Исследование механизма связывания железа казеиновыми фосфопептидами Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

МИКРОНУТРИЕНТЫ В ПИТАНИИ

Для корреспонденции

Щекотова Анна Владимировна - кандидат технических наук,

старший преподаватель кафедры «Технология молочных

продуктов. Товароведение и экспертиза товаров»

ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный

университет технологий и управления»

Адрес: 670013, Республика Бурятия, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская,

д. 40в

Телефон: (3012) 41-72-06 E-mail: anna-krivonosova@yandex.ru

И.С. Хамагаева, А.В. Щекотова, С.Н. Хазагаева, А.С. Столярова

Исследование механизма связывания железа казеиновыми фосфопептидами

Investigation of the mechanism of bivalent iron binding by casein phosphopeptides

I.S. Khamagaeva, A.V. Shchekotova, S.N. Khazagaeva, A.S. Stolyarova

ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления», Улан-Удэ

East Siberia State University of Technology and Management, Ulan-Ude

В статье представлены результаты исследований механизма связывания (хелатирования) железа казеиновыми фосфопептидами (КФП). Изучены молекулярно-массовые распределения водных растворов казеиновых фосфопептидов, полученных ферментативным гидролизом казеината натрия различными протеиназами. Наибольшее количество низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой менее 2,8 кДа обнаружено в трипсиновом гидролизате. Пепсиновый и химотрипси-новый гидролизаты имеют близкий качественный состав и содержат пептиды с более высокой молекулярной массой. При гидролизе казеина-та натрия химозином в основном образуются высокомолекулярные пептиды, а фрагменты с молекулярной массой менее 2,8 кДа не обнаружены. При исследовании хелатирующей способности КФП установлено, что максимальное количество железа связывают пептидные фракции трипсинового гидролизата. В пептидных комплексах трипсинового гидролизата удельное содержание железа составляет 18,8 мг/г белка, а химотрипсинового и пепсинового - 13,2 и 11,3 мг/г белка соответственно. Отмечено, что с увеличением дозы железа степень хелатирования микроэлемента во всех гидролизатах снижается. Хроматографические исследования показали, что более 70% хелатированного железа в трип-синовом и пепсиновом гидролизатах обнаружено в пептидных фракциях с молекулярной массой 0,5-1,4 кДа и только 30% - во фракциях с молекулярной массой 1,4-4,5 кДа. Методом масс-спектроскопии изучены аминокислотные пептидные профили КФП в трипсиновом гидролизате. Установлено, что после взаимодействия аминокислот с железом величина пиков молекулярного иона на участках -Val-Ser-Ser-Glu-Glu-, а также -Ala- Glu-Ser-Ser-Ser- Glu- Glu- увеличивается на 15-25%, что указывает на связывание данных аминокислот с металлом. Полученные результаты свидетельствуют о том, что основная часть железа связывается с низкомолекулярной фракцией относительно коротких пептидов молекулярной массой 1,4-4,5 кДа. Отмечено, что при ферментативном гидролизе казеината натрия трипсином образуется наибольшее количество низкомолекулярных пептидов, которые связывают железо и повышают его биодоступность. Следует отметить, что хелатиро-ванные комплексы будут легко проникать внутрь клеток, освобождая

металл именно там, где это необходимо, защищая его при этом от окисления и взаимодействия с другими элементами в желудочно-кишечном тракте. Полученные результаты позволили оптимизировать питательную среду и обеспечить высокое хелатирование железа.

