CC BY
35
БИОХИМИЧЕСКОЕ ПРОИЗВОДСТВО
УДК 573.6.086
Исследование пребиотических свойств маннозосодержащего гидролизата
The study of prebiotic properties manozostera hydrolysate
Доцент И.В. Черемушкина, (Воронежский государственный университет инженерных технологий) кафедра теории экономики, товароведения и торговли, тел. (8473)255-34-71 E-mail: [email protected]
профессор О.С. Корнеева (Воронежский государственный университет инженерных технологий) кафедра биохимии и биотехнологии
Associate Professor I.V. Cheremushkina, (Voronezh state University of engineering technology) chair of theory of economy, commodity research and trade, tel. (8473)255-34-71 E-mail: [email protected]
Professor O.S. Korneeva (Voronezh state University of engineering technology) chair of biochemistry and biotechnology
Реферат. Птицеводство является динамично развивающейся отраслью агропромышленного комплекса, обеспечивающей население биологически полноценной здоровой пищей. Опыт как российского, так и зарубежного птицеводства, свидетельствует о том, что рост конкурентоспособности отрасли на сегодняшний день находится в прямой зависимости от внедрения кормовых добавок, которые позволят максимально реализовать генетический потенциал продуктивности птицы. Важную роль в поддержании эффективного роста, здоровья и благополучия птицы играет микрофлора кишечника, дисбаланс которой приводит к нарушению продуктивности поголовья. Кроме того, недавние изменения законодательства стран ЕС, касающиеся использования антибактериальных препаратов, являются причиной повышенных требований к здоровью желудочно-кишечного тракта птицы. В работе идентифицирован и количественно определен состав маннозосодержащего гидролизата с помощью тонкослойной хроматографии с последующей обработкой хроматограмм с помощью денситометра CAMAG TLC Scanner 3 (Швейцария). Исследования активности маннозосодержащего гидролизата в опытах in vitro при культивировании бактерий Bifidobacterium bifidum на средах с различными углеводами, изучение интенсивности метаболических процессов и симбиотических отношений с представителем условно-патогенной микрофлоры бактериями Е. coli. свидетельствуют о высокой пребиотиче-ской активности манноолигосахаридов. Исследование пребиотических свойств лиофилизированного маннозосодержащего гидролизата в опытах in vivo на цыплятах-бройлерах кросса «ROSS 308» в состоянии антибиотико-ассоциированного дисбиоза показало, что препарат оказывал положительное влияние на динамику восстановления популяционного уровня основных представителей нормофлоры, что выражалось в увеличении количества лакто- и бифидобактерий и сдерживании роста бактерий группы кишечной палочки.
Summary. Poultry is the fastest growing sector of agriculture providing the population with biologically full-fledged healthy food. The experience of both Russian and foreign poultry, suggests that the growth of the competitiveness of the industry today is in direct proportion to the introduction of feed additives, which will maximize the genetic potential productivity of the birds. In maintaining efficient growth, health and well-being of birds the important role played by intestinal flora, an imbalance which leads to disruption of livestock productivity. In addition, recent changes in the legislation of EU countries regarding the use of antibacterial drugs is the cause of increased requirements to the health of the gastrointestinal tract of poultry. In the work identified, and the amount of the composition of man-notcodigo hydrolysate using thin-layer chromatography with subsequent treatment of the chromatograms with power densitometer CAMAG TLC Scanner 3 (Switzerland). Research activity minnesoter-had been hydrolysate in vitro by culturing the bacteria Bifidobacterium bifidum in media with different carbon waters, the study of the intensity of metabolic processes and symbiotic relationships with the representative of conditionally pathogenic microflora bacteria E. coli. indicate a high prebiotic activity of Russia. The study of prebiotic properties of freeze-dried hydrolysate minnesotabased in in vivo experiments on chickens-broilers cross «ROSS 308» in a state of antibiotic-associated dysbiosis showed that the drug had a positive influence on the recovery dynamics of the population level of the main representatives of the normal flora, which was reflected in the increase in the number of lactobacilli and bifidobacteria and limiting bacterial growth of E. coli.
