CC BY
78
УДК 543.94
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕДИАТОРНЫХ СВОЙСТВ 2,5-ДИБРОМ-Я-БЕНЗОХИНОНА В АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОМ БИОСЕНСОРЕ НА ОСНОВЕ МЕТИЛОБАКТЕРИЙ
Т. А. Кузнецова, М.А. Туленинова
Проведены исследования медиаторных свойств производного п-бензохинона -2,5-дибром-п-бензохинона в условиях функционирования амперометрического биосенсора с клетками рекомбинантного штамма метилобактерий в качестве биокатализатора. Методом вольтамперометрии показана принципиальная возможность использования 2,5-дибром-п-бензохинона в качестве медиатора электронного транспорта в биосенсоре на основе Methylobacterium extorquens pCM160. Показано, что 2,5-дибром-п-бензохинон существенно не изменяет профиль субстратной специфичности биокатализатора. Определены основные характеристики разработанного биосенсора.
Ключевые слова: п-бензохинон, биоэлектрокатализ, метилобактерии, медиаторы электронного транспорта, биосенсор.
Бензохиноны могут служить медиаторами электронного транспорта при разработке биосенсоров на основе клеток микроорганизмов или ферментов, поскольку обладают низким восстановительным потенциалом. Для хинонов характерно образование стабильной обратимой редокс-системы (Е0=0,275 В): окисленная форма (хинон) ^ восстановленная форма (гидрохинон) [1]. Применение бензохинонов в биоэлектрокатализе в качестве медиаторов электронного транспорта отражено в научной литературе достаточно широко. Так, в работах [2, 3] на основе п-бензохинона, клеток Psychrobacter sp. и E. coli разработаны амперометрические биосенсоры для определения содержания тяжелых металлов. В работе [4] угольно-пастовый электрод, модифицированный п-бензохиноном, в сочетании с наночастицами и ферментом глюкозоксидазой применяли для амперометрической детекции глюкозы. В работе [5] угольные электроды на основе пирролохинолинхинон (PQQ) -зависимой глюкоздегидрогеназы модифицировали функциональными производными убихинона - 1,2- и 1,4 - бензохиноном для увеличения скорости переноса электронов и генерации более высокого тока в системе. В обзоре [6] суммированы результаты исследований, проводимых ранее нашими коллегами при исследовании биоэлектрокаталитических процессов на основе целых клеток Gluconobacter oxydans и медиаторов электронного транспорта различного строения. Показано, что наряду с другими производными бензохинона, 2,5-дибром-п-бензохинон в таких системах обладает наилучшей эффективностью.
Ключевым фактором переноса электронов на электрод является мембранная локализация дегидрогеназ, связанных с ферментами
дыхательной цепи бактерий. В связи с этим, перспективными биокатализаторами таких систем могут служить клетки метилобактерий, которые имеют периплазматическую локализацию PQQ - дегидрогеназ, ключевой из которых является метанолдегидрогеназа (МДГ) [7, 8]. Известно лишь несколько разработанных биосенсоров на основе метилобактерий [9,10]. Таким образом, бензохинон и его производные находят широкое применение в биоэлектрокатализе, однако данные о подобных системах на основе целых клеток метилобактерий в литературе отсутствуют.
Целью работы являлся синтез производного бензохинона - 2,5-дибром-п-бензохинона и изучение его медиаторных свойств в условиях функционирования амперометрического биосенсора на основе клеток метилобактерий.
Материалы и методы
Синтез медиатора. Синтез 2,5-дибром-п-бензохинона осуществляли по известной методике [11]. Полученный продукт очищали перекристаллизацией из этилового спирта и дополнительно возгонкой, идентифицировали по температуре плавления (190°С). Выход продукта составил 68 %.
Микроорганизмы. В работе использовали рекомбинантный штамм метилобактерий Methylobacterium extorquens pCM160 [12].
Условия культивирования. Микроорганизмы выращивали на качалке (180 об/мин) при 29 °С в колбах Эрленмейера с 200 мл среды Канеда, содержащей (г/л): KH2PO4 - 2, (NH4)2SO4 - 2, NaCl - 0,5, MgSO4 х 7H2O - 0,025, FeSO4 х 7H2O - 0,002, рН 7,2. Метанол и канамицин вносили в стерильные среды до концентрации 0,5 % (по объему) и 50 мкг/мл, соответственно. Клетки микроорганизмов отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 20 мин и промывали 50 мМ калий фосфатным буфером, pH 7,2.