Ключевые слова: казеиновые фосфопептиды, железо, солюбилиза-ция, хелатирование, молекулярно-массовое распределение, гидролиз

The article presents the results of investigations of mechanism of binding (chelation) of iron by casein phosphopeptides (CPPs). Molecular mass distribution of peptides in the form of the aqueous solutions of casein phosphopeptides, obtained by enzymatic hydrolysis of sodium caseinate by various proteinases has been studied. The greatest number of low-molecular peptides with molecular weight less than 2.8 kDa has been detected in the trypsin hydrolysate. Peptic and chymotryptic hydrolysates have similar qualitative composition and contain peptides with higher molecular weight. Under chymosin hydrolysis of sodium casein-ate, mainly peptides with high molecular weight were formed, and fragments with molecular weight less than 2.8 kDa were not detected. In the study of chelating ability of CPPs it has been found that the maximum amount of iron was bound by peptide fraction of trypsin hydrolysate. Iron content in peptide complexes of trypsin hydrolysate was 18.8 mg/g of protein, and in those of himotrypsin hydrolysate and pepsin hydrolysate - 13.2 and 11.3 mg/g protein, respectively. It was noted that with increasing doses of iron, the degree of chelation of this micronutrient in all hydrolysates reduced. Chromatographic studies have shown that more than 70% of chelated iron in pepsin and trypsin hydrolysates, was found in peptide fractions with a molecular weight of 0.5-1.4 kDa and only 30% in fractions with a molecular weight of 1.4-4.5 kDa. Amino acid profiles of CPPs peptides have been studied in trypsin hydrolysate by using mass-spectroscopy. It was found that after the interaction of amino acids with iron the value of molecular ion peaks on the plots -Val-Ser-Ser-Glu-Glu-, and-Ala-Glu-Ser-Ser-Ser-Glu-Glu- increased by 15-25%, indicating the binding of these amino acids with the metal. The data obtained showed that most of the iron was associated with low molecular weight fraction of relatively short peptides of molecular weight from 1.4 to 4.5 kDa. It was noted that enzymatic hydrolysis of sodium caseinate by trypsin produced the greatest amount of low molecular weight peptides that bond iron and increased its bioavailability. It should be noted that chelated complexes are easy to penetrate into the cells, freeing the metal exactly where it is needed, protecting it from oxidation and interaction with other elements in the gastrointestinal tract. The results obtained allowed to optimize the nutrient medium and to provide high chelation of iron.

Keywords: casein phosphopeptide, iron, solubilisate, chelation, molecular weight distribution, hydrolysis

Железодефицитные состояния по-прежнему остаются ш ■ ^актуальной и во многих отношениях нерешенной проблемой современной медицины [1-4]. Учитывая, что в повседневной жизни человек потребляет железо в составе растительных и животных продуктов и что наличие аминокислот и пептидов, а также белков животного происхождения способствует лучшему усвоению организмом этого микроэлемента, представляется целесообразным обогащать рационы питания именно органическими формами железа.

Из данных литературы известно, что в качестве биологически активных добавок к пище (БАД) может ис-

пользоваться биомасса микроводорослей, обогащенная железоорганическими соединениями, нормализующая обмен железа у человека и животных. Однако нерешенной проблемой массового культивирования микроводорослей является нестабильность выхода биомассы и ее состава [5]. В настоящее время обсуждается [6, 7] возможность использования в качестве источника биодоступного железа наночастиц среднего фосфата железа (III) (FePO4). Приведенные результаты показывают, что использование нерастворимых и химически инертных наночастиц FePO4 имеет хорошие перспективы, однако данный вопрос требует дополнительного изучения.

Кроме того, нерастворимые формы наночастиц FePO4 могут вызывать побочные эффекты в виде раздражения слизистой желудочно-кишечного тракта. Поэтому биологически активные вещества естественного природного происхождения более предпочтительны для организма, так как действуют гораздо мягче и более длительно. К таким родственным организму человека биологически активным веществам относятся казеиновые фосфопептиды (КФП) [8-12].

Необходимо отметить, что исключительная биодоступность кальция из молока и молочных продуктов обусловлена наличием КФП, которые образуются в желудочно-кишечном тракте при переваривании казеина и обеспечивают высокую растворимость кальция в тонкой кишке [8].

