CC BY
197
УДК 615-277.3.015.3
S.A. Gelperina1, Z.S. Smirnova2, A. S. Halanskiy3, LN. Skidan1, S.E. Sever in1, J. Kreuter4
STUDY OF NANOSOMAL DRUG FORM OF DOXORUBICIN
1Institute of Molecular Medicine, I.M. Sechenov Medical Academy, Moscow ’N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow institute of Human Morfology RAMS, Moscow 4Institute of Pharmaceutical Technology, Germany
ABSTRACT
Doxorubicin binding to polybutylcyanoacrylate nanoparticles coated with polysorbate 80 enabled brain delivery of the drug after intravenous administration to healthy rats; brain concentration of doxorubicin achieved 6 jxg/g. This formulation provided high antitumor effect in rats bearing intracranial glioblastoma: considerable increase of survival time was achieved; ~25% animals showed no clinical or histological evidence of tumor growth. The in-vivo toxicity of doxorubicin bound to polybutylcyanoacrylate nanoparticles coated with polysorbate 80 appeared to be similar to that of the drug substance.
In conclusion, this study showed that effective drug delivery to the brain could be achieved using nanoparticles. This approach offers new opportunities for non-invasive chemotherapy of brain tumors.
Key words: doxorubicin, nanoparticles, polybutylcyanoacrylates, glioblastoma, rats
С.Э. Гелъперина1, З.С. Смирнова2, А. С. Халанский3, И.Н. Скидан1,
С.Е. Северин1, Й. Кройтер4
ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ДОКСОРУБИЦИНА
’Институт молекулярной медицины ММ А им. Сеченова, Москва 2ГУРОНЦ им. И. К Блохина РАМН, Москва ^Институт морфологии человека РАМН, Москва 4Институт фармацевтической технологии, Университет им. Гете,
Франкфурт-на-Майне, Германия
РЕЗЮМЕ
Разработана наносомальная лекарственная форма доксорубицина на основе полибутилдианоакрилатных наночастиц, модифицированных полисорбатом 80. Эта лекарственная форма позволяет достичь значительных концентраций доксорубицина в мозге здоровых крыс при внутривенном введении, а также проявляет высокую противоопухолевую активность на перевиваемой глиобластоме крыс. Увеличение продолжительности жизни подопытных животных по сравнению с контрольными составило 85 %; у 25 % животных, выживших в течение 6 месяцев, не было отмечено клинических и гистологических признаков опухолевого роста. Токсичность нано-сомального доксорубицина не превышает токсичность субстанции.
Таким образом, результаты настоящего исследования подтвердили, что наночастицы являются эффективным средством доставки лекарственных веществ в мозг. Можно полагать, что применение наносомальных препаратов откроет новые возможности для неинвазивной химиотерапии опухолей мозга.
Ключевые слова: доксорубицин, наночастицы, полиалкилцианоакрилаты, глиобластома, крысы
ВВЕДЕНИЕ
Одним из путей повышения эффективности химиотерапии является оптимизация распределения лекарственных веществ (ЛВ) в организме. В ряде случаев эту задачу можно решить с помощью коллоидных систем направленной доставки ЛВ, позволяющих повысить их концентрацию в очаге патологиии снизить токсичность.
При конструировании таких систем в качестве носителей ЛВ используют, как правило, липосомы или полимерные наночасгацы (НЧ). Эти субмикронные носители во многом схожи; их распределение в организме подчиняется закономерностям, общим для коллоидных частиц. Однако если липосомы представляют собой фос-фолипидные везикулы, то НЧ % это твердые частицы диаметром менее 1 мкм. Для получения НЧ используют
полимеры как природного (альбумин, желатин, дексг-ран и др.), так и синтетического (полиметилметакри-лат, полиалкилцианоакрилаты, сополимеры молочной кислотыидр.) происхождения, а также твердые липиды. В НЧ активный ингредиент абсорбирован в матрице или присоединен к полимерной цепи химической связью, он может выделяться из частицы в результате десорбции с поверхности, диффузии из матрицы, а также в результате эрозии и/или биодеградации матрицы. Важным преимуществом наносомальных препаратов является их стабильность. Методы получения и свойства полимерных НЧ подробно описаны [20; 28; 29].
Как показали результаты многочисленных исследований, применение НЧ позволяет существенно изменять фармакокинетику и биораспределение ЛВ [2; 13; 30]. При внутривенном введении НЧ, как и другие коллоидные носители, быстро захватываются системой мононуклеарных фагоцитов и поступают преимущественно в печень, селезенку, легкие, лимфоузлы и в меньшей степени в костный мозг. Таким образом, благодаря своему естественному биораспределению НЧ обеспечивают транспорт (пассивный) связанных сними ЛВ в макрофаги, чем и объясняется высокая эффективность наносомальных препаратов при лечении инфекций, для патогенеза которых характерна локализация возбудителей в резидентных макрофагах или циркулирующих моноцитах [29].
Целесообразность применения коллоидных систем, в том числе и наносомальных, для направленного транспорта ЛВ в опухоль обусловлена рядом особенностей опухолевой ткани (а именно повышенной проницаемостью капилляров, питающих опухоль, и нарушением лимфодренажа), которые способствуют проникновению и накоплению в ней макромолекул и коллоидных частиц. Это явление получило в мировой литературе название «enhanced permeability and retention effect» («EPR effect», «эффект повышенной проницаемости и удерживания») [24; 33].
Очевидно, что преимущественное распределение НЧ в богатые макрофагами органы ретикулоэндоте-лиальной системы снижает эффективность доставки ЛВ в другие органы и ткани. Известно, что фагоцитозу НЧ предшествует сорбция на их поверхности белков и других компонентов плазмы (опсонизация). Уменьшить ее можно путем модификации НЧ поверхностно-активными веществами или амфифильными блоксополимерами, такими как, например, полокса-мины или полоксамеры, которые создают на поверхности частиц защитный слой, препятствующий сорбции белков-опсонинов и захвату частиц макрофагами [9; 26; 27]. Важнейшим следствием модификации поверхности носителей является увеличение времени циркуляции их в кровяном русле; этот феномен получил название «стерическая стабилизация». Она приводит к повышению эффективности пассивного транспорта НЧ, обусловленного эффектом EPR, т. е. в зоны, для которых характерны повышенная проницаемость сосудов и нарушение механизма фильтрации (например, зоны опухолевого роста, зоны воспалительных процессов и т.п.), а также к перераспределению НЧ в органах ретикулоэндотелиальной системы (в частности, позволяет снизить их накопление в печени).
