CC BY
214
Зыонг В.Х.1, Тхам Т.Т.Н.2, Нгуен В.К.3
'Аспирант, Тхаингуенский университет, Тхаингуен, Вьетнам; 2кандидат, Биотехническая академия, Ханой, Вьетнам; 3кандидат, доцент, Биотехническая академия, Ханой, Вьетнам
ИССЛЕДОВАНИЕ ИСКУССТВЕННОГО ВОСПРОИЗВОДСТВА АФРИКАНСКОГО СОМА (CLARIAS GARIEPINUS) ФОРМИРОВАНИЕ ГОЛОГО ЭМБРИОНА ДЛЯ ДНК-МИКРОУКОЛА
Aннотация
Искусственное воспроизводство не только имеет большое значение в получении мальков на рыбозаводах, но и в лабораторных условиях. В этой работе мы проводим опыты искусственного оплодотворения африканского сома, используя стимуляторы половых продуктов LRH-A и гипофиза сазана. Коэффициент икрометания рыб составляет 100%, коэффициент оплодотворенных икринок и вылупленных личинок соответственно составляют 87,3% и 65,1%. Оплодотворенные икринки обладают клейкостью за счет хориона. Для подготовки к ДНК-микроуколу убираем хорион с помощью трипсина, оптимальная концентрация которого составляет 0,05% в течение 1-ой минуты. Коэффициент вылупления икринок, очищаемых от хориона с помощью энзима является 17,5%.
Ключевые слова: Африканский сом, голый эмбрион, искусственное оплодотворение, ДНК-микроукол.
Keywords: African catfish, naked embryo, artifition reproduction, DNA-microinjection Введение
Исследование искусственного оплодотворения некоторых популярных видов рыб в рыбозаводах были проведены давно. Африканский сом является новым объектом таких исследований. В отличии от других видов рыб сом обитает в грунте , в водохранилищах не созревает. Поэтому для получения половых продуктов стимулируют производителей. Для получения голого эмбриона, являющегося материалом трансформации генов, снимают оболочку хорион с помощью трипсина.
Материал и методы Материал
Производители (Clarias gariepinus) , выращиваемые в Институте исследований рыб и аквакультуры 1
Стимулятор половых желез LRH-A (Luteotropin Releasing Hormone Analog), DOM (domperidone) Китая.
Мозг сазана (Государственная компания сервиса и аквакультуры).
Методы исследований
Определение пола сома и выбор половозрелых особей.
Самцы и самки легко различимы по внешним признакам: У самцов конец семяпровода видоизменен в виде острой колючки, которая называется половой колючкой. У самок половое отверстие округлое.
Половозрелый самец имеет хорошо выраженную и выпученную наружу половую колючку. Половозрелая самка имеет большое мягкое брюшко, наружная часть полового отверстия чуть жестче и при легком отцеживании по брюшку течет икра. Производители берутся в возрасте с 8-12 месяцев. Стимулирование половых продуктов сома.
Стимулятором является гипофиз сазана или LRH-A вместе с DOM. Доза стимулятора зависит от условия сезона и температуры воды. Количество гипофиза для стимулирования самок составляет 12мг/кг рыбы, для самцов равна одной третьи количества для самок. Доза стимулятора для самок 30цг LRH-A и 3-5мг DOM/lKr массы рыбы. Для самцов 5цг LRH-A и 5мг DOM71^ массы рыбы.
Для получения потомства клариевых сомов в искусственных условиях самкам применяют двукратную инъекцию гипофиза: предварительную - в количестве 1/3 общей дозы гипофиза и через 4-6 часов разрешающую - 2/3 общей дозы. Для самцов - однократную инъекцию. Впрыскивать можно в одно из следующих мест : в основание грудных плавников, в брюшко и в туловищную мускулатуру. Туловищная мускулатура является наиболее безопасным и легким местом для инъекции. После 8-15 часов с момента впрыскивания производители становятся половозрелыми. Искусственное оплодотворение
Вылавливаемая самка держится в хлопковом полотенце, затем икры отцеживаются из брюшка до тех пор, пока вся икры не вымечет в чистую посуду. Из самца невозможно получить молоки, их можно получить только путем отцеживания, а вскрывания рыбы . Полученные молоки и икру помещают в сухую посуду, так как в воде спермии и икры активизируются и сохраняют подвижность в течение 1-2мин. При оплодотворении добавляется вода (300мл/ликры), перемешиваем смесь спермиев и икры в течение 3 - 5 минут.
Получение голого эмбриона.
Оплодотворенную икру после обесклеивания помещаются а чашку Петри, содержащую раствор holtfreter и раствор трипсина с концентрацией 0,01%; 0,05%; 0,1% (w/v) в течение 1-2 мн. Это процесс отмывания оболочки хориона.
