CC BY
46
УДК 543.429.23 + 547-32-304.2 + 547.784.2
ИССЛЕДОВАНИЕ КИСЛОТНО-ОСНОВНОГО И ТАУТОМЕРНОГО РАВНОВЕСИЙ В РАСТВОРЕ L-ГИСТИДИНА МЕТОДОМ ЯМР СПЕКТРОСКОПИИ
© 2006 г. В.А. Волынкин, С.Н. Болотин, В. Т. Панюшкин
Aqueous solutions of L-histidine have been analysed by 1H NMR spectroscopy over the pH range 2-10 with increments of 0.5 pH unit. As a result, this data has been used to determine all possible states of protonation of histidine, i.e. HbL2+, H2L+, HL, and L-. Besides the NMR lineshape analysis have been used for evaluation of the ratio of imidazole Nn- or NT - protonated tautomeric forms of HL and L-.
Гистидин является одной из наиболее распространенных в природе аминокислот. В отличие от их большинства гистидин не только входит в качестве остатка в состав пептидов и белков, но и в значительных количествах присутствует в организмах животных в индивидуальном виде и в составе комплексов с различными металлами. Взаимодействие гистидина с металлами активно изучалось в последние несколько десятилетий [1-4]. Были установлены закономерности, определяющие связь способа координации аминокислоты с формой его существования в растворе.
В отличие от большинства аминокислот гистидин содержит донорную группу с уникальным значением pK депротонизации («6), т. е. при физиологических значениях pH может быть как донором, так и акцептором протона. Наличие в имидазольном кольце двух атомов азота различного типа (пирроло-подобный и пиридино-подобный), потенциально способных принимать участие в связи с ионом металла, существенно влияет на характер его взаимодействия с ионами металлов.
Данные работ [4, 5] указывают на различия в основности атомов азота имидазольного кольца гисти-дина и его производных и свидетельствуют о наличии в растворе кислотно-основного и таутомерного равновесий.
Несмотря на достаточно большое количество исследований по гистидину, его производным и комплексам, данные о таутомерных и кислотно-основных равновесиях во многом являются неполными или противоречивыми. Поэтому нами было проведено определение термодинамических характеристик (констант равновесия) кислотно-основного и таутомерного равновесий в растворе L-гистидина методом ЯМР 1H.
Экспериментальная часть
Были измерены спектры ЯМР 1Н 0,2 М водных растворов L-гистидина (Merck) при рН 2,15 - 9,85. Спектры снимали в тяжелой воде (содержание D2O не менее 99,8 %) на спектрометре Tesla BS 587A (80 МГц) с использованием в качестве внутреннего стандарта трет-бутанола (ч.д.а). рН варьировали добавлением 1 М DCl (х.ч.) и 1 М NaOD (х.ч.). Для измерения рН использовали иономер универсальный серии ЭВ-74, откалиброванный по двум буферным растворам
(точность ±0,05 ед. рН). Для перевода значений рН в рБ использовали формулу рБ=рИ + 0,4 [6].
Результаты и обсуждение
Первоначально полученные зависимости химических сдвигов от значения рИ (рБ) для протонов а-СН-группы и протонов имидазольного кольца (И2, И5) были обработаны с учетом равновесия:
К\ К2 К3
Н3 Ь2+ » И 2Ь+ » ИЬ » Г методом аддитивной модели для наблюдаемых химических сдвигов [7]. Полученные значения рК\, рК2, рК3 и соответствующие литературные данные представлены в таблице, из которой видно их соответствие.
Значения констант депротонирования Ь-гистидина
Данная работа [1] [4] [8] [9]
pKi 1,64 1,54 1,69 1,80 1,78
pK2 6,15 6,02 6,02 6,14 6,03
PK3 9,02 9,06 9,06 9,20 9,04
Однако при депротонировании имидазольного кольца протон может отрываться как в п-, так и в т-положениях (формы ИЬ и ИЬ' соответственно), причем в случае его отрыва в п -положении возможно образование водородной связи между НИ3+ и Нп, повышающее устойчивость состояния ИЬ по сравнению с ИЬ'. Наличие более сложной схемы равновесий подтверждается и характером изменения спектра ЯМР при повышении рН: при рИ < 5 спектр имеет вид, представленный на рис. \а, а с увеличением рИ и соответственно с возрастанием доли формы ИЬ в спектре появляются дополнительные сигналы - триплет а-протонов расщепляется на два дублета, а также появляется второй дублет р-протонов с ^р =7,02 Гц (рис. \б). Это является следствием потери эквивалентности протонов р-СИ2-группы из-за отсутствия внутреннего вращения боковой цепи аминокислоты при наличии внутримолекулярной водородной связи Нишн-И—N и подтверждает существование представленной на рис. 2 схемы равновесий, предложенной в [\0] по данным электронной спектроскопии.
4,2 4 3,8 3,6 3,4 3,2 3 2,8
8, м.
б
4,1
3,9
3,7
3,5
3,3
3,1
2,9 8, м.д.
Рис. 1. ЯМР спектр L-гистидина в водном растворе (D2O) при рН 3,95 (a), рН 7,40 (б)
Спектральные данные были обработаны с учетом схемы равновесий с использованием метода анализа полной формы линии спектра ЯМР [11], значения констант равновесия: pK2' 5,92; pK2'' 6,32; pKз' 8,85; pKз'' 9,19; pKT 0,40. Распределение мольных долей
различных форм аминокислоты в зависимости от рН приведено на рис. з и указывает на присутствие в растворе в области физиологических значений рН (5-7) нейтральной формы L-гистидина в виде двух тауто-мерных форм с преобладанием формы
ß
а
H,N
H,L+
HN. + .NH
H ^-H + K,'
N^ -NH
N
H +
N4/NH
HN ^N
HN^N
Рис. 2. Схема равновесий в водном растворе L-гистидина Литература
1. Szabo-Planka T. et al. // Polyhedron. 2000. Vol. 19. № 9. P. 1123.
2. Materazzi S., Curini R., D'Ascenzo G. // Thermochim. Acta. 1996. Vol. 275. № 1. P. 93.
3. Леглер Е.В., Казбанов В.И., Казаченко А.С. // ЖНХ. 2002. Т. 47. № 1. C. 158.
Рис. 3. Зависимость мольных долей форм L-гистидина от рН
4. Remelli M., Munerato C., Pulidori F. // J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1994. P. 2049.
5. Mesu J.G. et al. // Vib. Spectrosc. 2005. Vol. 39. P. 114.
6. Perrin D.D., Dempsey D. Buffers for pH and metal ion control. London, 1979.
7. Маров И.Н., Костромина Н.А ЭПР и ЯМР в химии координационных соединений. М., 1979.
8. Boschcov P. et al. // Bioorg. Chem., 1983. Vol. 12. № 1. P. 34.
9. Tanokura M. // Biochim. Biophys. Acta. 1983. Vol. 742. № 4. P. 576.
10. Stephenson D.S., Binsch G.// J. Magn. Res. 1978. Vol. 32. № 1. P.145.
11. Панюшкин В.Т., Волынкин В.А. // ЖСХ. 2000. Т. 43. № 3. C. 660.
Кубанский государственный университет
14 октября 2005 г
о
о
H
о
о
о
K
T
о
о
L