С другой стороны, изменение свойств поверхности НЧ может приводить к перераспределению ЛВ и в нормальных тканях, что позволяет расширить спектр действия ЛВ. Так, НЧ из полибутилцианоакрилата, модифицированные полисорбатом 80 (Твинт 80), обладают способностью доставлять в мозг ЛВ, которые в свободном виде не способны преодолеть гематоэнцефаличес-кий барьер (ГЭБ), в том числе гексапептид даларгин, киоторфин, лоперамид, тубокурарин и др. [5-7; 21].
Являясь препятствием для многих лекарств, ГЭБ ограничивает возможности химиотерапии при лечении заболеваний ЦНС, в том числе опухолей мозга. Известно, что рост интракраниальных опухолей приводит к нарушению ГЭБ, однако область повышенной проницаемости охватывает в основном центральную часть опухоли, особенно области некроза; в то же время в растущей зоне опухоли, граничащей с нормальной тканью, ГЭБ сохраняет барьерные функции, препятствуя проникновению ЛВ [12]. Например, антрациклиновый антибиотик доксорубицин при внутривенном введении не проникает в здоровый мозг. Исследование распределения доксорубицина у больных с глиомами показало, что его концентрация в опухоли также очень низкая и не достигает терапевтического уровня, что, по-видимому, объясняет низкую эффективность этого препарата при лечении глиом [18].
В то же время ряд фактов свидетельствует о том, что доксорубицин обладает определенным потенциалом для лечения глиобластом. Во-первых, цитоток-сическая активность доксорубицина в отношении клеток глиомы превышает активность BCNU, одного из наиболее широко используемых препаратов для химиотерапии глиобластом [19; 34]. Во-вторых, внут-риопухолевое введение доксорубицина приводит к увеличению продолжительности жизни больных с гли-областомами [40]. Таким образом, эффективность доксорубицина при лечении опухолей мозга определяется возможностью его доставки в опухоль.
Данные о возможности преодоления ГЭБ с помощью полибутилцианоакрилатных НЧ, модифицированных полисорбатом 80, наряду с известной способностью клеток глиомы к фагоцитозу [44] позволили предположить, что использование модифицированных НЧ позволит осуществить транспорт доксорубицина в мозги, таким образом, использовать этот препарат для системной химиотерапии опухолей мозга.
Целью настоящего исследования являлась разработка наносомальной лекарственной формы доксорубицина на основе полибутилцианоакрилатных НЧ, модифицированных полисорбатом 80, изучение ее фармакокинетики и острой токсичности, а также противоопухолевой активности на перевиваемой глиоблас-томекрыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали бугилцианоакрилат («Sichel-Werke», Hannover, Germany); доксорубицин гидрохлорид (субстанция) был любезно предоставлен фирмой Sicor (Milan, Italy). Остальные реагенты и растворители приобретены в компании «Sigma» (St. Louis, U.S. А.).
Исследование проводили на беспородных крысах-самцах, а также на крысах-самцах Wistar в соответ-
ствии с Правилами лабораторной практики в РФ, утвержденными Министерством здравоохранения (приказ N 267 от 19.06.2003).
Получение наносомальной лекарственной формы доксорубицина
НЧ получали путём эмульсионной полимеризации бутилцианоакрилата в присутствии доксорубицина [16]. Содержание доксорубицина в лиофилизо-ванном препарате составляло 5 % мае., степень включения доксорубицина -75%. Средний диаметр частиц, определенный методом лазерного светорассеяния, составлял 170 нм.
Модификацию поверхности НЧ полисорбатом 80 проводили непосредственно перед опытом. Лиофили-зованные НЧ ресуспендировали в воде, затем к водной суспензии при перемешивании прибавляли поли-сорбат ВО до концентрации 1 %. Смесь выдерживали в термостате при 37 °С не менее 30 мин и использовали в течение 2 ч.
Пустые наночастицы (плацебо) получали по аналогичной методике.
Исследование фармакокинетики наносомальной формы доксорубицина, модифицированной полисорбатом 80 (Докс-НЧ+Пс)
В качестве контроля использовали субстанцию доксорубицина в водном растворе (Доке) или в 1%-ном растворе полисорбата 80 (Докс+Пс), а также немоди-фицированную наносомальную форму доксорубицина (Докс-НЧ). Животных разделили на четыре группы (п = 6). Препараты доксорубицина вводили однократно в хвостовую вену крыс в дозе 5 мг/кг. Через 0,25,1,2,4, 6 и 8 ч животных умерщвляли путем декапитации. Органы отделяли, промывали фосфатно-солевым буфером (pH 7,2), взвешивали, прибавляли додецилсульфат натрия и гомогенизировали. Доксорубицин экстрагировали смесью хлороформ - метанол (4:1). Концентрацию доксорубицина определяли методом ВЭЖХ. В ра-боте использовали колонку Берагоп 8йХ С18 (СЬетаро1); подвижная фаза ацетонитрил- фосфатный буфер (рНЗ) - метанол (25:45 :30).
Для характеристики фармакокинетики препаратов в крови и органах крыс рассчитывали следующие параметры: интегральный показатель площади под фармакокинетической кривой (АиС), среднее время удерживания препарата (М11Т), период полувыведения кон-
станта элиминации (Ке1), общий клиренс (С1). Расчеты проводили по программе РАЯМ.