С учетом хелатирующей способности КФП нами разработан новый вид БАД на основе биомассы пропи-оновокислых бактерий, содержащей комплекс КФП, связанных с железом [13]. Выбор пропионовокислых бактерий в качестве объекта для создания железосодержащей БАД обусловлен тем, что они являются общепризнанными пробиотиками, устойчивы к действию желчных кислот и выдерживают низкую кислотность желудка, что очень важно для создания пробиотических препаратов [14]. Пропионовокислые бактерии растут в анаэробных условиях, синтезируют гемовые ферменты, супероксиддисмутазу, каталазу, перокси-дазу, витамины группы В, особенно в большом количестве витамин В12, что будет способствовать антиокислительной защите железа и его нормальному усвоению [14-16].

В отличие от других существующих средств профилактики дефицита железа разработанная нами БАД содержит высокое количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий и профилактическую дозу биодоступного железа.

Цель настоящей работы - исследование механизма связывания железа казеиновыми фосфопептидами.

Материал и методы

Объектом исследования служил водный раствор КФП, который получали путем ферментативного гидролиза натриевого казеината [8, 17-19]. При получении КФП применяли схему одностадийного гидролиза казеината натрия с использованием пепсина (КФ 3.4.23.1), трипсина (КФ 3.4.21.4), химозина (КФ 3.4.23.4) и химотрипсина (КФ 3.4.21.1) при оптимальных для каждого фермента значениях рН. Реакцию проводили при соотношении фермент:субстрат 1:100 в течение 6 ч. После протеолитического переваривания гидролизаты подкисляли до рН 4,6. При этом в осадок выпадал интактный казеин и нерастворимые продукты его гидролиза, которые отделяли центрифугированием или ультрафильтрацией.

Для получения хелатированных комплексов железа с КФП в полученные гидролизаты казеината натрия

добавляли различное количество сульфата железа (5-20 мг/мл). С целью удаления из конечного продукта несвязанных ионов железа гидролизаты подвергали нанофильтрации.

В качестве источника железа использовали двухвалентную его соль (FeSO4).

Количество хелатированного железа (Fe) (т.е. процент связанного железа от первоначальной дозы) определяли колориметрическим методом [20]. Метод основан на измерении интенсивности окраски раствора комплексного соединения двухвалентного железа с ортофенант-ролином красного цвета.

Молекулярно-массовое распределение пептидов в составе водного раствора КФП оценивали эксклю-зионной хроматографией среднего давления [21] на колонке "TSK GEL" (0,8x30 см) ("НР", США) и колонке "Superóse 12" (1,6x50 см) ("Pharmacia", Швеция). Оптическую плотность элюируемого раствора регистрировали, используя проточный ультрафиолетовый детектор при длине волны 280 нм. В качестве элюента использовали буферный раствор 0,05 М KH2PO4.

Пептидные фракции гидролизатов исследовали на времяпролетном MALDI масс-спектрометре "Ultraflex Tof/Tof" ("Bruker", Германия) в одном из ведущих проте-омных центров страны, ЦКП «Протеом человека» (Москва), созданном на базе отдела постгеномных технологий ФГБНУ ИБМХ [22, 23].

Для характеристики связывания железа с пептидными структурами КФП было проведено хроматографи-ческое исследование весовым методом в диапазоне от свободного до полного объема хроматографической колонки [24].

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программы Statistica 6. Использовали непараметрический критерий Манна-Уитни(для сравнения независимых выборок). Значимыми считали различия, если вероятность ошибки р<0,05.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследований были изучены молеку-лярно-массовые распределения КФП, полученных одностадийным гидролизом казеината натрия различными протеиназами в течение 6 ч. Результаты исследований представлены в табл. 1.

