгидразона 1-циано-19р,28-эпокси-2,3-секо-18а-олеан-3-аля в отношении парамик-со- и рабдовирусов in vivo в экспериментах.
Материалы и методы
Ацетилгидразон 1-циано-19р,28-эпокси-2,3-секо-18а-олеан-3-аля получали согласно методике [4]. Исследуемый препарат использовали в дозе 0,5 мг, которую растворяли в 96%-м этаноле и доводили средой 199 или раствором буферным солевым до объема 0,2 мл, при этом конечная концентрация этанола составляла 10 %.
В работе использовали куриные эмбрионы (порода кур Хайсекс-Уайт) массой 55±5 г, полученные из местности, благополучной по особо опасным и карантинным болезням животных, что подтверждено наличием ветеринарного свидетельства. Инокулированные и интактные куриные эмбрионы (КЭ) инкубировали при температуре 37±1 °С и влажности 40-60 %. При овоскопии интактных КЭ установлено, что они живые, имеют хорошо развитую кровеносную систему и их развитие соответствует возрасту 10-11 сут.
Для изучения токсичности in vivo препарат вводили в аллантоисную полость 10-11 сут. КЭ. После инкубации при указанных выше параметрах в течение 48 ч эмбрионы вскрывали, оценивали степень развития их кровеносной системы, цитопатическое влияние аллантоисной жидкости на культуру ткани и гемагглютинирующую активность с эритроцитами КЭ, выраженную в гемагглю-тинирующих единицах (ГАЕ).
Для изучения противовирусного действия препарата в работе использовали VSV штамм
«Индиана» и парамиксовирус парагриппа Сендай, полученные из Государственной коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (Москва). Эксперименты с исследуемыми вирусными штаммами были разграничены временным интервалом и территориально во избежание перекрестной контаминации.
Инфицирование КЭ проводили вирус-содержащей аллантоисной жидкостью (ВАЖ) в аллантоисную полость. Титр взятой в работу ВАЖ VSV составлял не менее 105 (^ ED50 не менее 5), гемагглютинирую-щая активность вируса Сендай - не менее 16000 Ед/мл. Для инфицирования КЭ готовили разведение 10-3, вводили по 0,2 мл на эмбрион. В работе было сформировано 11 групп (табл. 1). Куриным эмбрионам 1 группы вводили только ВАЖ (контроль вируса, без добавления соединения); 2 группа являлась контрольной по выявлению действия 10 % раствора спирта этилового в отношении изучаемых вирусов; КЭ 3 группы -исследуемый образец (контроль соединения, без вируса); в 4 группе исследуемый препарат вводили в КЭ за 24 ч до внесения вируса; КЭ 5 группы - испытуемый образец и вирус вводили одномоментно. КЭ 6-11 групп инфицировали вирусом с последующим введением исследуемого соединения через опре-
деленный временной интервал - 1, 3, 5, 7, 8 или 24 ч соответственно.
Активность VSV в исследуемых образцах определяли путем титрования в 96 луночных планшетах для культуры клеток с использованием перевиваемой линии клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). Готовили десятикратные разведения испытуемого образца ВАЖ (от 10-1 до 10-8) в питательной среде 199. Далее в планшеты для культур клеток вносили по 100 мкл приготовленных разведений, используя на каждое разведение не менее 4 лунок. Инокулированные и контрольные культуры клеток инкубировали при температуре 36±1,0 °С в атмосфере с 5,0±0,5 % СО2. За титр вируса (активность вируса) принимали величину, обратную разведению ВАЖ, при котором в 50 % лунок с клеточной культурой проявляется цитопатическое действие вируса (ТЦД50/0,1мл). Активность вируса вычисляли методом Спирмена - Кербера (^ ЕБ50) и находили логарифм разведений по основанию 10.
Активность вируса Сендай оценивали в реакции гемагглютинации. В планшете готовили последовательные двукратные разведения ВАЖ от 1 : 2 до 1 : 64000, затем добавляли к ним 1 % взвесь эритроцитов КЭ в 0,9 % растворе натрия хлорида. Учет результатов проводили визуально через 1 ч.
Таблица 1.