Оценка острой токсичности
Препараты вводили однократно внутривенно. Пустые НЧ (плацебо) растворяли в дистиллированной воде и вводили в постоянной концентрации 26 мг/ мл в дозах 100; 160; 220; 280; 340; 400 мг/кг. Начиная с дозы 280 мг/кг, пустые НЧ вводили дробно (делили дозу пополам) с интервалом не более 1 ч.
Острую токсичность црепаратов Доке изучали при введении доз в интервале 4,5-15,0 мг/кг (в расчете на Доке). Препараты растворяли в дистиллированной воде или в 1% полисорбате 80 и вводили в постоянной концентрации 2,5 мг/мл.
Наблюдение за животными осуществляли в течение 30 дней. Токсичность оценивали по числу павших животных, срокам и «пикам» их гибели, а также на основании клинической картины интоксикации, включая поведенческие реакции и двигательную активность. При проведении патологоанатомического (макроскопического) исследования павших и умерщвленных в конце опыта животных оценивали состояние внутренних органов (головной мозг, сердце, легкие, печень, селезенка, почки, семенники).
Экспериментальная модель опухоли мозга
Интрацеребральная опухоль -глиома 101/8 полу-ченав 1967гврезультатеимплантациипилюлидиме-тилбензантрацена в мозжечок крысы-самки Wistar [6]. Опухоль имеет устойчивое однородное строение моно-морфной глиобластомы. Гибель животных наступает обычно на 14 - 16 сутки в результате роста опухоли или кровоизлияния. Опухоль поддерживается методом интрацеребрального пассирования и хранится в крио-консервированном состоянии.
Перевивка глиобластомы и оценка противоопухолевой активности
Для имплантации опухоли в правой теменной области черепа крысы делали трепанационное отверстие ди-аметром 2 мм на расстоянии 2 мм от сагиттального шва и 2 мм каудально от венечного шва в правой теменной кости. С помощью троакара криоконсервированную опухолевую ткань вводили в мозг на глубину 4 мм в дно правого бокового желудочка. При проявлениях клинических признаков опухолевого процесса (через 12-14 дней) крысу усыпляли эфиром и немедленно извлекали мозг. Выделенную из мозга опухоль измельчали скальпелем и вводили в мозг экспериментальных животных, как описано выше.
Лечение начинали через 48 ч после трансплантации опухоли. Препараты (Доке, Докс+Пс, Докс-НЧ, Докс-НЧ+Пс) вводили в дозе 1,5 мг/кг трехкратно с интервалом 72 ч. Противоопухолевый эффект оценивали по увеличению продолжительности жизни крыс (УПЖ, %) в опытных группах по сравнению с контролем и количеству животных, выживших в течение 6 месяцев, а также по данным гистологического исследования на 1 2-й день после имплантации опухоли.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием ^критерия Стьюденга.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование фармакокинетики наносомальных лекарственных форм доксорубицина
Ассоциация ДокссНЧ из полибутилцианоакрила-та приводит к существенному изменению его фармакокинетики [17]. Как видно из результатов, приведенных в табл. 1, наносомальный Доке дольше задерживается в организме крыс: константы периода полувыведения (Т1йр) и среднего времени удерживания (МЕТ) препарата увеличиваются приблизительно в 3,5 и 4 раза соответственно по сравнению с субстанцией, что свидетельствует о значительном накоплении ЛВ в тканях на фоне практически не меняющейся интегральной площади под фармакокинетической кривой (АиС). Показа-
теш общего клиренса (<Х) и консташы элиминации (Кй) для Д окс-НЧ снижены в среднем на 21 %. Этирезульта-ты в целом коррелируют с данными других авторов, изучавших фармакокинетику наносомальных лекарственных форм Доке [30; 43].
Введение Доке в 1 %-ном растворе полисорбата (Докс+Пс) не оказало значимого влияния на фармакокинетику, однако модификация НЧ полисорбатом привела к значительным изменениям фармакокинетических параметров по сравнению с немодифицированным на-носомальным препаратом. Скорость клиренса Докс-НЧ+Пс уменьшилась приблизительно на 30 % по сравнению с ДокоНЧ; при этом интегральный показатель -площадь под фармакокинетической кривой АИС возрос примерно в 1,5 раза, а показатели Тшри МЯТ снизились на ~30 % (см. табл. 1). Кроме того, несколько уменьшилось накопление препарата в органах РЭС -печени, селезенке, легких, а также в почках [17].
При введении субстанции в дозе 5 мг/кг максимальная концентрация антибиотика в сердце достигалась через 2 ч и составляла 6,57+0,55 мкг/г (рис. 1). При введении наносомальной лекарственной формы Доке определялся в сердечной мышце только в течение пфвого часа, при этом уровень его концентрации составил всего 0,3±0,05 мкг/г, т.е. пиковая концентрация антибиотика в сердечной мышце снижалась приблизительно в 22 раза. Модификация поверхности НЧ полисорбатом привета к некоторому повышению концентрации Доке в сердечной мышце, однако абсолютный уровень оставался низким (0,42±0,07 мкг/г через 15 мин после введения) и уже через 1 ч после введения концентрация Доке была ниже предела чувствительности измерений (< 0,1 мкг/г).
Наиболее интересные данные, полученные при изучении фармакокинетики наносомальной лекарственной формы Доке, относятся к способности модифицированных НЧ доставлять антибиотик через ГЭБ, Как упоминалось выше, Докснепроникаетвголовноймозг, однако при ассоциац ии с НЧ, модифицированными полисорбатом 80, его значимые концентрации (>1 мкг/г) определялись в течение 8 ч после введения. При этом максимальная концентрациядостигала весьма значительного уровня - 6 мкг/г - через 2 ч после введения и поддерживалась на этом уровне в течение последующих 2 ч (рис. 2). Основные константы фармакокинетики Докс-НЧ+Пс в ткани головного мозга таковы: Тщ„ = 1,56+0,77 ч, МИТ = 3,98±2,15 ч, АИС = 35,0+3,1 мкг/г х ч.
