CC BY
86
Низкомолекулярные соединения
УДК 581.19+547.992+543.429
ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗОМЕРИЗАЦИИ КСАНТОГУМОЛА В ИЗОКСАНТОГУМОЛ
© В.И. Луцкий1, Б.Н. Баженов2, К.В. Молокова1, Б.Л. Финкельштейн2, А.Н. Чеснокова1
1 Иркутский государственный технический университет, ул. Лермонтова,
83, Иркутск, 664074 (Россия), e-mail: [email protected]
2Иркутский государственный университет, ул. Лермонтова, 126, Иркутск,
664033 (Россия)
Ксантогумол - биологически высокоактивный пренилированный халкон хмеля, являющегося незаменимым сырьем для производства пива. В процессе производства пива происходит изомеризация ксантогумола во флаванон изо-ксантогумол. В данной работе изучена динамика изомеризации ксантогумола в изоксантогумол в модельных условиях. Установлена зависимость протекания данной реакции от кислотности среды и времени процесса. Исходный и конечный продукты изомеризации идентифицированы спектральными методами.
Ключевые слова: Humulus lupulus L., пренилированные халконы и флавононы хмеля, ОФ ВЭЖХ, УФ-, ИК-, МС-, 'Н и 13С ЯМР-спектроскопия.
Введение
Хмель обыкновенный (Humulus lupulus L.) семейства Cannabaceae - широко распространенное и чрезвычайно полезное растение, которое с давних пор используется человеком. Он культивируется практически во всех странах умеренного климата, прежде всего, как сырье для производства пива. Именно различные сорта хмеля придают пиву своеобразный аромат и вкус, а также способствуют его консервации. Помимо пивоварения, хмель используется в хлебопекарной промышленности, в научной и народной медицине.
Для медицинских целей используют соцветия (шишки) хмеля, которые обладают разносторонними фармакологическими свойствами: успокаивающими, обезболивающими, снотворными, противовоспалительными. Основными веществами, обусловливающими биологическую активность шишек хмеля, являются горькие и фенольные соединения, а также эфирное масло [1].
Среди фенолов хмеля присутствуют такие уникальные соединения, как пренилированные флаво-ноиды халконового и флаванонового типов.
Пренилфлавоноидам в прошлом не уделялось достаточного внимания ни с точки зрения хмелеводства, ни с точки зрения использования их в процессе производства пива. И только на рубеже этого столетия ученые начали активное изучение данных веществ, в связи с выявлением их высокой биологической активности.
Пренилированные флавоноиды хмеля обладают чрезвычайно широким спектром биологической активности. Они проявляют антиканцерогенные, фитоэстрагенные, антиоксидантные, антимикробные и противовирусные свойства [2]. В частности, ксантогумол в настоящее время изучается как потенциальное противораковое средство [3]. Доказано, что ксантогумол в 200 раз активнее против рака груди, чем резверат-рол, содержащийся в красном вине [4].
6- и 8-пренилнарингенин проявляют фитоэстрогенную активность. Фитоэстрогены значительно снижают риск возникновения, например, рака молочной железы, матки, толстой кишки и простаты [4].
* Автор, с которым следует вести переписку.
Показан достаточно широкий спектр противовирусного действия пренилфлавоноидов хмеля. В культуре клеток обогащенные ксантогумолом экстракты хмеля умеренно угнетают репродукцию вируса диареи крупного рогатого скота, который служит суррогатной моделью вируса гепатита С человека HCV, вируса простого герпеса типа 2 HSV-2 и риновируса [4].
Установлена также антиоксидантная активность пренилфлавоноидов, их действие проявляется в нейтрализации активных радикалов кислорода и торможении процессов свободно-радикального окисления, лежащих в основе развития сердечно-сосудистых заболеваний [5].
К настоящему времени из хмеля выделено 12 пренилхалконов, из которых наибольшую ценность для пивоварения представляет ксантогумол. Его содержание в хмеле составляет S0-90% от суммарной массы пренилхалконов [4].