Противовирусное действие ацетилгидразона 1-циано-19р,28-эпокси-2,3-секо-18а-олеан-3-аля в отношении УЗУ и вируса Сендай
№ п/п Условия внесения вируса и препарата Характеристика полученных образцов
Инфекционный титр VSV, ТЦД50/0,1 мл Уровень гемагглюти-нирующей активности вируса Сендай, ГАЕ/мл
1 Контроль вируса 105 32000
2 Спирт этиловый 10 % 105 32000
3 Контроль препарата 0 0
4 Препарат вносили за 24 ч до заражения КЭ 102 2000
5 Одномоментное внесение вируса и препарата 103 16000
6 Препарат вносили через 1 ч после заражения КЭ 103 32000
7 Препарат вносили через 3 ч после заражения КЭ 104 32000
8 Препарат вносили через 5 ч после заражения КЭ 105 32000
9 Препарат вносили через 7 ч после заражения КЭ 105 32000
10 Препарат вносили через 8 ч после заражения КЭ 105 32000
11 Препарат вносили через 24 ч после заражения КЭ 105 32000
В случае положительной реакции агглютинированные эритроциты образуют перевернутый «зонтик» с неровными, бахромчатыми, зубчатыми краями; в случае отрицательной реакции эритроциты оседают на дно в виде точки или кольца. Реакцию сопровождали контролем на отсутствие спонтанной агглютинации. Результат фиксировали в ГАЕ/мл.
Результаты исследований
По нашим данным, исследуемое соединение ацетилгидразон 1-циано-19р,28-эпокси-2,3-секо-18а-олеан-3-аля при использовании в дозе, соответствующей среднеэффективной концентрации (EC50), не оказывало цитопа-тического действия на перевиваемую линию клеток СПЭВ [1], в дозе 5 мг не проявило токсических свойств в отношении куриных эмбрионов (гибели не наблюдалось) и не обладало гемагглютинирующей активностью с эритроцитами куриных эмбрионов (табл. 1, контроль препарата - группа 3). Высокий уровень противовирусного действия в отношении VSV in vitro, индекс терапевтического действия [1] и отсутствие токсического эффекта in vivo позволили расширить диапазон дальнейших экспериментальных исследований данного препарата, включая оценку его противовирусного действия в условиях контактных опытов in vivo в отношении VSV, и провести дополнительные исследования активности препарата в отношении вируса Сендай.
Для оценки эффективности препарата in vivo использовали 10-11 сут. КЭ, при этом о развитии инфекционного процесса судили по накоплению вируса в аллантоисной полости эмбрионов. Как видно из представленных данных в табл. 1, снижение инфекционного титра VSV отмечалось при одномоментном введении препарата и ВАЖ, а также через 1 и 3 ч после заражения КЭ. Выраженный противовирусный эффект в отношении вируса Сендай проявился также при одномоментном введении КЭ препарата и ВАЖ. Наилучший эффект в обоих случаях достигался в условиях предварительной инкубации КЭ с изучаемым веществом в течение 24 ч до заражения КЭ исследуемым вирусом (группа 4). В указанных условиях зарегистрировано:
снижение lg ED50 VSV до 2, что соответствует уменьшению титра VSV с 105 до 102; в то время как гемагглютинирующее действие вируса Сендай снизилось в 16 раз и составило 2000 ГАЕ/мл.
Обсуждение результатов и заключение
В результате проведенных исследований установлено, что максимальное снижение инфекционности VSV и вируса Сендай регистрируется при внесении ацетилгидразона 1-циано-19р,28-эпокси-2,3-секо-18а-олеан-3-аля за 24 ч до заражения КЭ. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что исследованный препарат эффективно ингибирует репликацию VSV и вируса Сендай на ранних стадиях развития, что согласуется с полученными ранее данными о вирулицидном и профилактическом противовирусном действии данного препарата в отношении VSV in vitro [1, 2].
Таким образом, эксперименты in vivo подтверждают значительный потенциал исследуемого соединения в качестве профилактического противовирусного агента.
Благодарности
Работа поддержана грантами программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (№ 12-П-3-1009) и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2013 годы» (государственный контракт № 11.519.11.2033).
Список литературы
1. Галайко, Н. В. Противовирусная активность лупановых и 19р,28-эпокси-18а-олеанановых 2,3-секотритерпеновых гидразонов / Н. В. Галайко, И. А. Толмачева, В. В. Гришко, Л. В. Волкова, Е. Н. Перевозчикова, С. А. Пестерева // Биоорган. химия. - 2010. - Т. 36. - № 4. - С. 556-562.
2. Галайко, Н. В. Противовирусная и иммуно-тропная активность А-секотритерпенового ацетил-гидразона / Н. В. Галайко, Т. А. Баева, Ю. А. Кетова, Л. В. Волкова, С. В. Гейн, В. В. Гришко // Вестник Уральской медицинской академической науки. -2011. - Т. 38. - № 4/1. - С. 126-127.
3. Толмачева, И. А. Синтез и противовирусная активность 2,3-секо-производных бетулоновой кислоты / И. А. Толмачева, В. В. Гришко, Е. И. Бореко,
О. В. Савинова, Н. И. Павлова // Химия природ. со-един. - 2009. - №. 5. - С. 566-568.
4. Толмачева, И. А. Синтез ацилгидразонов на основе лупановых и 19р,28-эпокси-18а-олеанановых 2,3-секо-альдегидонитрилов / И. А. Толмачева, Н. В. Галайко, В. В. Гришко // Химия природ. соедин. -2010. - № 1. - С. 37-40.
