CC BY
45
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
EXPERIMENTAL INVESTIGATIONS
© Коллектив авторов, 2000 УДК 618.19-006.6-085.277.3-092.4/9
Н. И. Шеренешева, И. П. Брызгалов, Ю. Д. Сорокина
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТА КАРИНАТ НА ШТАММЕ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА (РМЖ-1), ТРАНСПЛАНТИРОВАННОГО ИММУНО-ДЕФИЦИТНЫМ МЫШАМ (nude)
РОНЦим. Н. И. Блохина РАМН
Использование определенных соединений в лекарственных формах или в форме пищевых добавок, систематическое введение которых способно замедлить, остановить или подвергнуть обратному развитию процесс канцерогенеза, рассматривается как перспективное направление в профилактике злокачественных новообразований [7, 13]. К потенциально онкопрофилактическим средствам, содержащимся в лекарственных и пищевых растениях, относят витамины, полисахариды, изотиоционаты, тиогликозиды, индолы, терпены, фенолы, сульфиды, шз-полиненасыщен-ные кислоты и др. [6, 11]. Следует отметить, что только небольшое число этих соединений, таких, как р-каротин, токоферолы, витамин А, аскорбиновая кислота, аспирин, изучены сравнительно детально [2, 3, 9,10].
В отношении подавляющего большинства существуют только теоретические предпосылки о возможности использования последних для повышения противоопухолевой резистентности организма.
Чеснок (Allium sativum) издавна используется в народной медицине при различных заболеваниях. Современный интерес к использованию чеснока в терапии и профилактике обусловлен новыми данными о его антибактериальных, противогрибковых, гипогликемических, гиполипидемическихи антиатеросклеротических свойствах [1, 4, 12]. Сведения об антиканцерогенной активности чеснока немногочисленны. Показано, что добавление чесночной пудры в корм, введение гомогената чеснока или выделенного из чеснока диалил-сульфона вызывало дозозависимое ингибирование метаболической активации нитрозосоединений и метилирования ДНК в тканях легких, печени, молочной железы у мышей и крыс, индуцированных данными канцерогенами [14, 17]. При введении крысам выделенного из чеснока диалилсуль-фяда наблюдалось увеличение уровня детоксицирующего
N.I.Sherenesheva, I.P.Bryzgalov, Yu.D.Sorokina
CARINAT ANTITUMOR ACTIVITY STUDY ON A HUMAN BREAST CANCER STRAIN TRANSPLANTED TO NUDE MICE
N.N.Blokhin Memorial Cancer Research Center, RAMS
The use of certain compounds as drugs or nutriceutics to slow, stop or reverse cancer development is a promising field of cancer control [7,13]. Potential cancer prevention agents are vitamins, polysaccharides, isothiocyonates, thioglyco-sides, indoles, therpens, phenols, sulfides, co3-polyunsaturat-ed acids etc. [6,11]. However, there are few compounds such as p-carotene, tocopherols, vitamin A, ascorbic acid, aspirin that are studied rather well [2,3,9,10].
As to other agents there is only theoretical rationale for their use to increase antitumor resistance of the body.
Garlic (Allium sativum) has been used in traditional medicine against many diseases for centuries. New findings confirming garlic antibacterial, antifungal, hypoglycemic, hypolipidemic and antisclerotic activities [1,4,12] stirred up the interest to its use in therapy and prophylaxis. There are but few data on garlic anticarcinogenic activity. It was demonstrated that addition of garlic powder to feed and administration of garlic homogenate or dialylsulfone extract induced dose-dependent inhibition of nitroso compounds metabolic activity and DNA methylation in lung, liver, breast tissues in rats and mice [14,17]. Administration of garlic extract of dialylsulfide to rats increased concentration of the detoxification enzyme glu-bathion-S-transferase in liver and esophagus, and led to a fall in N-nitrosomethylbenzylamine-induced esophageal cancer incidence [19]. Garlic enrichment with selenium increased its anticarcinogenic activity [16]. Administration of garlic water extract or garlic powder from the plant growing on selenium-enriched soil and containing large concentrations of selenium organic compounds led to a more marked decrease in dimethylbenzanthracene- and methylnitrosourea-induced breast cancer incidence [15,18]. A case-control epidemiological study demonstrated an inverse relationship between garlic administration and rectal cancer incidence [20].
