CC BY
78
УДК 664.764:[579:577.114]
DOI: 10.15587/2313-8416.2015.40627
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КСИЛООЛИГОСАХАРИДОВ ИЗ ПШЕНИЧНЫХ И РЖАНЫХ ОТРУБЕЙ IN VITRO
© Е. Д. Журлова, Л. В. Капрельянц
В статье представлено исследование пребиотической активности препаратов ксилоолигосахаридов in vitro, полученных путём ограниченного ферментативного гидролиза пшеничных и ржаных отрубей, согласно результатам которого препараты КОС, показавшие высокое стимулирующее действие на рост пробиотических культур, сравнимое с классическим пребиотиком лактулозой, можно рекомендовать для включения в состав функциональных продуктов, предназначенных для коррекции микрофлоры кишечника
Ключевые слова: пшеничные и ржаные отруби, пребиотическая активность, ксилоолигосахариды, лак-тулоза, лактобактерии, бифидобактерии
The article presents a study of prebiotic activity of xylooligosaccharides in vitro, obtained by limited enzymatic hydrolysis of wheat and rye bran. The results showed a high prebiotic effect of XOS comparable with the classical prebiotic lactulose. It can be recommended as the functional supplement designed for t correction of microflora
Keywords: wheat and rye bran, prebiotic activity, xylooligosaccharides, lactulose, lactobacteria, bifidobacteria
СЫЬСЬКОГОСПОДАРСЬК! НАУКИ
1. Введение
Биотехнологии получения природных олигос-ахаридов-пребиотиков, которые способствуют поддержанию иммунной системы человека, регулируя микрофлору кишечника и индуцируя положительные эффекты не только на уровне желудочно-кишечного тракта, но и организма в целом, - одно из основных направлений современной нутрициологии.
Ксилоолигосахариды (КОС) - это углеводные олигомеры, молекулы которых построены из остатков ксилозы, соединённых в основном р-(1—>4)-гликозидными связями. КОС получают путём ограниченного гидролиза ксиланов, которые являются основными компонентами растительных гемицеллю-лоз - гетерополисахаридов с гомополимерными ответвлениями ксилопиранозных остатков. В зависимости от источника ксилана, используемого для получения КОС, строение их варьируется по степени полимеризации (от 2 до 10), мономерному составу и типам связей. В общем, КОС представляет собой смесь олигосахаридов, образованных из остатков ксилозы, связанных между собой р-(1—4)-связями [1, 2]. КОС являются ценными пищевыми ингредиентами для функциональных продуктов и они имеют потенциальные пребиотические свойства.
2. Литературный обзор
Пшеница и рожь являются важнейшими компонентами в питании населения Украины, употреб-
ление хлебопродуктов составляет 40-45 % от общего рациона [3]. Продукты переработки этих злаковых культур (отруби) являются богатейшим сырьевым источником ксиланов (28-34 %), из которых путём ограниченного химического или ферментативного гидролиза получают препараты КОС. Многочисленные исследования препаратов ксилоолигосахаридов показали многообразие их биологических свойств, среди которых проявляются митогенная, антиокси-дантная, антивоспалительная и антигиперлипидеми-ческая активности. Однако, важнейшим свойством КОС является их пребиотическая активность - избирательное стимулирование роста пробиотической микрофлоры кишечника человека [2, 4]. Пребиоти-ки - неусваиваемые пищевые ингредиенты, способствующие пролиферации и адсорбции бифидо- и лак-тобактерий в кишечнике [4]. К ним относят лактуло-зу, лактосахарозу, галакто-, фрукто-, изомальтооли-госахариды, лизоцим, дрожжевые экстракты, низко-осахаренная кукурузная патока, ячменно-солодовый экстракт, гидролизаты казеина и сывороточных белков, муцин, пантетин, лактоферрин и другие [5].