При введении остальных модификаций лекар-
Врема, час
Рис. 1. Уровень концентрации лекарственных форм доксорубицина в сердце крыс (п = 6):
-♦ Доке;
—П— Докс+Пс;
—Л— Докс-НЧ;
—©— Докс-НЧ+Пс
ственной формы (Доке, Докс+Пс, Докс-НЧ) уровень Доке в ткани мозга оставался ниже предела чувствительности измерений (<0,1 мкг/г) в течение всего периода наблюдения.
Таким образом, модифицированные полисорбатом НЧ могут обеспечить транспорт Доке в мозг. Этот результат позволил предположить, что такая лекарственная форма Доке может оказаться эффективной при лечении опухолей мозга. Для выбора оптимального режима лечения были необходимы данные о токсичности наносомального Доке.
Исследование острой токсичности наносомальных лекарственных форм доксорубицина
В проведенном нами исследовании [16] внутривенное введение плацебо (пустых НЧ) в дозах от 100 до 400 мг/кг (20 - 80 мг/кг полибутилцианоакрилата) не приводило к гибели экспериментальных животных в течение периода наблюдения и не оказывало влияния на прирост массы тела животных по сравнению с контролем. При вскрытии животных, умерщвленных в конце опыта, макроскопических изменений внутренних органов не было выявлено. Средняя масса органов леченых животных статистически не отличалась от массы животных в контроле.
Таблица 1
Параметры фармакокинетики лекарственных форм доксорубицина (п = 6)
Параметры Доке Докс+Пс Докс-НЧ Докс-НЧ+Пс
Время полувыведения, (Т 112а), Ч 0,27±0,01 0,279±0,02 0,22б±0,022 0,398±0,040
Время полувыведения (Тшв), ч 2,49±0,75 2,95+0,60 10,3+1,50 8,74+2,67
Среднее время удерживания (МК.Т), ч 1,6±0,38 1,93±0,44 9,32±2,00 6,41±1,84
Константа элиминации (Кэл), 1/ч 1,68±0,07 1,7640,11 1,21±0,092 1ЛШД5
Объем распределения (VI), л 1,39±0,05 1,30±0,06 1,б5±0,11 1,21±0,13
Общий клиренс (СЬ), мл/мин 38,9±1,50 38,2±0,8 33,3±2,0 22,3±1,б
Площадь под кривой (АИС), Схч 2,14 2,18 2,50 3,73
Время, ч
Рис. 2. Уровень концентрации доксорубицина, ассоциированного с наночастицами, модифицированными по-лисорбатом 80, в головном мозге здоровых крыс (п = 6)
Следует отметить, что в течение 15 мин после введения пустых НЧ в дозе 400 мг/кг (80 мг/кг полибу-тилцианоакрилата) изменялись поведенческие и вегетативные реакции крыс. В этот период отмечали повышение двигательной активности и изменения частоты дыхания и частоты сердечных сокращений. Эти явления носили обратимый кратковременный характер и проявлялись при введении НЧ в дозах, которые значительно (на порядок) превышали терапевтический уровень. В последствии никаких отклонений в состоянии этих крыс не наблюдалось. Причина развития вегетативных реакций не известна, однако, скорее всего, они вызваны временными нарушениями гемодинамики при введении высоких доз коллоидных частиц. Аналогичные нарушения возникают также при введении липо-сом и эмульсий [34; 36].
Токсичность лекарственных форм Доке зависела от дозы. Пики гибели при введении летальныхдоз были зафиксированы на 2-9-е сутки наблюдения (табл.2). Введение препаратов в дозах, вызывающих полную
или частичную гибель животных, сопровождалось значительной потерей массы тела. Накануне гибели крыс наблюдали общее угнетение, повышенный тонус нижних конечностей, сужение глазных щелей, просветление роговицы; масса тела перед гибелью снижалась до состояния кахексии (на 25 - 45 %). На 3-и сутки после введения начиналась диарея. У животных, получавших наносомальные препараты, она была менее выраженной.
Динамика изменения массы тела крыс после введения Доке и Докс-НЧ+Пс, представлена на рис. 3. Видно, что Доке в дозе 4,5 мг/кг незначительно влиял на изменение массы тела животных. После введения Доке в дозе 7,2 мг/кг снижался прирост массы тела на 16-25 % по отношению к контролю. Доза 9 мг/кг, вызывавшая частичную гибель крыс, также приводила к остановке прироста массы тела. Влияние Докс-НЧ+Пс на динамику прироста массы тела было менее выраженным по сравнению с субстанцией антибиотика. В группе животных, получивших Докс-НЧ+Пс в дозе 4,5 мг/кг, прирост массы тела не отличался от контрольной группы.
При вскрытии павших животных наблюдали умеренную дистрофию селезенки; отчетливо прослеживалось полнокровие сосудов печени и изменение ее цвета. После введения субстанции Доке в водном растворе или в растворе полисорбата у животных был обнаружен серозный выпот в брюшной полости; после введения наносомальных препаратов выпот обнаруживался в плевральной полости. Важно отметить: у животных, получивших субстанцию Доке, наблюдали характерную картину повреждения слизистой ЖКТ с очагами некрозов и кровоизлияний, а после введения наносомальных препаратов таких повреждений не обнаружено, что согласуется с клиническими проявлениями интоксикации.