Экспериментальные исследования
фермента глубатион-8-трансферазы в печени и пищеводе и снижение частоты рака пищевода, индуцированного N-нит-розометилбензиламином [19]. Эффективность антиканцерогенного действия чеснока усиливалась при обогащении его селеном [16]. Так, введение в корм крысам водного экстракта или порошка чеснока, выращенного на почве, обогащенной селеном, и содержащего значительное количество селена в органической форме, вызывало более выраженное снижение частоты возникновения опухолей молочных желез, индуцированных диметилбензантраценом и метилнит-розомочевиной по сравнению с действием обычного чеснока [15, 18]. Данные эпидемиологического исследования, проведенного методом «случай — контроль», свидетельствуют об обратной зависимости между употреблением чеснока и частотой рака прямой кишки [20].
Все изложенное выше явилось основанием для изучения возможного противоопухолевого действия нутрицевтика карината — отечественного препарата на основе чеснока и витаминов Е, С и (3-каротина — на штамме рака молочной железы человека РМЖ-1, трансплантированного иммуно-дефицитным мышам (nude).
Материалы и методы. Исследование проводилось на бестимусных мышах (nude) на основе линии Balb/c 10—12-недельного возраста, массой 18—21 г разведения РОНЦ РАМН. Для трансплантации был взят штамм рака молочной железы человека РМЖ-1, ранее полученный из первичного клинического материала. Гистологические характеристики штамма и первичной опухоли были идентичны и представлены железистой структурой. С целью стандартизации количества вводимого опухолевого материала трансплантация РМЖ-1 проводилась клеточной взвесью, полученной из данной опухоли в результате ее трипси-низации по стандартной методике (трипсинизация проводилась в растворе трипсин—версен 1:1, популяция жизнеспособных клеток составила около 90% при окраске трипановым синим). Трансплантация опухолевых клеток проводилась всем животным подкожно в правую подлопаточную область в количестве по 800 тыс. клеток в 0,2 мл PBS. Каринат (производства ООО «ИнатФарма») использовали в таблетированной форме, содержащей чесночный порошок (129 мг), (3-каротин (2,5 мг), витамин Е (1 мг) и витамин С (1 мг). Препарат вводили животным опытной группы перорально в виде водной суспензии в конечной концентрации 20,6 мг на 1 кг массы тела (расчет по содержанию чесночного порошка). Объем вводимой суспензии составлял 0,2 мл на животное. Препарат вводили ежедневно начиная за 3 дня до трансплантации опухоли и до 14-го дня после трансплантации. Контрольная группа животных получала дистиллированную воду по той же схеме. Измерение размеров опухоли было начато с 4-го дня с момента появления первой опухоли у животных в контрольной группе и проведено на 6, 10,13,17,20 и 23-й дни от момента трансплантации. Объем опухоли высчитывали по формуле 6 • L • S • Н, где Н принималась равной 0,5 от наибольшего размера опухоли. Статистическая обработка данных проводилась по методу Стыодента [7,8].
Результаты. В контрольной группе визуально появление опухоли было отмечено у 1 животного на 6-й день и у остальных 5 животных на 8—10-й день (табл. 1).
Среднее значение объема опухоли в контрольной группе не имело существенных отклонений от данных, полученных в лаборатории в качестве характеристики штамма [5]. Индивидуальные кривые роста опухолей были практически идентичны у всех животных.
В опытной группе время визуального появления опухолей имело значительные колебания — от 4 до 11 дней (табл.
2). У 7 мышей опухоль появилась на 4—
5-й день, у 4 — на 6-й, у 2 — на 9-й,
Considering the above-said we attempted a study of antitumor potential of carinat, a Russian nutriceutic on the basis of garlic and vitamins E, C, (3-carotene, on the human breast cancer strain RMZh-1 transplanted to nude mice.