Бифидо- и лактобактерии в толстом кишечнике секретируют гидролитические ферменты, расщепляющие КОС, при этом выделяются энергия, необходимая для их размножения и роста, а так же метаболиты (органические кислоты), короткоцепочечные жирные кислоты, способствующие сокращению популяции патогенной микрофлоры [6].
Общий положительный эффект
Рис. 1. Механизм пребиотического воздействия
Важнейшей функцией действия пребиотиков является влияние на рост микроорганизмов и их количество в толстой кишке. Известны исследования их антипатогенного и антиканцерогенного воздействий, позволяющих снизить уровень риска заболеваний кишечника. На рис. 1 представлен механизм действия пребиотиков, который включает в себя следующие положительные эффекты: увеличение объёма и улучшение влажности стула, снижение уровня холестерина, количества длинноцепочечных жирных кислот, значения рН, а так же интенсификацию адсорбции минеральных веществ [6].
Целью данной работы является исследование in vitro пребиотической активности ксилоолигосаха-ридов пшеничных отрубей в сравнении с известным пребиотиком - лактулозой.
3. Методика проведения экспериментов
Фракционный состав КОС определяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), предложенным Кубатой и др. [7]. Моносахаридный состав препаратов КОС сухого и сиропа определяли методом ТСХ, предложенным Чандражу и др. [8].
В качестве пробиотических культур использовали препарат Bifidobacterium bifidum «Бифи-думбактерин-Биофарма» и культура Lactobacillus acidophilus-Ep-317/402. Препарат лактобактерий сухой предварительно растворяли в питательной среде MRS и культивировали при температуре 37 °С в течение 24 ч. Затем закваску вносили для культивирования в обезжиренное коровье молоко в асептических условиях. В качестве источника углерода добавляли исследуемые пребиотики с концентрацией 2 %. Подсчет количества клеток лакто-бактерий осуществляли по методу, изложенному в ГОСТ 10444.11-89 «Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов» [9].
Препарат «Бифидумбактерин-Биофарма» предварительно растворяли в тиогликолевой питательной среде и культивировали при температуре 37 °С в течение 24 ч. Затем его вносили в подготовленные для культивирования питательные среды. В качестве источника углерода добавляли исследуемые пребиоти-ки с концентрацией 2 %. Подсчет клеток бифидобак-терий проводили методом, основанном на их способности к росту в полужидких питательных средах, разлитых высокими столбиками в пробирках, при температуре 36...38 °С с образованием колоний в виде «гвоздиков» в течение 2.3 суток.
Ферментацию проводили, контролируя показатели активной и титруемой кислотности каждые 2 ч [10].
Статистический анализ данных проводили методом наименьших квадратов. При количестве по-вторностей опытов n=3 и допустимой величине относительной ошибки не превышающей 5 % (Р>0,95) результаты считали достоверными [11].
Результаты исследований были обработаны с помощью программы пакета Microsoft Office табличного процессора Microsoft Excel.
4. Обсуждение результатов
В работе была исследована in vitro пребиоти-ческая активность КОС из пшеничных отрубей, полученных методом ограниченного ферментативного гидролиза [12]. Моносахаридный состав необработанных пшеничных отрубей представлен в табл. 1.
Препараты КОС добавляли в питательную среду, как в сухом виде, так и в виде сиропа. Химический состав препаратов приведен в табл. 2.
В табл. 3 представлен углеводный состав образцов препаратов КОС, которые были использованы в качестве источника углерода: сухой препарат КОС из пшеничных отрубей, сироп КОС из пшеничных отрубей, сухой препарат КОС из ржаных отрубей, сироп КОС из ржаных отрубей.