Из данных табл. 1 следует, что через 6 ч гидролиза трипсином содержание низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой (м.м.) менее 2,8 кДа составило 26,6%. Что касается пепсина и химотрипсина, то полученные гидролизаты при достаточно хорошей скорости гидролиза имеют весьма близкий качественный состав и содержат пептиды с более высокой м.м. в пределах 5,1-11,0 кДа, что в процентном соотношении составляет 21,4 и 19,5% соответственно. Количество пептидов с м.м. менее 2,8 кДа в этих гидролизатах не превышает 11%, что в 2,5 раза меньше, чем в трипсиновом гидролизате. При гидролизе

Таблица 1. Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в гидролизатах

Пределы молекулярных масс, кДа Относительное распределение фракций, % в зависимости от используемого фермента

пепсин трипсин химозин химотрипсин

>20 10,5±0,5 - 20,5±1,3 4,2±0,9

20,1-18,7 9,2±1,6 - 22,6±0,5 7,3±1,1

18,7-12,5 7,6±1,2 5,7±1,5 18,4±1,1 12,7±0,8

12,5-11,0 15,7±0,8 13,2±0,9 16,7±0,9 18,1±1,6

11,0-5,1 19,5 ±1,1 15,1 ±1,2 11,8±0,8 21,4±1,2**

5,1-2,8 14,4±1,4 17,0±1,6 9,4±1,4 15,1±1,3**

2,8-1,0 11,7±0,8* 26,6±0,9 - 10,6±0,5*

<1 10,1 ±0,9 22,1 ±0,7 - 9,5±1,1

П р и м е ч а н и е. * - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя трипсинового гидролизата согласно критерию Манна-Уитни; ** - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя пепсинового гидролизата согласно критерию Манна-Уитни.

химозином в основном присутствуют высокомолекулярные пептиды, а фрагменты с м.м. менее 2,8 кДа вообще не обнаружены. Таким образом, при ферментативном гидролизе казеината натрия трипсином обнаружено наибольшее количество низкомолекулярных пептидов.

На следующем этапе исследований было изучено влияние КФП в различных гидролизатах на солюби-лизацию (хелатирование) железа. Для этого в водный раствор КФП вносили сульфат железа в количестве 5-20 мг/мл и оценивали степень хелатирования минерального вещества (т.е. процент связанного железа от первоначальной дозы). Результаты исследования представлены на рис. 1.

Из данных рис. 1 следует, что КФП проявляют различную хелатирующую активность. Максимальное количество хелатированных комплексов железа образуется в трипсиновом гидролизате при внесении 5 мг/мл железа и составляет 100%.В пептидных комплексах трипсиново-го гидролизата удельное содержание железа составляет 18,8 мг/г белка, а химотрипсинового и пепсинового -13,2 и 11,3 мг/г белка соответственно. Отмечено, что с увеличением дозы железа степень хелатирования микроэлемента во всех гидролизатах снижается. Это, вероятно, объясняется тем, что КФП могут связывать только ограниченное число молекул железа, т.е. количество ионизированного микроэлемента не должно превышать количество имеющихся анионных гидрофильных участков аминокислот КФП.

Для изучения механизма связывания железа с пептидными структурами трипсинового и пепсинового гид-ролизатов был использован хроматографический метод (см. рис. 2).

Полученные данные (см. рис. 2) свидетельствуют о том, что в исследуемых растворах КФП преобладающей формой железа являются его комплексы с относительно короткими пептидами. Более 70% хелатирован-ного железа в трипсиновом и пепсиновом гидролизатах обнаружено в пептидных фракциях с м.м. 0,5-1,4 кДа и только 30% - во фракциях с м.м. 1,4-4,5 кДа.