5. Толстиков, Г. А. Бетулин и его производные. Химия и биологическая активность / Г. А. Толстиков, О. Б. Флехтер, Э. Э. Шульц, Л. А. Балтина, А. Г. Толстиков // Химия в интересах устойчивого развития. - 2005. - № 13. - С. 1-30.
6. Толстикова, Т. Г. Терпеноиды ряда лупана - биологическая активность и фармакологические перспек-
тивы. II. Полусинтетические производные лупана / Т. Г. Толстикова, И. В. Сорокина, Г. А. Толстиков, А. Г. Толстиков, О. Б. Флехтер // Биоорган. химия. -2006. - Т. 32. - № 3. - С. 291-307.
7. Krasutsky, P. A. Birch bark research and development / P. A. Krasutsky // Nat. Prod. Rep. -2006. - Vol. 23. - № 6. - С. 919-942.
8. Wei, Y. Synthesis and evaluation of A-seco type triterpenoids for anti-HIV-1 protease activity / Y. Wei, C.-M. Ma, M. Hattori // Eur. J. Med. Chem. - 2009. -Vol. 44. - P. 4112-4120.
9. http://www.australiagroup.net/ru/control_list_ animal.html
Новинка! Вышла в свет книга проф. Кудряшова А.А.
«ПАТОЛОГОАНАТОМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БОЛЕЗНЕЙ ЛОШАДЕЙ»
Данная книга является второй в серии «Ветеринарная патологическая анатомия», выпускаемой НОУ ДО «Институт Ветеринарной Биологии». Как и первая книга «Патологоанатомическая диагностика болезней собак и кошек» (www.invetbio.spb.ru/Kudryashov-2011.htm), настоящее издание является учебным пособием как для студентов ветеринарных факультетов, так и для врачей-иппологов.
В книге изложены порядок вскрытия лошадей, составления протоколов, правила отбора материала для дальнейших исследований, даны детальные описания 40 наиболее часто встречающихся заболеваний лошадей. Подробно освещены этиология, патогенез, клинические проявления и патологоанатоми-ческие изменения. Особое внимание уделено дифференциальной диагностике. Книга иллюстрирована большим количеством авторских фотографий, а также рисунками со схемами.
Тираж: 1000 экз. Формат: А5 (145 х 205 мм), мягкий переплет, 184 с. с илл.
Розничная цена книги - 800 руб. (с учетом почтовых расходов - 1040 руб.).
По вопросу приобретения обращайтесь по тел. +7 921 095-89-27, e-mail: [email protected]
Форма on-line заказа: www.invetbio.spb.ru/form_kniga_Kudryashov-loshadi.htm
-и—и—и—и—и—II—ü—ü—ü—ü—и—и—и—и—и—и—и—и—и—и—и—и—и—и—и—и—и-
ПРЕДИСЛОВИЕ
ВСКРЫТИЕ ТРУПОВ ЛОШАДЕЙ
1. Место вскрытия и инструментарий
2. Техника безопасности
3. Некоторые анатомические особенности лошади
4. Определение возраста лошади
5. Масть лошади
6. Порядок вскрытия
7. Техника исследования отдельных органов
8. Протоколирование вскрытия (протокол вскрытия)
9. Отбор и сохранение патологического материала, предназначенного для лабораторных исследований
ПАТОЛОГОАНАТОМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БОЛЕЗНЕЙ ЛОШАДЕЙ
ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ
1. Сибирская язва
2. Злокачественный отек
3. Некробактериоз
4. Столбняк
5. Ботулизм
6. Сальмонеллез
7. Листериоз
8. Лептоспироз
9. Моноцитарный эрлихиоз
10. Эпизоотический лимфангит
11. Язвенный лимфангит
12. Мыт
13. Кровопятнистая болезнь
ОГЛАВЛЕНИЕ
Сап
Туберкулез Бруцеллез
Инфекционная анемия
Герпесвирусные болезни
Грипп лошадей
Аденовирусная инфекция
Вирусные энцефалиты и энцефаломиелиты
Африканская чума однокопытных
Вирусный артериит
Бешенство
Болезнь Ауески
Оспа лошадей
Везикулярный стоматит
Коринебактериоз жеребят
Микотоксикозы
Идиопатический колит
ИНВАЗИОННЫЕ БОЛЕЗНИ
1. Бабезиоз
2. Трипаносомозы
3. Параскариоз
4. Деляфондиоз
5. Гастрофилез
НЕЗАРАЗНЫЕ БОЛЕЗНИ
1. Паралитическая миоглобинурия
2. Острое расширение желудка
3. Метеоризм кишечника
4. Перекручивание и заворот кишок
5. Амилоидоз печени
ИЛЛЮСТРАЦИИ