При сравнении массы органов животных, павших от сублетальных доз, было выявлено увеличение относительной массы легких, печени и почек. Во всех случаях была выявлена прямая зависимость уменьшение массы семенников от величины введенной дозы. Однако если после введения субстанции доксорубицина средняя относительная масса семенников снижалась в 1,5 - 2,1 раза, то при введении наносомальных
Таблица 2
Выживаемость животных после однократного внутривенного введения субстанции доксорубицина и его наносомальных лекарственных форм (п = 6)
Доке Докс-НЧ Докс-НЧ+Пс
Доза, мг/кг Дни гибели животных Выжившие животные, % Доза, мг/кг Дни • гибели животных Выжившие животные, % Доза, мг/кг Дни гибели животных Выжившие животные, %
4,5 - 0/9 (0) 4,5 - 0/9 (0) 4,5 - 0/9 (0)
6,4 - 0/9 (0) 6,0 2 2/15(13) 6,0 - 0/15(0)
7,0 5-6,9 3/15 (20) 7,2 2-3 2/9 (22) 7,2 2 2/15 (13)
9,1 2,6-8,12 10/15 (33) 8,0 4,7-9 4/9 (44) 8,0 7-8 3/9 (33)
10,5 4-6, 8,16 8/9 (89) 9,6 4,7-9 12/15 (80) 9,6 4,7,9 10/15 (67)
12,0 5-6,7-8 9/9 (100) 12,0 2-3 8/9 (89) 12,0 9,10-11,13 15/15 (100)
15,0 3,4,6 15/15 (100) 15,0 2 15/15 (100) 15,0 2 15/15 (100)
Время, дни
Время, дни
Рис. 3. Изменение массы тела крыс после однократного внутривенного введения различных доз субстанции доксорубицина (А) и доксорубицина, ассоциированного с наночасгицами, модифицированными полисорба-том (Б):
у - контроль;
* - 4,5 мг/кг;
• - 7,2 мг/кг;
♦ - 9,0 мг/кг
препаратов снижение массы было менее выраженным в 1,2-1,3 раза.
Таким образом, наиболее уязвимыми органами, масса которых не восстанавливалась после воздействия сублетальных доз за период наблюдения, оказались почки и семенники, что согласуется с данными
других авторов, отмечающих длительные проявления почечной токсичности и угнетения репродуктивной системы крыс после введения доксорубицина [1; 25].
Для расчета токсических доз использовали метод пробит-анализа в модификации Литчфилда-Вилкоксо-на (табл. 3). На основании полученных данных можно полагать, что для наносомальной лекарственной фор-мыдоксорубицина, модифицированной полисорбатом, максимально переносимойдозойявляетсядоза7,12мг/ кг, а для доксорубицина % 6,7 мг/кг.
Таким образом, остраятоксичносгь наносомальной лекарственной формы доксорубицина не превышает токсичность субстанции. В то же время результаты нашего исследования показывают, что применение НЧ привод ит к снижению гастроинтестинальной токсичности Доке. Кроме того, весьма вероятно, что значительное снижение пиковой концентрации наносомального Доке в сердечной мышце позволит снизить кардиотоксичность этого антибиотика, которая является серьезным побочным эффектом и лимитирует его применение в клинике. Считают, что выраженность этого эффекта находится в прямой зависимости от пиковых концентраций антибиотика в сердечной мышце [41]. Это предположение подтверждают результаты Кувре и соавт., изучавших токсичность аналогичной лекарственной формы Доке на основе НЧ из полиизобутилцианоакри-лата при курсовом введении различных доз мышам [11]. Эти авторы отмечали снижение кардиотоксичности, а также значительное снижение смертности и потери массы тела животных при введении наносомального Доке по сравнению с его стандартной лекарственной формой. Количественные параметры токсичности в этой работе не приводятся, однако полученные результаты позволили авторам заключить, что использование НЧ приводит к снижению токсичности Дохе.
Изучение противоопухолевой активности наносомальной лекарственной формы доксорубицина на крысах с интракраниальной глиобластомой 101/8 [35]
Глиобластома 101/8 неоднократно использовалась как экспериментальная модель для изучения вопросов биологии и патологии глии и глиальных опухолей [3]. Высокая степень прививаемости (90-100%), быстрый инфильтративный рост и незначительная не-кротизация позволяют считать глиобластому 101/8 адекватной моделью для оценки противоопухолевой активности новых лекарственных веществ и подходов к лечению опухолей мозга.
Расчетные токсические дозы лекарственных форм доксорубицина
Таблица 3
Токсические дозы Субстанция доксорубицина (Доке) Доксорубицин, ассоциированный с НЧ (Докс-НЧ) Доксорубицин, ассоциированный с НЧ, модифицированными полисорбатом (Докс-НЧ+Пс)
1Х>1о(МПД) 6,70 (5,26-7,43) 5,77(3,86-6,73) 7,12 (5,93-7,76)
1Х>16 7,11 (5,90-7,77) 6,36 (4,80-7,22) 7,50 (6,52-8,09)
1ЛЭ50 8.51 f7.86-9.22) 8.41 С7.61-9.34) 8.82(8,25-9,56)
и>84 9,92 (9,21-11,26) 10,47(9,50-12,38) 10,14(9,44-11,56)
11/099,9 12,75 (11,37-15,96) 14,62(12,62-19,21) 12,8 (11,44-16,0)
Наиболее высокий противоопухолевый эффект был достигнут в группе животных, леченных препаратом Докс-НЧ+Пс. Эффект был подтвержден в трех независимых экспериментах (п = 18ё23); обобщенные результаты представлены на рис. 4. Введение Докс-НЧ+Пс привело к статистически значимому увеличению продолжительности жизни по сравнению как с напеченным контролем (УПЖ=85 %), так и с группой, получавшей эквивалентные дозы субстанции Доке (УПЖ = 24 %). Количество излеченных животных в этой группе превысило 20 % (5/23).
Противоопухолевый эффект наблюдали и в других группах. ДОКС-НЧ увеличивал продолжительность жизни подопытных животных на 38 % по сравнению с контролем. В группе животных, леченных ДОКС+Пс, УПЖ составило 65 %, а количество излеченных животных - 9 % (2/23). ДОКС при том же режиме введения оказывал умеренный противоопухолевый эффект, вызывая увеличение продолжительности жизни подопытных животных на 54 %; сроки жизни в этой группе не превышали 65 дней. Введение эквивалентных доз пустых НЧ не оказывало противоопухолевого действия.