Доза вносимого железа, мг/мл

■ Трипсиновый гидролизат □ Пепсиновый гидролизат

■ Химотрипсиновый гидролизат 1=1 Химозиновый гидролизат

Рис. 1. Влияние казеиновых фосфопептидов в различных фер-ментолизатах на хелатирование железа

Известно, что минералосвязывающая способность КФП зависит от степени фосфорилирования [8, 17-19]. Исследования аминокислотных пептидных профилей КФП в трипсиновом гидролизате показали, что после взаимодействия аминокислот с железом величина m/z пиков молекулярного иона на участках -Val-Ser-Ser-Glu-Glu-, а также -Ala-Glu-Ser-Ser-Ser-Glu-Glu- увеличивается на 15-25% (рис. 3), что указывает на связывание данных аминокислот с металлом.

Следует отметить, что комплексообразование ионов железа с низкомолекулярными пептидами в гидроли-затах влияет на молекулярно-массовое распределение пептидных фракций. Причиной изменений молекуляр-но-массового распределения могут быть, по-видимому, как преципитация части фракций относительно крупных пептидов при взаимодействии с ионами металла, так и возникновение «мостиков» или «сшивок» между молекулами коротких пептидов, координирующих центральный атом железа, что согласуется с гипотезой, выдвинутой авторами [25].

В результате исследований установлено, что взаимодействие пептидных структур гидролизата с кати-онным микроэлементом железа сопряжено со связы-

-100

-80

-60

-40

-20

о га

:л -я

га^£ со о

са

V 28,2 11,2 4,5 1,4 0,5 V

св ' ' ' ' ' п

Диапазон молекулярных масс фракций, кДа а

-80

-60

-40

-20

оа

:л -я

га^£ со о

са

V 28,2 11,2 4,5 1,4 0,5 V

св п

Диапазон молекулярных масс фракций, кДа б

Рис. 2. Хелатирующая способность фракций казеиновых фосфопептидов, выделенных из разных гидролизатов при внесении 5 мг/мл микроэлемента: трипсинового (а) и пепсинового (б) гидролизата

■ хЮ^ 1,50-

1,25 -1,000,750,50 0,25 0,004

977,622

1252,728

1418,805

Л.

2172,321

2763,730

-1-

I

^х104 га

« 1,2

с

СБ

Е 1,00,80,60,40,20,0

1000 1500 2000 2500 3000 3500т/2 а

1241,006

1352,023

1408,247

2347,942

2764,325

Л_

1000 1500 2000 2500 3000 3500тЛ: б

Ри^ 3. Масс-спектры водного раствора казеиновых фосфопептидов, выделенных с использованием трипсина: без железа (а) и с добавлением 5 мг/мл железа (б)

Р

Р

280

ванием железа с относительно короткими пептидами в диапазоне м.м. 0,5-1,4 кДа. Такие хелатированные комплексы будут легко проникать внутрь клеток, освобождая металл именно там, где это необходимо, защищая его при этом от окисления и взаимодействия с другими элементами в желудочно-кишечном тракте.

Полученные результаты позволили оптимизировать питательную среду и обеспечить высокое хелатирова-ние железа и активный рост пропионовокислых бактерий [13, 15].

Употребление 5 мл БАД, содержащей 2,25 мг хелати-рованного железа, обеспечит 20% от рекомендуемой суточной нормы потребления этого минерального вещества [13].

Заключение

В результате проведенных исследований установлено, что железо связывается с относительно короткими низкомолекулярными фракциями КФП. Отмечено, что при ферментативном гидролизе казеината натрия трипсином образуется наибольшее количество низкомолекулярных пептидов, которые связывают железо и повышают его биодоступность. Методом масс-спектроскопии определены аминокислотная последовательность пептидных профилей КФП и участки взаимодействия аминокислот с железом. Полученные результаты открывают широкие перспективы для создания новых лечебно-профилактических продуктов, обогащенных легкоусвояемыми биодоступными микроэлементами.