©Черемушкина И.В., Корнеева О.С., 2016
Ключевые слова: маннозосодержахций гидролизат, пребиотические свойства, jS-маннаназа, манноза, микрофлора желудочно-кишечного тракта, дисбиоз.
Keywords: manozostera hydrolysate, prebiotic properties, P-mannanase, mannose, microflora of the gastrointestinal tract, dysbiosis.
В настоящее время актуальна проблема активного поиска экологичных альтернатив антибиотикам, не несущих потенциальной угрозы для конечных потребителей. К веществам, влияющим на здоровье и продуктивность птицы через регулирование микробной популяции в желудочно-кишечном тракте, относятся пребио-тики.
Вещества, обладающие пребиотической активностью, не перевариваются в кишечнике и в неизмененном виде поступают в толстую кишку, где становятся субстратами для бактерий с пробиотическими свойствами, которые уже содержатся в кишечнике, избирательно стимулируя их рост и/или метаболическую активность [ 1 ]. Кишечная микрофлора является мощной естественной защитой организма. Нарушение количественного и/ или качественного ее состава является источником интоксикации и развития аллергических реакций организма, усиливает патологические процессы в кишечнике, снижает темпы восстановительных процессов. В связи с этим расширение спектра пребиотических веществ является актуальной задачей биотехнологии.
К известным бифидогенным факторам относятся моносахариды и олигосаха-риды, являющиеся источником энергии для микроорганизмов [2]. В последнее время особое внимание уделяется минорным сахарам, таким, как манноза и фукоза [3, 4, 5]. В чистом виде они практически не встречаются в пишевых продуктах, а присутствуют в виде гомогенных или гетерогенных полисахаридов, которые не гидролизуются кислотами и ферментами желудочно-кишечного тракта [6]. Пребио-тическая активность маннозы хорошо изучена в отличие от манноолигосахаридов [4, 7, 8, 9].
Ниже приведены данные типичных опытов, каждое значение является средним как минимум из трех определений. Данные обрабатывали с помощью пакетов программ Excel 2003, Statiatica. При математической обработке использовали статистический критерий Стьюдента.
Для получения манноолигосахаридов использовали маннаны из пшеничных отрубей, выработанных в соответствии с требованиями ГОСТ Р 53496 [10]. Для гидролиза маннанов использовали спиртоосажденный препарат /3-мяннаназы Trichoderma harzianum F114 с активностью целевого фермента /3-маннаназы 8 050 ед/г. Гидролизовали растворы с массовой долей маннанов 10 % при температуре 60 °С, рН среды 4,5, 4 ч и дозировке ферментного препарата 15 ед/г [7]. При таких условиях степень гидролиза маннанов достигала 95 %. Об эффективности гидролиза судили по количеству редуцирующих веществ, образующихся в процессе гидролиза.
Маннозосодержащий гидролизат подвергали лиофильной сушке в вакууме. Продукты гидролиза маннанов идентифицировали с помощью тонкослойной хроматографии (рис. 1). Количественную обработку хроматограмм проводили с помощью денситометра CAMAG TLC Scanner 3 (Швейцария) сразу после проведения элюирования.
Экспериментальные данные показали, что в гидролизатах (п = 3, Р = 0,95, г = 0,99350) присутствовали в основном манноза, маннотриоза, маннотетроза и незначительное количество других олигомеров маннозы (рис. 2).
1 2
4
5
□ 1ч ■ 3 ч
манноза маннобиоза маинотриозаманнотетрозманнопентоза
Ci
С2 Сз
СА CI
С2
сз
Рис. 1. Хроматограмма гидролизата манна-нов пшеничных отрубей: 1 - манноза; 2 - маннобиоза; 3 - маннотриоза; 4 - манно-тетроза; 5 - маннопентоза; концентрации маннозы и маннаноолигосахаридов, г/л: с1 - 800, с2 - 400, сз - 200, с4 - 70 (время г идролиза 3 ч)
Рис. 2. Зависимость концентрации Сахаров (С, %) от времени гидролиза
Полученные результаты согласуются с литературными данными по составу гидролпзатов, образующихся под действием известных jS-маннаназ, и косвенно свидетельствуют о том, что jS-маннаназа Trichoderma harzianum F114 относится к ферментам эндодействия, а изменение фракционного состава гпдролпзатов говорит о трансгликозплирующей способности фермента.