Materials and Methods. The study was performed on. nude Balb/c mice 10 to 12 week of age with a body weight 18 to 21 g, bred at the CRC, RAMS. The transplant was prepared from the RMZh-1 human breast cancer strain previously obtained from clinical specimens. The strain and the primary tumors had identical glandular histology. The transplantation was performed with RMZh-1 cell suspension prepared by trypsinization according to standard technique (1:1 trypsin-versene solution; about 90% viable cells by tripan blue staining). Tumor cell transplantation was made to all animals into the right subscapular region at 800,000 cells in 0.2 ml PBS. Carinat (Inatpharma) tablets containing 129 mg garlic powder, 2.5 mg P-carotene, 1 mg vitamin E and 1 mg vitamin C were given to test animals per os as water suspension at a final concentration 20.6 mg per kg body weight (as calculated by garlic content). The suspension volume was 0.2 ml per animal. The drug was administered daily from day 3 before till day 14 after tumor transplantation. Control animals received distilled water by the same schedule. Tumor measurements were started on day 4 from first tumor detection in control animals and continued on days 6,10,13, 17, 20 and 23 from transplantation. Tumor volume was calculated by formula 6*L*S*H, where H was 0.5 of the largest tumor dimension. Statistical analysis of differences was performed by Student's test [7].
Results. In the control group the tumors were detected visually on day 6 in 1 animal and on days 8 through 10 in the remaining 5 animals (table 1). Mean tumor volumes demonstrated no considerable difference from strain laboratory characteristics [5]. Individual tumor growth curves were identical in all animals.
In the test group the tumors were detected visually within days 4 through 11 (table 2): on days 4-5 in 7, on day 6 in 4, on day 9 in 2 and on day 11 in 1 mice. Thus, 10 of 13 mice were tumor-bearing by day 6 in the test group against 1 of. 6 mice in the control. After day 13 some mice presented with tumor growth inhibition as reflected by a plateau of individual tumor growth curves. The remaining mice had the same tumor growth curves as the controls. The tumor growth inhibition in the test group as compared to the control was confirmed by data summarized in table 3. Mean tumor volume in the test vs control group was 2083% on day 6,95.5 on day 10, 70.8% on day 13, 47.9% on day 17, 58.4% on day 20, 61.3% on day 23. So, the tumor inhibition trend under the carinat effect was seen from day 6 to reach statistical significance on
Таблица 1 Table 1
Объем опухолей у мышей контрольной группы / Tumor volume in control mice
Число мышей День наблюдения
6-й 10-й 13-й 17-Й 20-й 23-Й
1 0,0 2,08 38,22 105,3 224,64 405,60
2 0,0 9,36 50,96 208,0 395;46 585,0
3 0,0 83,20 254,80 532,48 758,16 1144,0
4 0,0 83,20 223,08 599,04 676,26 1032,46
5 7,02 83,20 263,64 589,68 673,92 1040,0
6 0,0 9,36 116,48 351,52 468,0. 665,60
Средний объем опухоли, мм3 Mean tumor volume, mm3 1,17 45,07 157,86 397,67 532,74 812,11
Среднестатистическое отклонение Standard deviation 2,866 41,857 102,268 209,369 204,60 299,644
No. of mice Days of follow-up
'Experimental Investigations
Таблица 2 Table 2
Объем опухолей у мышей опытной группы / Tumor volume in test mice
Число мышей День наблюдения
6-й 10-Й 13-й 17-Й- 20-Й 23-й
1 0,0 0,0 2,08 19,50 76,44 89,18
2 0,0 2,08 16,64 63,70 116,48 234,0
3 0,0 2,08 16,64 32,50 65,52 168,48
4 2,08 16,64 46,80 116,48 299,52 702,0
5 2,08 16,64 46,80 116,48 299,52 702,0
6 2,08 16,64 46,80 101,92 283,14 611,52
7 2,08 16,64 46,80 101,92 299,52 702,0
8 32,50 89,18 189,54 374,40 507,0 560,56
9 32,50 89,18 189,54 374,40 527,28 931,84
10 16,64 46,80 133,12 189,54 189,54 189,54
11 89,18 89,18 188,76 299,52 509,60 509,60
12 89,18 89,19 283,14 346,06 346,06 374,40
13 56,16 89,18 251,68 351,52 526,50 702,0
Средний объем опухоли, мм3 Mean tumor volume, mm3 24,96 43,34 112,18 191,38 311,24 498,24
Среднестатистическое отклонение Standard deviation 33,376 39,426 97,654 137,409 168,658 262,592
No. of mice Days of follow-up
Таблица 3 Table 3
у 1 — на 11-й день. Таким образом, в опытной группе к 6-му дню опухоли обнаруживались у 11 из 13, в то время как в контрольной группе на этот срок только у 1 из 6 мышей. После 13-го дня у части животных отмечалось торможение роста опухолей, что выразилось в изменении индивидуальных кривых роста опухолей с выходом их на плато. У остальных животных кривые роста опухолей были аналогичны таковым в контрольной группе. Процесс торможения роста опухолей в опытной группе по сравнению с контрольной подтверждается данными, представленными в табл. 3. Средний объем опухолей в опытной группе по сравнению с контрольной составил на 6-й день 2083%, на 10-й — 95,5%, на 13-й — 70,8%, на 17-й на 20-й — 58,4%, на 23-й — 61,3%. Как видно, тенденция торможения роста опухолей под действием препарата ка-ринат проявилась начиная с 6-го дня и реализовалась в статистической достоверности на 20-й день исследования (р = 0,049). В ранние сроки после трансплантации опухолевых клеток мышам отмечен факт некоторого ускорения роста первичного опухолевого узла на фоне приема карината.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Блок Е. //В мире науки. — 1985. — № 5. — С. 59—65.