Формирование рабочего электрода. Рабочий электрод готовили, наполняя графитовой пастой пластиковую трубку диаметром 3 и высотой 95 мм. Графитовую пасту готовили смешиванием следующих компонентов: 90 мг графитовой пудры («Fluka», Германия), 10 мг 2,5-дибром-п-бензохинона и 40 мкл парафинового масла («Fluka», Германия) в агатовой ступке. Трубка содержала серебряную проволоку для электрического контакта с частицами графита. На поверхность электрода (площадь 7.1 мм ) наносили 5 мкл суспензии клеток (400 мг/мл) в 50 мМ калий-фосфатном буфере pH 7,5, и подсушивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Поверхность электрода накрывали диализной мембраной с размером пор 14 кДа («Sigma», США,), закрепляя ее пластиковым кольцом.
Электрохимические измерения. Амперометрические измерения проводили в двухэлектродной ячейке при потенциале 220 мВ и непрерывном перемешивании (300 об/мин). Рабочим электродом служил модифицированный 2,5-дибром-и-бензохиноном графито-пастовый электрод с иммобилизованными клетками. Электрод сравнения -хлорсеребряный. Электролитическую ячейку заполняли 3,95 мл 50 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,5 и 50 мкл раствора субстрата необходимой концентрации.
За ответ сенсора принимали величину разности силы тока (Д1 = I -10) до внесения (10) и после внесения (I) субстрата в измерительную кювету. Регистрацию циклических вольтамперограмм проводили в двухэлектродной ячейке. Все электрохимические измерения и регистрацию данных проводили с помощью гальванопотенциостата 1РС2000 («Вольта», Россия), сопряженного с компьютером с программным обеспечением 1РС-М1сго 8.65. Диапазон регистрируемых токов 1 нА - 10 мА. Ошибка измерения потенциала не более 0.1 мВ для интервала ± 5 В.
Результаты и их обсуждение
Для изучения возможности применения 2,5-дибром-и-бензохинона в качестве медиатора электронного транспорта использовали амперометрический биосенсор биокаталитического типа, в котором 2,5-дибром-и-бензохинон входил в состав пасты рабочего электрода. Биокатализатором служили клетки рекомбинантного штамма метилобактерий Methylobacterium extorquens рСМ160. Предварительно изучали окислительно-восстановительные свойства 2,5-дибром-и-бензохинон методом циклической вольтамперометрии в двухэлектродной системе, результаты представлены на рисунке.
Окисление 2,5-дибром-и-бенхохинона на электроде происходит при 220 мВ, что соответствует пику на вольтамперограмме. Рост на вольтамперограмме анодного тока при иммобилизации бактерий и введении субстрата, соответствующий протеканию в системе электрокаталитического процесса, служил критерием, показывающим принципиальную возможность использования исследуемого вещества в качестве медиатора в биосенсоре.
Окисление метанола в клетках метилобактерий катализирует фермент МДГ, коферментом которого является Р00. Процесс, протекающий при электрокаталитическом окислении метанола мембранной МДГ в присутствии 2,5-дибром-и-бенхохинона, может быть представлен следующим образом:
е?мв
Циклические волътамперограммы (50 мВ/с) графитово-пастового электрода: А - модифицированного 2,5-дибром-п-бензохиноном, Б - модифицированного 2,5-дибром-п-бензохиноном с иммобилизованными бактериями в присутствии 1,25 мМметанола
Анод (подается потенциал 220 мВ относительно электрода сравнения):
сн3он + -^ неон + рсюн2 -
о он
он О
Катод:
AgCl + е"-► Ag + С1"
Активные центры ферментов взаимодействуют с 2,5-дибром-п-бензохиноном, восстанавливая его до 2,5-дибром-п-гидрохинона. При наложенном на рабочий электрод потенциале 2,5-дибром-п-гидрохинон окисляется до 2,5-дибром-п-бензохинона и вступает в новый цикл взаимодействий.