Сведения об авторах

Хамагаева Ирина Сергеевна - доктор технических наук, профессор, заведующая кафедрой «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления», директор ООО МИП «Бифивит» (Улан-Удэ) Е-таИ: mip.bifivit@mail.ru

Щекотова Анна Владимировна - кандидат технических наук, старший преподаватель кафедры «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» (Улан-Удэ) Е-таИ: anna-krivonosova@yandex.ru

Хазагаева Софья Николаевна - кандидат технических наук, старший преподаватель кафедры «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» (Улан-Удэ) Е-тшИ: xasagaevasonya82@mail.ru

Столярова Анна Сергеевна - кандидат технических наук, доцент кафедры «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» (Улан-Удэ) Е-тшИ: anna_sergsto@mail.ru

Литература

1. Сельчук В.Ю., Чистяков С.С., Толокнов Б.О., Манзюк Л.В. др. Железодефицитная анемия: современное состояние проблемы // Рус. мед. журн. 2012. № 1. С. 1-8.

2. Смагулова И.Е., Шарманов Т.Ш., Балгимбеков Ш.А. Распространенность анемии у детей и женщин репродуктивного возраста в Казахстане и основные принципы ее профилактики // Вопр. питания. 2013. Т. 82, № 5. С. 58-63.

3. Струтынский А.В. Диагностика и лечение железодефицитных анемий // Рус. мед. журн. 2014. № 11. С. 839-844.

4. Stephenson L.S., Latham M.C., Ottesen EA. Global malnutrition // Parasitology. 2000. Vol. 121, suppl. 1. P. S5-22.

5. Голтвянский А.В., Сысенко Е.И. Биоаккумуляция железа и сезонная вариабельность продуктивности культуры микроводорослей Dunaliella viridis Teod // Бютехнолопя. Наука. Освта. Практика: тези доповщей IV Мiжнародноí науково-практичноУ конференцп. Днтропетровськ, 2008. С. 18-19.

6. Верников В.М., Арианова Е.А., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. и др. Нанотехнологии в пищевых производствах: перспективы и проблемы // Вопр. питания. 2009. Т. 78, № 2. С. 4-17.

7. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Биодоступность наночастиц оксида железа при использовании их в питании. Результаты экспериментов на крысах // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 3. С. 25-30.

8. Гаппаров М.М., Стан Е.Я. Влияние казеиновых фосфопептидов на биодоступность минералов // Вопр. питания. 2003. № 6. С. 40-44.

9. Chiu S.C.K., Kitts D.D. Antioxidant characterization of caseinphos-phopeptides from bovine milk // Nutraceutical Beverages: Chemistry, Nutrition and Health Effects. Series A. ACS Symposium Series / eds F. Shahidi, D.K. Weerasinghe. Washington, 2004. Vol. 871. P. 279-289.

10. Diaz M., Decker E.A. Antioxidant mechanisms of caseinophospho-peptides and casein hydrolysates and their application in ground beef // J. Agric. Food Chem. 2004. Vol. 52. P. 8208-8213.

11. Dziuba J., Iwaniak A. Database of protein and bioactive peptide sequences // Nutraceutical Proteins and Peptides in Health and Disease / eds V. Mine, F. Shahidi. Boca Raton; London : CRC Press, Taylor and Francis Group, 2006. P. 543-563.

12. Kamau S.M., Lu R.R., Chen W., Liu X.M. et al. Functional significance of bioactive peptides derived from milk proteins // Food Rev. Int. 2010. Vol. 26. P. 386-401.

References

1. Selchuk V.Y., Chistyakov S.S., Toloknov B.O, Manzuk L.V., et al. meditsinskiy zhurnal [Russian Medical Journal]. 2012; Vol. 1: 1-8.

Iron deficiency anemia: current state of the problem. Russkiy (in Russian)

13. Кривоносова А.В. Разработка технологии биологически активной добавки, обогащенной железом : автореф. дис. ... канд. тех. наук. Улан-Удэ, 2007.

14. Воробьева Л.И. Пропионовокислые бактерии. М. : Изд-во МГУ, 1999. 300 с.