Одним пз наиболее значимых и доминирующих представителей нормофло-ры является род Bifidobacterium бактерии, которые составляют от 85 до 98 % микрофлоры кишечника. С целью установления пребиотпческих свойств манно-зосодержащего гидролизата осуществляли культивирование бактерий Bifidobacterium bifidum in vitro на средах с различными углеводами.
Накопление биомассы В. bifidum определяли нефелометрически путем измерения оптической плотности клеточной суспензии бактерий при длине волны 560 нм. Биохимическую активность бифидобактерий определяли по нарастанию активной кислотности (рН).
Данные по динамике роста В. bifidum на различных источниках углерода показали, что микроорганизмы способны к росту на всех испытанных вариантах сред (табл. 1).
Таблица 1
Динамика накопления биомассы бифидобактерий на средах с различными углеводами
Время культивирования, ч Оптическая плотность суспензии бактерий
Вносимые углеводы
Контроль Манноза Маннозосо-держащий гидролизат Инулин Фруктоза
18 0,493 0,889 0,902 1,004 0,757
24 0,592 1,364 1,452 1,454 0,957
42 0,990 1,611 1,632 1,636 1,350
Максимальное накопление биомассы наблюдалось к 42 ч процесса культивирования бактерий. Наибольшая физиологическая активность культуры проявлялась при внесении в среду маннозы, маннозосодержащих гидролизатов и инулина. Следует отметить, что маннозосодержащие гидролизаты стимулировали развитие бифидобактерий в большей степени, чем манноза, и не уступали инулину.
Интенсивность метаболических процессов у бифидобактерий контролировали по изменению рН среды, что служит показателем трансформации Сахаров в органические кислоты как конечные продукты метаболизма. Представленные данные на рис. 3 свидетельствуют, что изменение величины рН коррелировало с ростом и развитием культуры бактерий на среде с маннозой и маннозосодержа-идам гидролизатом.
Рн
8
60
с. ч
Рис. 3. Динамика изменения pH среды культивирования В. bifidum на средах с различными углеводами: 1 - манноза; 2 - маннозоодержащий гидролизат; 3 - инулин; 4 - контроль; z - продолжительность процесса
Отмечено, что наиболее интенсивное снижение pH (до 6,0, 6,2) наблюдалось при сбраживании маннозы и маннозосодержащих компонентов к 24 ч процесса культивирования. Максимальное снижение pH среды (4,8-5,4) на всех вариантах сред наблюдалось к 48-60 ч культивирования.
Введение в состав питательной среды маннозы и маннозосодержащего гид-ролизата оказывало положительное влияние на морфологию бифидобактерий, что значительно облегчало их визуальную идентификацию при микроскопировании. В опытных мазках у бактерий были значительно более отчетливо выражены такие ключевые признаки бифидобактерий, как утолщение и раздвоенность концов палочек, разветвленность.
Согласно диагностическим критериям содержание бифидобактерий в норме должно составлять 108-1010 КОЕ/г, кишечных палочек с нормальной ферментативной активностью - 107-108 КОЕ/г. Такой симбиоз микроорганизмов достаточно стабилен и не допускает развития в толстом кишечнике условно-патогенной и патогенной микрофлоры.
С целью изучения симбиотических отношений В. bifidum как основного представителя нормобиоценоза кишечника человека и Е. coli - представителя условно-патогенной микрофлоры полужидкую среду Блаурокка инокулировали чистыми культурами бактерий в количестве, соответствующем показателю нормы и вносили различные углеводы в качестве единственного источника углевода, контрольная проба не содержала углевода. Культивирование микроорганизмов проводили при 37° С в течение 48-72 ч. Как показали исследования, на средах с маннозой и маннозосодержащим гидролизатом обе культуры проявляли максимальную способность к росту (табл. 2).