Таблица 1
Моносахаридный состав пшеничных (1) и ржаных (2) отрубей (% абс. сух.в.) (n=3, P<0,95)
№ Арабиноза Рамноза Галактоза Глюкоза Ксилоза Манноза
1 7-9 0-0,1 0,7-1 19,8-24 12-16 0-0,3
2 6,5-8 0 0,8-1,1 25-26 13-15 0-0,1
Таблица 2
Химический состав препаратов КОС из пшеничных и ржаных отрубей (п=3, Р<0,95)
Показатель Количество, %
Пшеничные отруби Ржаные отруби
Сухой Сироп Сухой Сироп
Влажность 8 30 8 30
Углеводы 76,5 58,2 76 57,8
КОС 65,4 49,8 68 51,7
Белок 5,8 4,4 6 4,6
Зола 9,7 7,4 10 7,6
Таблица 3
Углеводный состав образцов препаратов КОС из пшеничных и ржаных отрубей (п=3, Р<0,95)
КОС Общее содержание углеводов, % КОС, % Моносахариды, %
Ксилоза Арабиноза Глюкоза Галактоза Манноза
Пшеничные отруби
КОС сухой 76,5 65,4 43,6 12,4 13,3 4,4 2,8
КОС сироп 58,2 49,8 28,4 8,2 8,7 2,7 1,8
Ржаные отруби
КОС сухой 76,0 68,0 45,6 12,2 12,9 5,3 0
КОС сироп 57,8 51,7 34,7 9,3 9,8 4,0 0
Фракционный состав препаратов КОС был определён методом ТСХ и представлен в табл. 4.
Таблица 4
Фракционный состав препаратов КОС из пшенич-
ных и ржаных отрубей (n=3, P<0,95)
КОС Пшеничные отруби, % Ржаные отруби, %
Ксилоза 14,42 14,45
Ксилобиоза 15,19 15,23
Ксилотриоза 22,5 22,8
Ксилотетроза 23,08 22,9
Ксилопентоза 19,62 19,71
Высшие КОС 5,19 4,91
Преобладающими олигосахаридами в препаратах КОС, полученных ограниченным ферментативным гидролизом пшеничных и ржаных отрубей, являются ксилотетроза и ксилотриоза, их количество суммарно составляет 45,58 % и 45,70 %, соответственно. Согласно литературным данным, они обладают наибольшей пребиотической активностью среди прочих углеводных олигомеров ксилана [4, 6, 13].
Биохимическую активность лактобактерий определяли по нарастанию активной (рис. 2, 3) и титруемой кислотности (рис. 4, 5).
0 2 4 6 8 10 12
Продолжительность ферментации, ч
Рис. 2. Изменение активной кислотности в процессе накопления культуры Lb. acidophilus: 1 - контроль, 2 - лактулоза, 3 - КОС сухие, 4 - КОС сироп
В связи с тем, что сырьевой источник препаратов КОС не оказал влияния на показатели титруемой кислотности, рН и рост лакто- и бифи-добактерий, на графиках представлены данные по КОС в общем виде.
Из результатов видно, что в процессе культивирования и лакто-, и бифидобакте-рий происходило изменение значения рН среды и титруемой кислотности: для штаммов лактобактерий в течение 12 ч культивирования наблюдалось увеличение скорости кислото-образования и снижение показателя рН среды по сравнению с начальным их значением. Так же прослеживается больший пребиотический эффект КОС сухого по сравнению с лакту-лозой. За 12 часов культивирования рН в среде с добавлением КОС сухого снизилось до 4,4, в среде с добавлением лак-тулозы - до 4,4, в среде с добавлением КОС сиропа - до 4,55, а в контрольном образце составил 4,65. Показатель титруемой кислотности в среде с добавлением КОС сухого вырос до 73,5 °Т, в среде с добавлением лактулозы - до 73,8 оТ, в среде с добавлением КОС сиропа - до 71,9 °Т, в контрольном образце составил 63,3 °Т. Для штаммов бифидо-бактерий за 16 ч культивирования рН в среде с добавлением: КОС сухого снизилось до 4,4, лактулозы - до 4,43, КОС сиропа - до 4,5, молока составил 4,6. Показатель титруемой кислотности в среде с добавлением: КОС сухого вырос до 80 °Т, лактулозы - до 81 °Т, КОС сиропа - до 77,7 °Т, молока составил 62,2 °Т. Это свидетельствует о сокращении времени накопления биомассы пробиотических культур при стимуляции роста лакто- и би-фидобактерий КОС сухого по сравнению с пребиотиком -лактулозой. Более низкий показатель активности КОС сиропа связан с меньшей концентрацией пребиотика в препарате за счёт большего количества влаги (30 %).