15. Хамагаева И.С., Кривоносова А.В. Влияние сульфата железа на активность пропионовокислых бактерий // Мол. пром-сть. 2007. № 6. С. 33.

16. Хамагаева И.С., Кривоносова А.В. Влияние сульфата железа на синтез внеклеточных факторов адаптации пропионовокислых бактерий // Мол. пром-сть. 2009. № 6. С. 71-72.

17. Berrocal R., Chanton S., Jullerat M.A., Pavillard B. et al. Tryptic phosphopeptides from whole casein. II Physicochemical properties related to the solubilization of calcum // J. Dairy Res. 1988. Vol. 56. P. 335-341.

18. Fitz Gerald R.J., Meisel H.M. Milk protein hydrolysis and bioactive peptides // Advanced Dairy Chemistry. 3rd ed. Pt B, Ch. 14 / eds P.F. Fox, P. McSweeney. New York : Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2003. P. 675-698.

19. Juillerat M.A., Baechler R., Berrocol R., Chanton S. et al. Tryptic phos-phopeptides from whole casein. I Preparation and analysis by fast protein liquid chromatography // J. Dairy Res. 1988. Vol. 56. P. 603-611.

20. ГОСТ 26928-86 Продукты пищевые. Метод определения железа. Введ. 1988-07-01. М. : Изд-во стандартов, 1988. Переиздан.: М. : Изд-во стандартинформ, 2010. С. 107-110.

21. Mori S., Barth H.G. Size-Exclusion Chromatography. Berlin : Springer. 1999. 234 p.

22. Torshin I.Yu. Bioinformatics in the post-genomic era: sensing the change from molecular genetics to personalized medicine. New York : Nova Biomedical Books, 2009 («Bioinformatics in the Post-Genomic Era» series, ISBN: 978-1-60692-217-0).

23. URL: www.proteocentr.ru

24. Schoneich C., Kwok S.K., Wilson G.S. Separation and analysis of peptides andproteins // Anal. Chem. 1993. Vol. 65. P. 67—84.

25. Мазо В.К., Зорин С.Н., Гмошинский И.В., Баяржаргал Г. и др. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов. Комплексы цинка с ферментативным гидролизатом сывороточных белков коровьего молока // Вопр. дет. диетологии. 2003. Т. 1, № 6. С. 6-8.

MMKPOHyTPMEHTbl B nMTAHMM

2. Smagulova I.E., Sharmanov T.Sh., Shamidin Sh.A. The prevalence of anemia in children and women of reproductive age in Kazakhstan and the basic principles of its prevention. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2013; Vol. 82 (5): 58-63. (in Russian)

3. Strutynskiy A.V. Diagnosis and treatment of iron deficiency. Russ-kiy meditsinskiy zhurnal [Russian Medical Journal]. 2014; Vol. 11: 839-44. (in Russian)

4. Stephenson L.S., Latham M.C., Ottesen E.A. Global malnutrition. Parasitology. 2000; Vol. 121 (suppl. 1): S5-22.

5. Goltvynsky A.V., Sisenko E.I. Bioaccumulation of iron and seasonal variability in the productivity of microalgae cultures Dunaliella viri -dis Teod. Biotechnology. Science. Education. Practice: abstracts of reports of IV International scientific-practical conference. Dnepropetrovsk, 2008: 18-9. (in Ukrainian)

6. Vernikov V.M., Arianova E.A., Gmoshinsky I.V, Homchenko S.A., et al. Nanotechnology in food production: prospects and challenges. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2009; Vol. 78 (2): 4-17. (in Russian)

7. Raspopov R.V., Trushina E.N., Gmoshinskyi I.V., Homichenko S.A. The bioavailability of nanoparticles of ferric oxide when used in nutrition. The results of experiments on rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2011; Vol. 80 (3): 25-30. (in Russian)

8. Gapparov M.M., Stan E.Y. The effect of casein phosphopeptides on the bioavailability of minerals. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2003; Vol. 6: 40-4. (in Russian)

9. Chiu S.C.K., Kitts D.D. Antioxidant characterization of caseinphos-phopeptides from bovine milk. In: Shahidi F., Weerasinghe D.K. (eds). Nutraceutical Beverages: Chemistry, Nutrition and Health Effects. Series A. ACS Symposium Series, 2004; Vol. 871: 279-289.