Stevens с соавторами [б] показали, что в ходе кипячения сусла с хмелем в процессе пивоварения большая часть ксантогумола изомеризуется во флавонон изоксантогумол. Кроме того, методом ВЭЖХ-масс-спектрометрии (LC/MS-MS) авторы исследовали потери пренилфлавоноидов на этапах производства пива. Показано, что они связаны с неполной экстракцией из хмеля в сусло (13-25%), адсорбцией на нерастворимых белках солода (1S-26%) и адсорбцией на дрожжевых клетках (11-32%) во время брожения. В конце процесса пивоварения общий выход пренилфлавоноидов, представленных в основном в виде изо-ксантогумола, - 22-30% от содержания данных компонентов в хмеле.
Изоксантогумол имеет значительно лучшую растворимость в сусле, чем ксантогумол, но обладает менее выраженной биологической активностью [7]. Содержание ксантогумола в коммерческом пиве составляет менее 0,1 мг/л, изоксантогумола - до 3,44 мг/л [S, 9].
Ксантогумол, изоксантогумол и S-пренилнарингенин -, как предполагается, - основные соединения, определяющие положительное влияние пива на здоровье человека при умеренном его потреблении. В связи с этим в настоящее время в мировой практике пивоварения актуальной задачей является повышение содержания пренилированных халконов в пиве, разработка технологий производства пива и хмелевых экстрактов, обогащенных пренилированными флавоноидами.
Работ, посвященных изучению кинетики процесса изомеризации ксантогумола в изоксантогумол, явно недостаточно, хотя это один из путей целенаправленного изменения содержания одного из компонентов в сусле и пиве.
Цель работы - изучение методом ВЭЖХ изомеризации ксантогумола в изоксантогумол в зависимости от величины рИ и времени процесса. Для выполнения поставленной цели следовало получить заведомые образцы исходного и конечного соединений - ксантогумола и изоксантогумола и провести их идентификацию.
Экспериментальная часть
Аналитическую ВЭЖХ проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе {^илихром 1» с многоволновым УФ-детектором, укомплектованным аналитической колонкой 2*б2 мм с ОФ «Nucleosil 5C1S». Элюирование проводилось системой ацетонитрил : вода : ортофосфорная кислота = б0 : 40 :
0,1% об в изократическом режиме. Скорость подачи элюента составляла 100 мкл/мин.
Количественное соотношение ксантогумола и изоксантогумола на хроматограммах рассчитывали по площадям соответствующих пиков без использования корректирующих коэффициентов.
Препаративную ВЭЖХ проводили на сконструированном на основе жидкостного хроматографа «Chrom-б» приборе с рефрактометрическим детектором, колонка 10*250 мм с ОФ «Силасорб 13C1S». Колонку элюировали системой ацетон - вода (55 : 45) в изократическом режиме.
Спектроскопия. УФ-спектр ксантогумола, растворенного в этиловом спирте, записывали на приборе СФ-2б в кварцевой кювете; толщина поглощающего слоя - 1 см.; УФ-спектр изоксантогумола - на жидкостном хроматографе «Mилихром»; ИК-спектр ксантогумола записан на лазерном приборе IFS25 в таблетке с КВг; масс-спектр высокого разрешения получен на приборе JEOL SX 102A с двойной фокусировкой обращенной геометрии; ЯMP-спектры записывали в дейтерохлороформе на спектрометре «Bruker-250» (250 Mr ц) оснащенном компьютером с программным обеспечением XWIN-NMR.
Получение ксантогумола. Гранулированный хмель сорта «Maгнум» подвергли последовательной экстракции растворителями с увеличивающейся полярностью: гексаном, этилацетатом, а затем метанолом. Анализ ТСХ на присутствие ксантогумола дал положительный результат для этилацетатной фракции и отрицательный для гексановой и метанольной.