2. ЗаридзеД. Г., Букин Ю. В. //Волр. онкол. — 1990. — Т. 36, № 6.
- С. 643-653.
3. Морозкина Т. С. Энергетический обмен и питание при злокаче-
ственных новообразованиях. — Минск, 1989.
4. Орехов А Пивоварова Е. М. //Ангиология и сосуд, хир. —
1995.-№ 1.-С. 158-162.
5. Ревазова £ С. Рост опухолей человека у бесгимусных мышей, получе-
ние штаммов опухолей человека, их характеристика и использование в химиотерапии: Автореф. дис.... д—рамед. наук. — М., 1981.
6. Сергеев А. В., Сыркин А. Б., Шлянкевич М. А. //Вопр. мед. химии.
- 1992. - № 6. - С. 5-8.
7. Трапезников Н. Н. //Веста. Моск. онкол. о—ва. —1995. — № 1. — С. 7.
8. Турусов В. С., Парфенов Ю. Д. Методы выявления и регламенти-
рования химических канцерогенов. — М., 1986.
9. Шеренешева Н. И. //Вопр. питания. — 1993. — № 4. — С. 13—17.
10. Шлянкевич М. А., Сергеев А. В., Голубева 3. И. //Вопр. мед. химии. - 1993. - № 4. - С. 13-17.
11. Bertram В., Frank N. //J. Inviron. Sci. Hlth. — 1993. — Vol. 11, N l.-P. 1-71.
12. Dalvi R. R., Salunkhe D. K. //J. Maharashtra Agr. Univ. — 1993. — Vol. 18, N3,- P. 378-381.
13. Decloitre S. //Med. et nutr. — 1996. — Vol. 32, N 4. — P. 153.
14. HongJ.—Y., Smith Т., Huang W.—G. etal. //Int. Symp. Microsom. and Drug. Oxidat., 10—th: Abstracts. — Toronto, 1994. — P. 542.
15. Ip C., LiskD. J., Tompson H. J. //Carcinogenesis. — 1996. — Vol. 17, N 9. - P. 1979-1982.
16. Ip C., LiskD. J. //Ibid. - 1994. - Vol. 15, N 9. - P. 1881-1885.
Средние объемы опухолей в контрольной (VK) и опытной <Von) группах мышей nude
Mean tumor volumes in control (Vc) and test (Vt) nude mice
Средний объем опухоли, мм3 День наблюдения
6-й 10-й 13-й 17-Й 20-Й 23-Й
v0„/vt VJV / MJ4X, % 1,2 25,0 2083 45.0 43.0 95,5 158.0 112.0 70,8 398.0 191.0 47,9 532.0 311.0 58,4 812,0 498,0 61,3
Mean tumor volume, mm3 Days of follow-up
day 20 of the study (/7=0.049). Primary tumor growth was somewhat accelerated on the first days following transplantation in mice receiving carinat.
17. Lin X.-Y, Liu J.-Z, Milner J. A. //Ibid. - N 2. - P. 349-352.
18. Lu J., Pei H., Ip C. et al. //Ibid. - 1996. - Vol. 17, N 9. - P. 1903-1907.
19. Wargovich М. I., Imade O. //J. Cell Biochim. — 1993. —
Suppl. — P. 91—94.
20. Yang G., Ji B., Gao Y. et al. //Yingyangxuebao = Acta nutr. Sin. - 1993. - Vol. 15, N 3. - P. 309-317.
Поступила 23.04.99 / Submitted 23.04.99