10. Diaz M., Decker E.A. Antioxidant mechanisms of caseinophospho-peptides and casein hydrolysates and their application in ground beef. J Agric. Food Chem. 2004; Vol. 52: 8208-13.

11. Dziuba J., Iwaniak A. Database of protein and bioactive peptide sequences. In: V. Mine, F. Shahidi (eds). Nutraceutical Proteins and Peptides in Health and Disease. Boca Raton; London: CRC Press, Taylor and Francis Group, 2006: 543-563.

12. Kamau S.M., Lu R.R., Chen W., Liu X.M., et al. Functional significance of bioactive peptides derived from milk proteins. Food Rev Int. 2010; Vol. 26: 386-401.

13. Krivonosova A.V. Development of technology of biologically active additives, enriched with iron: Author's abstract of candidate of technical sciences. Ulan-Ude, 2007. (in Russian)

14. Vorobyova L.I. Propionic acid bacteria. Moscow: Publishing casam (MSU), 1999: 300 p. (in Russian)

15. Khamagaeva I.S., Krivonosova A.V. The effect of ferrous sulfate on the activity of propionic acid bacteria. Molochnaya promyshlennost' [Dairy]. 2007; Vol. 6: 33. (in Russian)

16. Khamagaeva I.S., Krivonosova A.V. The effect of ferrous sulfate on the synthesis of extracellular factors of adaptation of propionic acid bacteria. Molochnaya promyshlennost' [Dairy]. 2009; Vol. 6: 71-2. (in Russian)

17. Berrocal R., Chanton S., Jullerat M.A., Pavillard B., et al. Tryptic phos-phopeptides from whole casein. II Physicochemical properties related to the solubilization of calcum. J Dairy Res. 1988; 56: 335-41.

18. Fitz Gerald R.J., Meisel H.M. Milk protein hydrolysis and bioactive peptides In: P.F. Fox, P. McSweeney (eds). Advanced Dairy Chemistry. 3rd ed. Pt B, Ch. 14. New York : Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2003: 675-98.

19. Juillerat M.A., Baechler R., Berrocol R., Chanton S., et al. Tryptic phos-phopeptides from whole casein. I Preparation and analysis by fast protein liquid chromatography. J Dairy Res. 1988; Vol. 56: 603-11.

20. GOST 26928-86 Food products. Method for determination of iron -Introduction. 1988-07-01. Moscow: Publishing house of standards, 1988. Reissued. Moscow: Publishing hous Standartinform, 2010: 107-10. (in Russian)

21. Mori S., Barth H.G. Size-Exclusion Chromatography. Berlin: Springer; 1999: 234 p.

22. Torshin I.Yu. Bioinformatics in the post-genomic era: sensing the change from molecular genetics to personalized medicine. New York: Nova Biomedical Books, 2009. («Bioinformatics in the Post-Genomic Era» series, ISBN: 978-1-60692-217-0).

23. URL: www.proteocentr.ru

24. Schoneich C., Kwok S.K., Wilson G.S. Separation and analysis of peptides andproteins. Anal Chem. 1993; Vol. 65: 67-84.

25. Mazo V.K., Zorin S.N., Gmoshinsky I.V., Bayarzhargal G., et al. New food sources of essential micronutrients. Complexes of zinc with enzymatic hydrolysate of whey proteins of cow's milk. Voprosy dets-koj dietologii [Problems of Pediatric Dietetics]. 2003; Vol. 6: 6-8. (in Russian)