Этилацетатный экстракт подвергли многократному разделению с помощью колоночной хроматографии на силикагеле. Элюирование проводилось системой растворителей гексан : ацетон = S0 : 20%об. Окончательная очистка ксантогумола произведена препаративной ТСХ («Сорбфил ПТСХ-АФ-А» (Россия), элюирующий растворитель - хлороформ со следами спирта). Полосу сорбента, содержащую ксантогумол, экстрагировали хлороформом, растворитель упарили под вакуумом. Полученное вещество имеет следующие характеристики:
Ксантогумол: С21И22О5; MS-TOF, m/z: [MH]+ 355,1549 (рассчитано для С21И22О5 - 355,1545); УФ-спектр: Imax =370 нм, плечо 300 нм; ИК-спектр (KBr; см-1): 3417,2 (-ОИ); 2971,б; 2930,9; 2S76,0 (-СИ3; -OCH3); 1б22,б (-CO а, ß-ненасыщенного кетона); 1б05,9 и 1557,1 (-C6H5).
1И ЯMP (250Mrц, CDCl3, м.д., TMC-0; J/Гц): 14,6s (1И, с, OH-2'), 7,7S (1И, с, И-ß), 7,77 (1И, с, И-а), 7,52 (2Н, д, J = 8,07, Н-2,6), б,87 (2И, д, J = 8,07, Н-3,5), б,3 (1Н, с, OH-4). 5,9б (1И, с, Н5'), 5,0 (с, OH-4'), 3,91 (3Н, с, OCH3-6'), 3,41 (2Н, д, J = 7,01, И-1''а, 1''ß), 5,31 (1И, уш.т, J = 7,61, H-2''), 1,78 (3Н, с, H-4''), 1,84 (3Н, с, И-5'').
ЯMP 13С: 192,94 (С=О), 165,23 (С-2'), 1б1,93(С- 4'), 161,28 (С-б'),157,б4 (С-4), 142,17 (C-ß), 135,92 (С-3''), 130,3б (С-2,б), 128,64 (С-1), 125,59 (С-а), 121,89 (С-2''), 115,99 (С-3б5), 106,42 (С-3'), 106,29 (С-1’), 91,28 (С-5'), 55,88 (OCH3-6'), 25,91 (С-5''), 21,70 (С-1''), 18,00 (С-4'').
Приготовление буферных растворов. 0,05 M раствор дигидрофосфата калия доводили до нужного значения рИ (2,0; 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 8,0; 9,0) добавлением ортофосфорной кислоты или раствора гидроксида калия.
Получение изоксантогумола. 1 мл раствора ксантогумола в ацетоне (концентрация 10 мг/мл) кипятили в 5 мл буферного раствора с pH = S, в течение 40 мин. Полученную фракцию упарили и перераство-рили в метаноле. Очистку фракции проводили методом препаративной ВЭЖХ в системе растворителей -ацетон : вода : ортофосфорная кислота = 50 : 50 : 0,1%об., а затем препаративной ТСХ («Сорбфил» (размер 145*95 мм), система растворителей - хлороформ : метанол = 10 : 0,2%об. После десорбции изоксантогумо-ла с сорбента ацетоном и удаления растворителя, для выделенного образца (2 мг) были получены УФ- и 1И ЯMP-спектры.
Изоксантогумол: С21Н22О5; УФ-спектр: Xmax = 290 нм.
1И ЯMP (250MTц, CDCl3, м.д., TMC-0; J/Гц): 7,34 (2Н, д, Н-2',6'), 6,87 (2Н, д, И-3',5'), 6,09 (1Н, с, И-б), 5,35 (1Н, дд, И-2), 5,25 (1И, м, Н-2''), 3,88 (3И, с, ОСН3-5), 3,38 (1И, д, И-1''), 2,95 (1Н, дд, И-3а), 2,55 (1Н, дд, И-3е), 1,72 (3И, с, СН3 -4''), 1,70 (3И, с, СН3 -5'').