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Продолжительность ферментации, ч
Рис. 3. Изменение активной кислотности в процессе накопления культуры B.bifldum: 1 - контроль, 2 - лактулоза, 3 - КОС сухой, 4 - КОС сироп
О 2 4 б 8 10 12
Продолжительность ферментации, ч
Рис. 4. Изменение титруемой кислотности в процессе накопления культуры Lb. acidophilus: 1 - контроль, 2 - лактулоза, 3 - КОС сухие, 4 - КОС сироп
90 1-1-1----1-1-1---1-1-ПГ1-1 2
О 2 4 6 8 10 12 14 16
Продолжительность ферментации, ч
Рис. 5. Изменение титруемой кислотности в процессе накопления культуры B.bifldum: 1 - контроль, 2 - лактулоза, 3 - КОС сухой, 4 - КОС сироп
16
I 14 1
a 12
a
I*
= 4! = a
S о
e Ml
с. .2
X
s
S
о
E
10
2 r3 4
S 1
J
1,5
2,5
Время, сут
Рис. 6. Динамика накопления клеток Lb. acidophilus при культивировании на средах с различными углеводами: 1 - контроль, 2 - лактулоза, 3 - КОС сухой, 4 - КОС сироп
14
I 12
вэ
Й 10 О
£
я < е U
8И
— SX £ ^ г
о
е
8
3 -- •
--с T
1,5
2,5
Время, сут
Рис. 7. Динамика накопления клеток 5. bifidum при культивировании на средах с различными углеводами: 1 - контроль, 2 - лактулоза, 3 - КОС сухой, 4 - КОС сироп
Стационарная фаза роста молочнокислых микроорганизмов характеризуется уравновешиванием размножения и отмирания бактерий под действием продуктов обмена. Эти изменения обусловлены ограничением количества питательных веществ, большой концентрацией клеток и накоплением токсичных продуктов обмена. Стационарная фаза размножения микроорганизмов (максимальная концентрация бактерий), после которой следует фаза замедления роста. При стационарном росте количество жизнеспособных клеток остаётся без изменений. Согласно данным рис. 5 и 6 активное накопление биомассы лакто- и бифидобак-терий наблюдается в первые 48 часов культивирования. В следующие 24 часа - незначительное накопле
ние биомассы бактерий, что позволяет сделать вывод о наступлении стационарной фазы роста молочнокислых микроорганизмов.
Количество клеток Lb. acidophilus на среде с добавлением КОС сухого составило 13,61014 КОЕ/см3 на третьи сутки культивирования, такой же показатель был получен на среде с добавлением лактулозы, что на 1,11014 КОЕ/см3 больше, чем в КОС сиропе и на 2,61014 КОЕ/см3 больше контроля (рис. 5). Количество клеток В. bifidum на среде с добавлением КОС сухого составило 12,43 • 1013 КОЕ/см3 на третьи сутки культивирования, такой же показатель был получен на среде с добавлением лакту-лозы, что на 0,63 • 1013 КОЕ/см3 больше, чем в КОС сиропе и на 2,33 1013 КОЕ/см3 больше контроля (рис. 6). При дальнейшем культивировании количество клеток Lb. acidophilus и В. bifidum не увеличивалось.