Как показали результаты гистологического исследования, у животных, получавших препараты, на 12-й день после имплантации размеры опухоли были меньше по сравнению с контролем; кроме того, инфильтра-тивный характер этих опухолей был менее выражен, а опухолевые клетки проявляли более низкую пролиферативную активность. Признаки нейротоксичносги (дегенерация нейронов, апоптоз в отдаленных от опухоли участках, повышение экспрессии эзрина и т.д.) отсутствовали. Гистологическое исследование выживших животных через 6 мес после имплантации не выявило следов опухолевого роста.
Дни после имплантации опухоли
Рис. 4. Выживаемость крыс с интракраниальной гли-областомон 101/8 после трехкратного введения препаратов доксорубицина в дозе 3 х 1,5 мг/кг на 2-й, 5-й и 8-й день после имплантации опухоли:
—О—Контроль
----Доке
Докс-Нч -В—Докс-Нч+Пс
Возможные механизмы транспорта лекарственных веществ в мозг с помощью наночастиц
Механизм, с помощью которого НЧ осуществляют транспорт ЛВ в мозг, остается до настоящего времени не вполне ясным.
Некоторые авторы полагают, что транспорт через ГЭБ может быть обусловлен длительной циркуляцией стерически стабилизированных НЧ. Действительно, было показано, что концентрация Доке, ассоциированного с НЧ из твердых липидов, модифицированных производным полиэтиленгликоля, в мозге крыс находится в прямой зависимости от концентрации модифицирующего агента и от интегрального фармакокинетического показателя AUC, характеризующего время циркуляции препарата в крови [43]. Та же тенденция наблюдалась для пустых НЧ из по-лиметилметакрилата [9].
Однако эта закономерность наблюдается не всегда. Полигексадецилцианоакрилатные НЧ, модифицированные полоксамином 908, циркулируют в крови дольше, чем те же НЧ, модифицированные поли-этиленгликолем. В то же время только модификация полиэтиленгликолем позволяет этим частицам проникать в мозг [10]. Авторы полагают, что возможность проникновения в мозг определяется не только временем циркуляции НЧ, но и возможностью их контакта с клетками, которая зависит от структуры модифицирующего агента.
Согласно другой гипотезе НЧ из полибутилциа-ноакрилата, модифицированные полисорбатом, ин-тернализуются эндотелиальными клетками капилляров мозга в результате рецептор-опосредованного эн-доцитоза. Данные о том, что при попадании модифицированных полисорбатом НЧ в кровь на их поверхности избирательно сорбируются аполипопротеины Е и В, а также результаты экспериментов in vivo и in vitro позволили предположить, что транспорт НЧ через ГЭБ осуществляется с участием рецепторов апо-липопротеинов, которые экспрессированы в мембранах эндотелиальных клеток капилляров мозга [10; 22]. Внутри клетки НЧ подвергается биодеградации под действием ферментов и выделяют ЛВ, которое затем диффундирует через апикальную мембрану в межклеточное пространство.
Возможно также, что НЧ из полибутилцианоакри-лата, модифицированные полисорбатом, ингибируют Р-гликопротеин-мембранный белок, экспрессированный в мембранах эндотелиальных клетках капилляров мозга, формирующих ГЭБ. Образуя комплексы снекоторы-ми ЛВ, Р-гликопротеин препятствует их проникновению и накоплению в ткани головного мозга [38]. Р-гликопротеин является также одним из белков, ответственных за развитие множественной лекарственной устойчивости. В поддержку этой гипотезы можно привести следующие факты. Во-первых, все ЛВ, доставленные в мозг с помощью полибутилцианоакрипатных НЧ, модифицированных полисорбатом (даларгин, тубокурарин, лоперамид, Доке), являются субстратами Р-гликопротеина, что и объясняет невозможность их независимого транспорта через ГЭБ. Во-вторых, наносомальный Доке способен преодолевать лекарственную устойчивость опухолевых клеток, обусловленную экспрессией Р-гликопротеина в
клеточных мембранах; при этом для преодоления устойчивости необходим контакт НЧ с клетками [39].
Можно предположить, что контакт НЧ с клеточной мембраной вызывает изменение ее свойств, в частности, текучести, что, в свою очередь, приводит к изменению конформации встроенного в мембрану Р-гликопротеина и ингибированию его функций. При этом JIB, выделяющееся из частицы в результате ее эрозии, получает доступ в клетку. Модификация НЧ полисорбатом 80 усиливает этот эффект, поскольку полисорбат, являясь поверхностно-активным веществом, также влияет на свойства клеточной мембраны и способствует контакту частиц с клетками. Последнее предположение подтверждается данными о том, что присутствие полисорбата 80 позволяет повысить цитотоксический эффект ЛВ в культурах резистентных клеток [14; 42].
Модифицированные НЧ могут попадать в мозг и в результате трансцитоза между плотными контактами эндотелиальных клеток, образующих ГЭБ; однако в настоящее времянетэкспериментальныхданных>подгвф-ждаюхцих существование такого механизма.
Таким образом, возможность осуществления транспорта ЛВ в мозг с помощью полимерных НЧ подтверждается результатами многих авторов. Способность проникать в мозг или доставлять туда JIB зависит от свойств поверхности НЧ; можно полагать, что и механизм транспорта также зависит от природы НЧ и модифицирующего агента.
Более того, вполне вероятно, что транспорт JIB в мозг является суммарным результатом действия нескольких механизмов; например, НЧ могут интерна-лизоваться эндотелиальными клетками и в то же время воздействовать на их мембрану, облегчая доступ выделяющегося ЛВ в мозг.
Следует отметить, что предложенные гипотезы основываются на данных, полученных in vitro или в экспериментах на здоровых животных, т,е в отсутствие каких-либо нарушений ГЭБ. Иная ситуация возникает в том случае, когда рост опухоли приво-дитк повышению проницаемости ГЭБ. Действительно, как показали результаты нашего эксперимента, не только Докс-НЧ+Пс, но и Докс-НЧ, а также Докс+Пс проявили значительный противоопухолевый эффект при лечении глиобластомы 101/8. Эффект этих препаратов, вероятно, связан с возможностью их прохождения через ГЭБ в результате повышения его проницаемости в процессе роста опухоли, то есть при введении препаратов на 5-ый и 8-ой день после имплантации. С другой стороны, более высокий эффект Докс-НЧ+Пс возможно объясняется тем, что модифицированные полисорбатом НЧ могут доставлять Доке в активно растущую зону опухоли, граничащую с нормальной тканью, где 1ЭБ еще сохраняет свои функции.