Спектральные характеристики ксантогумола и изоксантогумола соответствовали литературным данным [7].
Изомеризация ксантогумола в изоксантогумол в модельных растворах. По 1 мл раствора ксантогу-мола в ацетоне (концентрация 10 мг/л) вносили в 5 мл буферного раствора с различными значениями рИ (2,0; 4,0; 5,0; 5,5; б,0; S,0; 9,0). Затем в течение 2 ч проводилось кипячение, при котором через каждые 20 мин, отсчитывая от его начала, отбиралась проба. Изменение состава раствора прослеживали методом аналитической ВЭЖХ.
Обсуждение результатов
Ксантогумол выделили из гранулированного хмеля сорта «Maгнум» (Германия), широко применяющегося на многих пивоварнях России. Образцы хмеля для исследования переданы из филиала ООО «Объединенная пивоварня Хейнекен» «Пивоварни Хейнекен Байкал» - одного из крупнейших производителей пива в Восточной Сибири.
Получение изоксантогумола провели в условиях разработанных нами в ходе изучения кинетики процесса изомеризации ксантогумола в изоксантогумол в зависимости от величины рИ и времени процесса. Оказалось, что максимальный выход изоксантогумола наблюдался при кипячении в слабощелочной среде (рИ = S,0) уже через 40 мин.
Следует обратить внимание на то, что ксантогумол является халконом, а в процессе изомеризации он превращается во флаванонон (рис. 1). Вследствие прерывания цепи сопряжения между бензольными кольцами молекулы изоксантогумола в результате изомеризации, основной максимум его поглощения в УФ-области лежит в более коротковолновой части спектра (Х^ = 290 нм), чем у ксантогумола (Х^ = 370 нм) (рис. 2). Поэтому при изучении процесса изомеризации методом ВЭЖХ удобно применять УФ-детектор.
НО^^Д^ОМе
.JL A JC' “ Т. в J]
р у у р 1 6
4'Ч.^2'' он о OCH3O
5''
ксантогумол изоксантогумол
Рис. 1. Схема изомеризации ксантогумола в изоксантогумол
Для подбора условий изомеризации и максимального выхода изоксантогумола из ксантогумола мы изменяли величины рН и продолжительность процесса.
В пивоварении время кипячения сусла с хмелем при рН 5,0-5,5 обычно составляет менее двух часов [10]. Поэтому температуру процесса мы выбрали постоянную (температуру кипения смеси), максимальное время кипячения - 2 часа, величины рН реакционной среды изменяли от сильнокислой (рН 2,0) до щелочной (рН 9,0).
Для проведения изомеризации ксантогумол, предварительно растворенный в ацетоне, кипятили в течение двух часов в буферных растворах при различных значениях рН. Изменение состава раствора прослеживали методом аналитической ВЭЖХ, отбирая пробы каждые 20 мин.
Были получены ВЭЖХ хроматограммы, на которых прослеживалось изменение состава реакционной смеси при различных значениях рН. Графики полученных зависимостей представлены на рисунке 3.
Из полученных данных можно сделать вывод о том, что в слабощелочной среде, при значении рН 8,0 и 9,0, концентрация ксантогумола резко убывает в первые 20 мин при одновременном возрастании концентрации изоксантогумола. В следующие 20 мин закономерность та же, но скорость реакции значительно замедляется, вероятно, при этом значении рН и времени процесса действительно идет изомеризация ксантогумола в изоксантогумол в наших модельных условиях.
При всех других значениях рН такой четкой закономерности не наблюдается. Так, в кислой среде (рН 2,0; 4,0) при значительной убыли концентрации ксантогумола концентрация изоксантогумола остается низкой на протяжении 2 ч, что может свидетельствовать о том, что ксантогумол превращается в какое-то иное соединение или разлагается. Это требует дальнейшего исследования.