Обсуждение результатов Выбор производителей
Выбор производителей по морфологическим признакам. Чтобы увеличить вероятность выбора вынимают из самки несколько икринок с помощью специального щупа или шприца, с прикрепленной к ней мягкой пластиковой трубой. Взятые икринки выкладываются на чашку Петри, на них капают EFA (ethanol:formalin:acid acetic по соотношению 6:3:1). Через несколько минут икра становится прозрачной, а внутренний желток белого цвета. Хорошая половозрелая самка должна иметь крупные, отделяющиеся друг от друга икринки, кровеносные капилляры которых очень маленькие или их совсем нет. Особенно отмечается то, что более 60% икринок являются эксцентрическими. Искусственное оплодотворение
Производители содержатся в отдельных бассейнах в соотношении 3-5 самок на 1
самца.
Результаты оплодотворения вписываются в таблицу 1
Показатель Результат
Стимулятор Гипофиз сазана LRH-A и DOM
Доза для самок 10г/кг массы рыбы 40дг LRH-A + 4мЮОМ/кг рыб
Доза для самцов 3мг/кг массы рыбы 5цг LRH-A + 5мг DOM/кг массы рыбы
Средняя масса рыб 359г 321,3г
Коэффициент размножения 100% 100%
Время эффекта 15 часов 12 часов
Плодовитость 106.102 икринок/кг 108.782 икры/кг рыб
Коэффициент оплодотворения 87,3% 72,0%
Таблица 1: Результаты искусственного оплодотворения африканского сома.
В зависимости от определенного вида рыб выбирают соответственные с ними стимуляторы. В некоторых лабораториях других стран используются Ovaprim или gonadotropin для стимуляции сомов и получаются положительные результаты. Во Вьетнаме чаще всего применяют гипофиз сазана или LRH-A и DOM. Гипофизом сазана также пользуется для искусственного оплодотворения других видов популярных во Вьетнаме рыб, так как он более безопасный и дает положительные результаты. Однако трудно определить качество гипофиза и его дозу применения. Использование LRH-A и DOM при стимуляции сомов дает высокий и стабильный коэффициент размножения. Также влияет на количество полученных половых продуктов место инъекции. Инъекция в основание грудных плавников дает высокую эффективность, то есть наибольший быстрый эффект, но легко инъецируется в сердце рыбы, что проводит к смерти производителей. Инъекция в туловищные мышцы является более легкой и безопасной. Образование голого эмбриона.
В отличие от других видов рыб оплодотворенная икра сома имеет клейкую оболочку, при помощи которой икра прикрепляется к субстрату. Эта оболочка препятствует ДНК-микроуколу . Отмывают клейкую оболочку с помощью энзима трипсин, протеаза или ручным способом. При применении энзима необходимо определить оптимальную концентрацию энзима, которая не влияет на развитие зародыша. Процесс отмывания хориона проводится с наблюдением под микроскопом. Если в этом процессе наблюдается разложение оболочки хориона, необходимо быстро остановить его и многократно перемывать икру раствором holtfreter. Оптимальная концентрация
составляет 0,05% в растворе holfreter.
Результат отмывания хориона оказывается в таблице 2
Микроукол Сравнение
Отмывавшие от хориона икры Икры с хорионом
Коэффициент вылупления (%) 17,5 28,2 65,1
Отмывание клейкой оболочки ручным способом проводится под микроскопом с помощью клещей и стеклянной иглы. Этот процесс легче рарушает клетки, поэтому качество икринок после снятия оболочки зависит от опытности специалистов. В наших исследованиях 10% отмывавших от хориона икринок остаются ненарушенными. Достоинством ручного способа является то, что икра не подвергается влиянию энзима и имеет более высокую жизнеспособность (89%), отсутствие уродов.
Заключение
Искусственное оплодотворение африканского сома в лабораторных условиях дает следующие результаты: коэффициент размножения 100 % ,коэффициент оплодотворения 87,3%, коэффициент вылупления 65,1%
Отмывание клейкой оболочки с помощью трипсина 0,05% позволяет 17,5%-ам зародышей расти до мальков.
Литература
1. Adebayo O. T. Reproductive performance of African Clariid Catfish (Clarias gariepinus) broodstocks on varying maternal stress // Journal of fisheries International. 2006. V.1. Iss. 1. p. 17-20.
2. Adewumi A.A., Olaleye V.F., Adesulu E.A. Egg and sperm quality of the African catfish, Clarias gariepinus (Burchell) broodstock fed differently heated soybean based diets // Research Journal of Agriculture and Biological Sciences. 2005. V.1. Iss.1. p.17-22.
3. Olaleye VF A review of reproduction and gamete management in the African Catfish Clarias gariepinus // Ife Journal of Science. 2005. V.7. Iss.1. p.63-70.