Ранее в работе [13] был проведен сравнительный анализ индексов эффективности медиаторов электронного транспорта (2,5-дибром-п-бензохинона, ферроцена, 2,6-дихлорфенолиндофенола) в биосенсорах на основе метилобактерий, и показано, что первый способен взаимодействовать с ферментными системами бактерий in vivo лучше других медиаторов. Однако дальнейшие исследования, направленные на изучение медиаторных свойств и влияния 2,5-дибром-п-бензохинона на специфичность биокатализатора, не проводились. Поэтому важным этапом данной работы являлось изучение субстратной специфичности рекомбинантного штамма метилобактерий в присутствие 2,5-дибром-п-бензохинона в условиях функционирования амперометрического медиаторного биосенсора. При определении субстратной специфичности биокатализатора показано, что использование 2,5-дибром-п-бензохинона практически не изменяет субстратную специфичность рекомбинантных метилобактерий. Известно, что основной фермент, катализирующий окисление спиртов в клетках метилобактерий, - мембранная МДГ, не являясь высокоспецифичным ферментом, кроме метанола, способна окислять первичные спирты, но незначительно взаимодействует с их вторичными изомерами. Так, ответы сенсоров на метанол, его гомологи (С1-С5) и формальдегид являются максимальными (табл. 1).
Таблица 1
Субстратная специфичностьрекомбинантныхметилобактерий
в присутствии 2,5-дибром-п-бензохинона
Субстрат Относительный ответ биосенсора, %
Метанол 100
Этанол 79
Пропанол-1 84
Пропанол-2 13
Бутанол-1 86
2-метилпропанол-1 75
2-метилпропанол-2 11
Формальдегид 77
Активность фермента снижается по отношению к субстратам с увеличением длины их углеродной цепи. Высокий ответ биосенсора на основе рекомбинантных метилобактерий на формальдегид, возможно,
обусловлен активностью формальдегиддегидрогеназы - фермента пути прямого окисления формальдегида, а также может быть обусловлен неспецифическим окислением гидратированной формы формальдегида (гемдиола) метанолдегидрогеназой.
Аналитические и метрологические характеристики амперометрического медиаторного биосенсора на основе рекомбинантных метилобактерий были рассчитаны на основе градуировочных зависимостей откликов сенсора от концентрации метанола в кювете (табл. 2).
Таблица 2.
Аналитические и метрологические характеристики амперометрического медиаторного биосенсора на основе рекомбинантных метилобактерий и медиатора
Характеристика биосенсора Значение
Коэффициент чувствительности, (мкА • дм )/ моль 2,1 ± 0,1
Нижняя граница определяемых концентраций метанола, мМ 0,25
Верхняя граница определяемых концентраций метанола, мМ 0,63 ± 0,02
Относительное стандартное отклонение (п=10), % 4,6
Предел обнаружения, мМ 0,08
Воспроизводимость, % 7
По своим параметрам биосенсор не уступает аналогичному [14], в котором в качестве медиатора электронного транспорта использовался ферроцен. Амперометрический биосенсор на основе рекомбинантных метилобактерий в присутствии 2,5-дибром-п-бензохинона делает возможным определение широкого спектра концентраций метанола и может служить прототипом опытных образцов биосенсоров, которые в перспективе могут использоваться на предприятиях биотехнологического профиля для анализа сточных вод и продуктов пищевой промышленности.
Заключение
Процесс биоэлектрокаталитического окисления метанола клетками рекомбинантного штамма метилобактерий эффективно протекает при
использовании в качестве медиатора 2,5-дибром-п-бензохинона. Сходство структур 2,5-дибром-п-бензохинона и убихинона - природного мобильного компонента дыхательной цепи - позволяет предположить, что механизмы их восстановления в дыхательной цепи близки. Однако галогенпроизводные хинонов имеют более высокие окислительно-восстановительные потенциалы. Эти особенности строения 2,5-дибром-п-бензохинона могут определять его медиаторные свойства в биосенсорных системах на основе метилобактерий.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ мол_а №16-3400409.
Библиографический список
1. Микробные сенсоры на основе производных ферроцена и бензохинона, применяемых в качестве медиаторов / Е.Ю. Чигринова, Е.Е. Бабкина, О.Н. Понаморева, [и др.] // Сенсорные системы. 2007. Т. 21. С. 263-269.