5. Выводы
Использование КОС пшеничных и ржаных отрубей в качестве пребиотика показало высокое стимулирующее действие на рост пробиотических культур Lb. acidophilus и В. bifidum, сравнимое с классическим пребиотиком лактулозой. Полученные данные активной и титруемой кислотности свидетельствуют о сокращении времени сквашивания молока: для Lb. acidophilus время сквашивания составило 10 ч, для В. bifidum - 12 ч. Количество клеток Lb. acidophilus и В. bifidum, выросших на среде с добавлением КОС показало такой же высокий результат, как и на среде с добавлением лактулозы и составило на 13,61014 КОЕ/см3 и 12,43 • 1013 КОЕ/см3, соответственно. Резюмируя вышеизложенное, препарат КОС из пшеничных и ржаных отрубей, после дополнительных медико-биологических исследований, можно рекомендовать для включения в состав функциональных продуктов, предназначенных для коррекции микрофлоры кишечника.
Литература
1. Kumar, G. P. A Review on Xylooligosaccharides [Text] / G. P. Kumar, A. Pushpa, H. Prabha // International Research Journal of Pharmacy. - 2012. - Vol. 8, Issue 3. -P. 71-74.
2. Singh, R. D. Prebiotic Potential of Oligosaccharides: a Focus on Xylan Derived Oligosaccharides [Text] / R. D. Singh, J. Banerjee, A. Arora // Bioactive Carbohydrates and Dietary Fiber. - 2014. - Vol. 73, Issue 1. - P. 1-28. doi: 10.1016/j.bcdf.2014.11.003
3. Kaprelyants, L. V. Bioactive compounds and dietary fibers in new developed cereal products [Text] / L. V. Kap-
relyants, O. S. Voloshenko, E. D. Zhurlova // Зернов1 продукта i комбжорми. - 2012. - № 3. - С. 17-21.
4. Reddy, S. S. Production of Prebiotics and Antioxidants as Health Food Supplements from Lignocellulosic Materials Using Multienzymatic Hydrolysis [Текст] / S. S. Reddy, C. Krishnan // Int. J. Chem. Sci. - 2010. - Vol. 3, Issue 3. - P. 535-549.
5. Gibson, G. R. Prebiotics: Development and Application [Text] / G. R. Gibson, R. A. Rastall. - John Wiley and Sons Ltd, 2006. - P. 256. doi: 10.1002/9780470023150
6. Slizewska, K. Carbohydrates - Comprehensive Studies on Glycobiology and Glycotechnology [Text] / K. Slizewska, J. Kapusniak, R. Barczynska, K. Jochym, -InTech, 2012. - 570 p. doi: 10.5772/51573
7. Kubata, B. K. Purification and Characterization of Aeromonas caviae ME-1 xylanase V, which produces exclusively xylobiose from xylan [Text] / B. K. Kubata, T. Suzuki, H. Horitsu, K. Kawai, K. Takamizawa // Appl. Environ. Micro-biol. - 1994. - Vol. 60, Issue 2. - P. 531-535.
8. Chandraju, S. Extraction, Isolation and Identification of Sugar from Banana peels (Musa Sapientum) by HPLC coupled LC/MS instrument and TLC analysis [Text] / S. Chan-draju, R. Mythily, C. S. Chidan Kumar // J. Chem. Pharm. Res. - 2011. - Vol. 3, Issue 3. - P. 312-321.
9. ГОСТ 10444.11-89. Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов [Електрон-ний ресурс] / Режим доступа: http://helpnik.college.ks.ua/ standart/gost/Catalog/Index/11/11148.htm
10. МВК 10.10.2.2.-119-2005 Визначення кшькосп бiфiдобактерiй у кисломолочних продуктах. Методичш вказшки [Електронний ресурс] / Режим доступу: http://text.normativ.ua/doc12926.php
11. Грачёв, Ю. П. Математические методы планирования экспериментов [Текст] / Ю. П. Грачёв. - М.: Пищ. пром-сть, 1979. - 200 с.
12. Журлова, Е. Д. Энзиматическое получение функциональных ингредиентов из зернового сырья [Текст]: сб. науч. докл./ Е. Д. Журлова, Л. В. Капрельянц // Техника и технология пищевых произодств. - Могилёв. - 2014. -Т. 1. - С. 88.