При значении рН, близком к рН сусла (рН 5,5) в нашем эксперименте, выход изоксантогумола один из самых низких. Эти данные плохо согласуются с работой Stevens с соавт. [6], согласно которой в процессе кипячения сусла с хмелем большая часть ксантогумола изомеризуется в изоксантогумол.
В нашем случае концентрация ксантогумола резко убывает за первые 20 мин кипячения, реально не увеличивая выход изоксантогумола, т.е. ксантогумол практически не изомеризуется в изоксантогумол при рН 5,5 в модельных условиях. Полученные результаты не случайны, так как при рН, близком к рН сусла (5,0; 6,0), кривые изменения концентрации ксантогумола аналогичны таковым при рН 5,5, хотя и несколько отличаются по крутизне.
Следует оговориться, что в данной работе процесс изомеризации моделировался лишь по времени процесса и величине рН, не затрагивая состава среды. Компонентный состав реального сусла резко отличается от модельного - в первом присутствуют неорганические ионы (кальций, магний, калий и т.д.) и органические соединения - горькие вещества, фенолы, белки, редуцирующие сахара и другие вещества, эстра-гированные из солода и хмеля. Именно эта многокомпонентность состава сусла, по-видимому, играет определяющую роль в процессе изомеризации горьких кислот и пренилхалконов.
длина волны,нм
Рис. 2. УФ-спектры ксантогумола - ■ и изоксантогумола - ▲
рН 4
время, мин.
время, мин
рН 5
время, мин
рН 5.5
время, мин
время, мин
время, мин
Рис. 3. Изменение концентрации ксантогумола (■) и изоксантогумола (А) в зависимости от величины рН и времени кипячения
рН 9
время, мин
Авторы благодарят доцента ИрГТУ И.А. Ушакова за запись ЯМР спектров изучаемых соединений и студентов ИГУ О.В. Алешкову и О.В. Кустову за участие в эксперименте по ВЭЖХ.
Список литературы
1. Зузук Б.М., Куцик Р.В. Хмель вьющийся обыкновенный: аналитический обзор // Провизор. 2004. №14. С. 18-19.
2. Kammhuber К., Zeidler С., Seigner E. Stand der Erkenntnisse zum Hopfeninhaltsstoff Xanthohumol // Brauwelt. 1998. V. 36. Pp. 1633.
3. Miranda C.L., Stevens J.F., Helmrich A. Cytotoxic and antiproliferative effects of prenylated chalcones in human cancer cell lines and in cultured ret hepatocytes // Food Chem. Toxicol. 1999. №37(9). Pp. 271-285.
4. Stevens J.F., Miranda C.L., Buhler D.R., Deinzer МХ. Chemistry and biology of hop flavonoids // Journal Am. Soc. Brew. Chem. 1998. №56(4). Pp. 136-145.
5. Miranda C.L. Antioxidant and prooxidant action of prenylated and nonprenylated chalcones and flavanones in vitro // J. Agric. Food Chem. 2000. №48. Pp. 3876-3884.
6. Stevens J.F., Taylor A.W., Clawson J.E., Deinzer M.L. Fate of Xanthohumol and Related Prenylflavonoids from
Hops to Beer // J.Agric. Food Chem. 1999. V. 47. Pp. 2421-2428.
7. Gerhauser C., Alt A., Heiss E., Gamal-Eldeen A. et al. Cancer Chemopreventive Activity of Xanthohumol, a Natural Product Derived from Hop // Mol. Cancer Ther. 2002. V. 1. Pp. 959-969.
8. Stevens J.F., Page J. E. Xanthohumol and related prenylflavanoids from hops and beer: to your good health! // Phytochemistry. 2004. V. 65. Pp. 1317-1330.
9. Gerhauser C. Beer constituents as potential cancer chemopreventive agents. Eur. J. Cancer. 2005. V. 41. Pp. 1941-1954.
10. Кунце В., Мит Г. Технология солода и пива: пер. с нем. СПб., 2001. 912 с.
Поступило в редакцию 12 ноября 2010 г.
После переработки 8 февраля 2011 г.