Таблица 2
Подсчет клеток В. bifidum и Е. coli на фиксированных препаратах (кл/г)
Про-долж итель ность процесса , ч Вносимые углеводы
Манноза Маннозосодержащий гидролизат Фруктоза
В. bifidum Е. coli В. bifidum Е. coli В. bifidum Е. coli
12 2-109 6-107 3-Ю9 6-Ю8 7-107 6-106
24 3-Ю9 8-108 2-Ю10 1-Ю9 5-108 1-Ю7
48 8-Ю9 5-109 5-Ю10 8-Ю9 5-109 4-107
Симбиотпческие взаимоотношения снижались на среде с фруктозой, что отражалось в снижении плотности популяций. Полученные результаты позволяют предположить, что маннозосодержащий гидролизат наряду с маннозой способствует повышению резистентности пробпотиков в стрессовых для микробной клетки ситуациях.
Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что культивирование бифидобактерпй В. bifidum на средах, как с маннозой, так п с маннозосодержа-щими компонентами способствует увеличению скорости и интенсивности пх роста, что косвенно свидетельствует о пребиотпческпх свойствах этих углеводов.
Исследование пребиотпческпх свойств маннозосодержащего препарата в опытах in vivo проводили на цыплятах-бройлерах кросса «ROSS 308» в условиях ОАО «ВНИИКП». Цыплята контрольной группы получали в течение всего периода откорма (42 дня) основной рацион. Цыплятам 1- п 2-й опытной группы в возрасте 5 или 23 сут соответственно, через воду вводили антибиотик фторхиноло-новой группы, достигая состояния антпбиотико-ассоцпированного дисбиоза, и определяли соотношение популяцпонного уровня наиболее значимых групп микроорганизмов кишечника в сравнении со значениями, установленными у цыплят контрольной группы.
После достижения состояния устойчивого дисбпоза в основной рацион птицы вводили однократно растворенный в воде лиофилизпрованный препарат в концентрации 0,02 % к массе тела птицы. Исследование микрофлоры кишечника опытных групп проводили с использованием соответствующих стандартных дифференциально-диагностических сред (табл. 3).
Таблица 3
Динамика изменения микрофлоры птицы контрольной и опытных групп
Группы Время отбора проб, сут. Кол-ое выражение микроорганизмов в пробах, lgKOE/r
E.coli Lactobacillus spp. Bifidobacterium spp.
Контрольная 10 7 8 8
23 8 9 8
28 7 9 8
34 7 9 8
1-я опытная 10 10 4 2
23 8 8 7
28 7 9 8
34 7 10 8
2-я опытная 10 7 9 8
23 7 10 9
28 9 3 4
34 7 9 8
При исследовании нормофлоры птицы было установлено, что количество Escherichia coli, Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., как наиболее важных представителей микрофлоры, составило в КОЕ/мл в 1-й опытной группе на 10-е сут: 1010, 102 и 104 соответственно, что свидетельствует об элиминации нормальной микрофлоры и контаминации кишечника птицы условно-патогенной микрофлорой. Во 2-й опытной группе состояние дибиоза развивалось на 28-е сут, т.е. через 5 дней после начала перорального введения антибиотика.
Исследование микробиоценоза кишечника птицы после введения в рацион маннозосодержащего препарата показало, что препарат оказывал положительное влияние на динамику восстановления популяционного уровня основных представителей нормофлоры, что выражалось в увеличении количества лакто- и бифидо-бактерий и сдерживании роста бактерий группы кишечной палочки. Причем, результаты свидетельствуют о том, что восстановление нормобиоза во 2-й опытной группе происходит в более короткое время (5 сут) по сравнению с 1-й опытной группой (10-12 сут), что может быть связано с тем, что бактериальная популяция микрофлоры кишечника птицы стабилизуется к возрасту 2 недель. После окончания применения маннозосодержащего препарата показатели, характеризующие нормальный микробиоценоз, не отличались от контрольных значений, полученных в интактной группе.