2. P-benzoquinone-mediated amperometric biosensor developed with Psychrobacter sp. for toxicity testing of heavy metals / Xu. Wang, M. Liu, Xi. Wang [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2013. V. 41. P. 557-562.
3. The benzoquinone-mediated electrochemical microbial biosensor for water biotoxicity assay / J. Li, Y. Yu, Y. Wang [et al.] // Electrochimica Acta. 2013. V. 97. P. 52- 57.
4. Amperometric carbon paste enzyme electrodes with Fe3O4 nanoparticles and 1,4-Benzoquinone for glucose determination / P. Erden, B. Zeybek, §. Pekyardimci [et al.] // Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 2013. V. 41. P.165-171.
5. Babanova S. Quinone-modified surfaces for enhanced enzyme-electrode interactions in pyrroloquinoline-quinone-dependent glucose dehydrogenase anodes / S. Babanova, I. Matanovic, P. Atanassov [et al.] // ChemElectroChem. 2014. V. 1. P. 2017 - 2028.
6. Понаморева О.Н. Биосенсоры и биотопливные элементы на основе целых клеток микроорганизмов и выделенных из них ферментов: обзор // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2009. Вып. 1. C. 138-157.
7. Троценко Ю.А. Доронина Н.В., Торгонская М.Л. Аэробные метилобактерии / под ред. В.Ф. Гальченко. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2010. 325 с.
8. Aerobic methylobacteria as promising objects of modern biotechnology (Review) / N.V. Doronina, M.L. Torgonskaya, D.N. Fedorov [et al.] // Applied Biochemistry and Microbiology. 2015. V. 51. No. 2. P. 125-134.
9. A microbial biosensor system for dihalomethanes / T. Henrysson, B. Mattiasson [et al.] // Biodegradation. 1993. V. 4. P. 101-105.
10. Аэробные метилобактерии как основа биосенсора для детекции дихлорметана / Ю.В. Плеханова, Ю.Е. Фирсова, Н.В. Доронина [и др.] // Прикл. биохим. микробиол. 2013. Т. 49. № 2. С. 203-208.
11. Титце А. Препаративная органическая химия / М.: Мир, 1999.
704 с.
12. Кузнецова, Т.А. Конструирование рекомбинантной плазмиды для экспрессии гена метанолдегидрогеназы / Т.А. Кузнецова, Ю.А. Троценко // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов: Всероссийский симпозиум с международным участием. Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова. Биологический факультет. 24-27 декабря 2014 г.: Материалы. - М.: Макс Пресс, 2014. - c.137.
13. Кузнецова Т.А., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Эффективность биоэлектрокаталитического окисления метанола клетками метилотрофных бактерий в присутствии медиаторов электронного транспорта // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2013. Вып. 1. C. 222-232.
14. Свойства модифицированных амперометрических биосенсоров на основе метанолдегидрогеназы и клеток Methylobacterium nodulans / Т. А. Кузнецова, А.П. Бесчастный [и др.] // Прикл. биохим. микробиол. 2013. Т. 49. № 6. С. 613-618.
Кузнецова Татьяна Александровна, канд. хим. наук, доц., tatulyakuz@,mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Туленинова Мария Александровна, магистрант, tuleninova 71 @yandex. ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет
INVESTIGATION OF MEDIATOR BEHAVIOR OF 2,5-DIBROMO-P-BENZOQUINONE IN AMPEROMETRIC BIOSENSOR BASED ON THE METHYLOBACTERIA
T.A. Kuznetsova, M.A. Tuleninova
Mediator properties of p-benzoqinone derivative 2,5- dibromo-p-benzoquinone have been investigated in the condition of amperometric biosensor based on the recombinant strain Methylobacterium extorquens pCM160 as biocatalyst. The possibility of usage 2,5 dibromo-p-benzoquinone as electron transport mediator has been shown by cyclic voltamperometry. It was shown that 2,5-dibromo-p-benzoquinone have not been able to significantly change the substrate specify of the biocatalyst. The main characteristics of the developed biosensor have been estimated.
Key words: p-benzoquinone, bioelectrocatalysis, methylobacteria, mediators of electron transport, biosensor.
Kuznetsova Tatiana Alexandrovna, сandidate of chemical sciences, associate professor, tatulyakuz@,mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Tuleninova Maria Alexandrovna, master student, [email protected], Russia, Tula, Tula State University