Способность НЧ доставлять ЛВ через ГЭБ приобретает особую значимость в случае опухолей мозга, характеризующихся инфильтративнымросгом, поскольку радикальное удаление таких опухолей невозможно, а результативность локальной химиотерапии ограничена ввиду незначительной диффузии ЛВ из места введения в окружающую ткань мозга [31; 40].
выводы
Разработана наносомальная лекарственная форма доксорубицина на основе полибутапцианоакрилат-ных наночастиц, модифицированных полисорбатом 80. Она позволяет достичь значительных концентраций доксорубицина в мозге здоровых крыс при внутривенном введении, а также проявляет высокую эффективность при лечении глиобластомы у крыс. Токсичность наносомального доксорубицина не превышает токсичности субстанции.
Таким образом, результаты исследования подтвердили, что наночастицы являются эффективным средством доставки лекарственных веществ в мозг. Можно полагать, что применение наносомальных препаратов откроет новые возможности для неинвазивной химиотерапии опухолей мозга.
ЛИТЕРАТУРА
1. Боровская Т.Г., Гольдберг Е.Д. Влияние антибиотиков антрациклинового ряда на функциональное состояние репродуктивной системы крыс // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2000. - Т.130, № 11. - С. 527-530.
2. Скидан И.Н., Бобрускин А.И., Гуляев А.Е. и др. Оптимизация фармакокинетики фотосенса с помощью био-деградируемых наночастиц II Антибиотики и химиотерапия. - 2001. - № 4. - С. 6-10.
3. Смирнова З.С., Герасимова Г.К., Родионова Ю.В. и др. Экспериментальные опухоли мозга в системе доклинического изучения новых противоопухолевых препаратов // Материалы 5 Всероссийского съезда онкологов. - Казань, 4-7 октября 2000. - С. 214-217.
4. Яблоновская Л.Я., Спрышкова Н.А. Морфологическая и биологическая характеристика экспериментальных опухолей мозжечка крыс // Арх. Патол. - 1971. - Т. 33, №2.-С. 50-53.
5. Alyautdin R., Gothier D., Petrov V. et al. Analgesic activity of the hexapeptide dalargin adsorbed on the surface of polysorbate 80-coated poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles // Eur. J. Pharm. Biopharm. - 1995. - Vol.
41, No 1.-P. 44-48.
6. Alyautdin R.N., Petrov V.E., Langer K. et al. Delivery of loperamide across the blood-brain barrier with polysorbate 80-coated polybutylcyanoacrylate nanoparticles // Pharm. Res. -1997. - Vol. 14, No 3. - P. 325-328.
7. AlyautdinR.N., TezikovE.B., RamgeP. etal. Significant entry of tubocurarine into the brain of rats by adsorption to polysorbate 80-coated polybutylcyanoacrylate nanoparticles // J. Microeneapsul. -1998. - Vol. 15, No 1. -P. 67-74.
8. AlyautdinR.N., ReichelA., LoebenbergR. etal. Interaction of poly(butylcyanoacrylate) nanoparticles with the blood-brain barrier in vivo and in vitro // J. Drug Targeting. - 2001. - Vol. 9, No 3. - P. 209-221.
9. Araujo L., Loebenberg R., Kreuter J. Influence of the surfactant concentration on the body distribution of nanoparticles // J. Drug Targeting. - 1999. - Vol. 6, No 5. -P. 373-385.
10. Calvo P., Gouritin B., Chacun H. et al. Long-circulating PEGylated polycyanoacrylate nanoparticles as new drug carrier for brain delivery // Pharm. Res. - 2001. - Vol. 18, No 8.-P. 1157-1166.
11. Couvreur P., Kante B., Grislain L., et al. Toxicity of polyalkylcyanoacrylate nanoparticles II: doxorubicin-loaded nanoparticles // J. Pharm. Sci. -1982. - Vol. 71, No 7.-P. 790-792.
12. Donelli, M.G., M. Zucchetti, and M. D'JncalciDo anticancer agents reach the tumor target in the human brain? //
Cancer Chemother Pharmacol. - 1992. - Vol. 30, No 4. -P. 251-260.
13. Fawaz F, Bonini F, Maugein J, et al. Ciprofloxacin-loaded
polyisobutylcyanoacrylate nanoparticles:
pharmacokinetics and in vitro antimicrobial activity // Int J Pharm. -1998. - Vol. 168, No 3. - P. 255-259.
14. Friche E., Jensen P.B, Sehested M., et al. The solvents cremophor EL and Tween 80 modulate daunorubicin resistance in the multidrug resistant Ehrlich ascites tumor // Cancer Commun. - 1990. - Vol. 2, No 9. - P. 297-303.
15. Fundaro A,, Cavalli R., Bargoni A., et al. Non-stealth and stealth solid lipid nanoparticles carrying doxorubicin: pharmacokinetics and tissue distribution after i.v. administration to rats // Pharm. Res. - 2000. -Vol. 42, No 4.-P. 337-343.
16. Gelperina, S.E., Smirnova, Z.S., Khalanslcy, et al. Chemotherapy of brain tumours using doxorubicin bound to polysorbate 80-coated nanoparticles // Proc. 3rd World Meeting APV/APGI, Berlin, 3/6 April 2000. - P. 441-443.
17. Gulyaev A.E., Gelperina S.E., SkidanI.N., etal. Significant transport of doxorubicin into the brain with polysorbate 80-coated nanoparticles // Pharm. Res. - 1999. - Vol. 16, No 10. -P. 1564-1569.
18. Holst von H., Knochenhauer E., Blomgren H. et al. Uptake of adriamycin in tumour and surrounding brain tissue in patients with malignant gliomas // Acta Neurochir (Wien). -1990. - Vol. 104, N1-2. -P. 13-16.