Результаты исследования проб после введения в суточный рацион маннозосодержащего препарата показали, что препарат является высокоэффективным средством профилактики и коррекции дисбиотических нарушений, что свидетельствует о том, что препарат проявляет пребиотическую активность.
Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», государственный контракт № П1074.
ЛИТЕРАТУРА
1. Санина, Т.В. Исследование бифидогенной активности фукозы и ее полимеров [Текст] / Т.В. Санина, С.В. Кирьянова, И.В. Черемушкина, О.С. Корнее-ва / / Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2011. - № 1. - С. 141-143.
2. Корнеева, О.С. Пребиотические свойства маннозы и ее влияние на специфическую резистентность [Текст] / О.С. Корнеева, И.В. Черемушкина, А.С. Глу-щенко [и др.]// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.
- 2012. - No 5. - С. 67-70.
3. Martm Hernández Е., Vega Pajares A.I., Perez González В., Ecay Crespo M.J., Leal Perez F., Manzanares Lopez-Manzanares J., Ugarte Perez M., Perez-Cerda Silvestre C. Congenital disorder of glycosylation type Ib. Experience with mannose treatment. An. Pediatr. (Barc.), 2008, № 69(4), pp. 358-365.
4. Черемушкина, И.В. Оптимизация ферментативного гидролиза трудногид-ролизуемых маннанов и исследование пребиотических свойств маннозы [Текст] / И.В. Черемушкина, А.С. Глущенко, Е.П. Анохина [и др.] / / Биотехнология. - 2010.
- № 5. - С. 56-61.
5. Cheiyomushkina, I.V.Extraction of mannan from plant raw materials [Text] / I.V. Cheryomushkina, O.S. Korneeva, S.V. Shakhov / / Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. - 2015. - Yol. 6, № 1. - P. 1634-1639.
REFERENCES
1. Sanina Т.V., Kir'yanova S.V., Cheremushkina I.V., Korneeva O.S. Issledovanie bifidogennoy aktivnosti fukozy i ее polimerov [The study of bifidogenic activity of fucose and its polymers] Vestnik Voronezhskogo gosudarstvennogo universiteta. Seriya: Khi-miya. Biologiya. Farmatsiya, 2011, No 1, pp. 141-143 (Russian).
2. Korneeva O.S., Cheremushkina I.V., Glushchenko A.S., Mikhaylova N.A., Ba-turo A.P., Romanenko E.E., Zlygostev S.A. Prebioticheskie svoystva mannozy i ее vliyanie na spetsificheskuyu rezistentnost' [Prebiotic properties of mannose and its effect on specific resistance] Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii, 2012, No 5, pp. 67-70 (Russian).
3. Martm Hernandez E., Vega Pajares A.I., Perez Gonzalez В., Ecay Crespo M.J., Leal Perez F., Manzanares Lopez-Manzanares J., Ugarte Perez M., Perez-Cerda Silvestre C. Congenital disorder of glycosylation type lb. Experience with mannose treatment. An. Pediatr. (Bare.), 2008, No 69(4), pp. 358-365.
4. Cheremushkina I.V., Glushchenko A.S., Anokhina E.P., Chigirina N.A., Cheren-kov D.A., Slepokurov A.A., Mikhaylova N.A., Korneeva O.S. Optimizatsiya fermenta-tivnogo gidroliza trudnogidrolizuemykh mannanov i issledovanie prebioticheskikh svoystv mannozy [Optimization of enzymatic hydrolysis of mannans and trudnos-goraemyh study prebiotic properties of mannose] Biotekhnologiya, 2010, No 5, pp. 56-61 (Russian).
5. Cheiyomushkina I.V., Korneeva O.S., Shakhov S.V. Extraction of mannan from plant raw materials, Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 2015, Vol. 6, No 1, pp. 1634-1639.