13. Aachary, A. A. Xylooligosaccharides (XOS) as an Emerging Prebiotic: Microbial Synthesis, Utilization, Structural Characterization, Bioactive Properties, and Applications [Text] / A. A. Aachary, S. G. Prapulla // Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. - 2011. - Vol. 10, Issue 1. - P. 2-16. doi: 10.1111/j.1541-4337.2010.00135.x
Referenees
1. Kumar, G. P., Pushpa, A., Prabha, H. (2012). A Review on Xylooligosaccharides. International Research Journal of Pharmacy, 8 (3), 71-74.
2. Singh, R. D., Banerjee, J., Arora, A. (2015). Prebiotic potential of oligosaccharides: A focus on xylan derived oligo-saccharides. Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre, 5 (1), 19-30. doi: 10.1016/j.bcdf.2014.11.003
3. Kaprelyants, L. V., Voloshenko, O. S., Zhurlo-va, E. D. (2012). Bioactive compounds and dietary fibers in new developed cereal products. Cereal products and Fodder, 3, 17-21.
4. Reddy, S. S., Krishnan, C. (2010). Production of Prebiotics and Antioxidants as Health Food Supplements from Lignocellulosic Materials Using Multienzymatic Hydrolysis. Int. J. Chem. Sci., 3 (3), 535-549.
5. Gibson, G. R., Rastall, R. A. (2006). Prebiotics: Development and Application. England: John Wiley and Sons Ltd, 256. doi: 10.1002/9780470023150
6. Slizewska, K., Kapusniak, J., Barczynska, R., Jo-chym, K. (2012). Carbohydrates - Comprehensive Studies on Glycobiology and Glycotechnology. InTech, 570.
doi: 10.5772/51573
7. Kubata, B. K., Suzuki, T., Horitsu, H., Kawai, K., Takamizawa, K. (1994). Purification and Characterization of Aeromonas caviae ME-1 xylanase V, which produces exclusively xylobiose from xylan. Appl. Environ. Microbiol., 60 (2), 531-535.
8. Chandraju, S., Mythily, R., Chidan Kumar, C. S. (2011). Extraction, Isolation and Identification of Sugar from Banana peels (Musa Sapientum) by HPLC coupled LC/MS instrument and TLC analysis. J. Chem. Pharm. Res., 3 (3), 312-321.
9. GOST 10444.11-89. Food products. Methods for determination of lactic acid microorganisms. Available at: http://helpnik.college.ks.ua/standart/gost/Catalog/Index/ 11/11148.htm
10. MIR 10.10.2.2.-119-2005 Determination of the number of bifidobacteria in dairy products. Methodological instructive regulations. Available at: http://text.normativ.ua/ doc12926.php
11. Grachov, U. P. (1979). Matematicheskie metodi planirovaniya eksperimentov [Mathematical methods of planning experiments]. Мoscow: Food Industry, 200.
12. Zhurlova, E. D., Kaprelyants, L. V. (2014). Enzi-maticheskoe poluchenie funkcionalnikh ingredientov iz zerno-vogo siriya [Enzymatic obtaining of functional ingredients from cereal raw material]. Technic and Technology of Food Manufacturing . Mogilyov (Belarus), 1, 88.
13. Aachary, A. A., Prapulla, S. G. (2010). Xylooligosaccharides (XOS) as an Emerging Prebiotic: Microbial Synthesis, Utilization, Structural Characterization, Bioactive Properties, and Applications. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 10 (1), 2-16. doi: 10.1111/j.1541-4337.2010.00135.x
Дата надходження рукопису 23.03.2015
Журлова Елена Дмитриевна, асистент, кафедра биохимии, микробиологии и физиологии питания, Одесская национальная академия пищевых технологий, ул. Канатная, 112, г. Одесса, Украина, 65039 Е-mail: [email protected]
Капрельянц Леонид Викторович, доктор технических наук, профессор, кафедра биохимии, микробиологии и физиологии питания, Одесская национальная академия пищевых технологий, ул. Канатная, 112, г. Одесса, Украина, 65039 Е-mail: [email protected]