19. Kaajik P., Troost D., de Boer O.J., et al. Daunorubicin and doxorubicin but not BCNU have deleterious effects on organotypic multicellular spheroids of gliomas // Br J Cancer. -1996. - Vol. 74, No 2. -P. 187-193.
20. Kreuter J. Nanoparticles, in Colloidal Drug Delivery Systems, Ed. Kreuter J., Marcel Dekker, NY, 1994.
21. Kreuter J, Alyautdin R.N., Kharkevich D.A., Ivanov A.A. Passage of peptides through the blood-brain barrier with colloidal polymer particles (nanoparticles) II Brain Res. - 1995. - Vol. 674, No 1. - P. 171-174.
22. Kreuter J., Shamenkov D., Petrov V. et al. Apolipoprotein-mediated Transport of Nanoparticle-bound Drugs Across the Blood-Brain Barrier // J Drug Targeting. - 2002. -Vol. 10, No 4.-P. 317-325.
23. Llesuy, S.F., S.L. Arnaiz. Hepatotoxicity of mitoxantrone and doxorubicin//Toxicology. - 1990. - Vol. 63, No 2. -P. 187-198.
24.Matsumura Y., Maeda H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent SMANCS // Cancer Res. - 1986. -Vol. 46, No 12 Pt 1. - P. 6387-6392.
25. Mazue G., Iatropulos M., Imondi A., et al. Anthracyclines: a review of general and special toxicity studies II Int. J. Oncol. - 1995. - Vol. 7, No 6. - P. 713-726.
26. Moghimi S. M, Hunter A. C., Murray J.C. Long-Circulating and Target-Specific Nanoparticles: Theory to Practice II Pharmacol. Rev. - 2001. - Vol. 53, No 2. - P. 283-318.
27. Muller R.H. (ed.) Colloidal carriers for controlled drug delivery and targeting I! CRC Press, Boca Raton, Stuttgart, 1991.
28. Muller R.H., Jacobs C., Kayser O. Nanosuspensions as particulate drug formulations in therapy/ rationale for
development and what we can expect in future // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2001. - Vol. 47, No 1. - P. 3-19.
29. Pinto-Alphandary H., AndremontA., Couvreur P. Targeted delivery of antibiotics using liposomes and nanoparticles: research and applications // Int J Antimicrob Agents.-2000.-Vol. 13,No3.-P. 155-168.
30.RollandA. Clinical pharmacokinetics in hepatoma patients after a single intravenous injection of free or nanoparticle-bound anthracyclines//Int. J. Pharm. -1989. -Vol. 54, No3.-P, 113-121.
31. Roullin, V.G., Deverre J.R., Lemaire L., et al. Anti-cancer drug diffusion within living rat brain tissue: an experimental study using [(3)H](6)-5-fluorouracil-loaded PLGA microspheres // Eur J Pharm Biopharm. - 2002. -Vol. 53, No 3,-P. 293-299.
32. Saunders N.R., HabgoodM.D., DziegielewskaKM. Barrier mechanisms in the brain, I, Adult brain // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. - 1999. - Vol. 26, No 1. - P. 11-19.
33. Seymour LW. Passive tumour targeting of soluble macromolecules and drug conjugates. // CRC Crit. Rev. Drug Carrier Syst. 1992. - Vol. 9, No 2. - P. 135-187.
34. Stan A.C., Casares S., Radu D. et al. Doxorubicin-induced death in highly invasive human gliomas // Anticancer Res. -1999. - Vol. 19,2A. - P. 941-950.
35. Steiniger S.C.J., Kreuter J., Khalansky A.S. et al. Chemotherapy of glioblastoma in rats using doxorubicin-loaded nanoparticles // Int. J. Cancer, in press.
36. StojiljkovicM.P., ZhangD., LopesH.F., etal. Hemodynamic effects of lipids in humans //Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. -2001. - Vol. 280, No 6. -R1674-R1679.
37. SzebeniJ. Fontana J.L., WassefN.M., etal. Hemodynamic changes induced by liposomes and liposome-encapsulated hemoglobin in pigs // Circulation. - 1999. -Vol. 99, No 17. - P. 2302-2309.
38. Tsuji A. P-glycoprotein-mediated efflux transport of anticancer drugs at the blood-brain barrier // Ther. Drug Monit. -1998. - Vol. 20, No 5. -P. 588-590.
39. de Verdiere A.C., Dubernet C., NematiF. etal. Reversion of multidrug resistance with polyalkylcyanoacrylate nanoparticles: towards a mechanism of action // Br. J. Cancer. -1997. - Vol. 76, No 2. - P. 198-205.
40. Walter KA, Tamargo RJ, Olivi A. et al. Intratumoral chemotherapy // Neurosurgery. - 1995. - Vol. 37, No 6. -P. 1128-1145,
41. Working P.K., Newman M.S., Sullivan T., Yarrington J. Reduction of the cardiotoxicity of doxorubicin in rabbits and dogs by encapsulation in long-circulating, pegylated liposomes //JPET. - Vol. 289, No 2. - P. 1128-1133.
42. Yamazaki T., Sato Y, Hanai M. et al. Non-ionic detergent Tween 80 modulates VP-16 resistance in classical multidrug resistant K562 cells via enhancement of VP-16 influx // Cancer Lett.-2000.-Vol. 149,No 1-2.-P. 153-161.
43. Zara G.P., Cavalli R., Bargoni A., et al. Intravenous administration to rabbits of non-stealth and stealth doxorubicin-loaded solid lipid nanoparticles at increasing concentrations of stealth agent: pharmacokinetics and distribution of doxorubicin in brain and other tissues // J. Drug Targeting. - 2002. - Vol.
10, No4.-P. 327-336.
44. Zimmer C., Weissleder R., Poss K. MR imaging of phagocytosis in experimental gliomas II Radiology. -1995. - Vol. 197, No 2. - P. 533-538.
