CC BY
107
УДК 579.66:547.94
О. В. Ландер (студ.), Н. И. Петухова (к.б.н., доц.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Исследование гидролиза растительных масел в биоэмульсиях
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
O. V. Lander, N. I. Petukhova, V. V. Zorin
Research of hydrolysis of vegetable oils in bioemulsions
Ufa State Petroleum Technical University 1, Kosmonavtov Str.,450062 Ufa, Russia;Phone: (347) 2431935; е-mail: [email protected]
Показана возможность гидролиза растительных масел (оливкового и подсолнечного) в эмульсиях, стабилизированных биомассой микроорганизмов. Найден перспективный биокатализатор для реализации таких процессов.
Ключевые слова: биоконверсия растительного масла; липазы; микроорганизмы.
Растительные масла и продукты их переработки могут служить источником различных практически важных веществ (сурфактантов, ароматизаторов, лекарственных средств, биокатализаторов и др.) с помощью микроорганизмов 1-4.
Практически важным процессом переработки растительных масел является их гидролиз с помощью липолитических ферментов (липаз) 5. Особый интерес представляют процессы получения полиненасыщенных жирных кислот и их моно- и диацилглицеридов, обладающих уникальным биологическим действием 5, а также экологичные процессы производства биодизеля 6.
При использовании растительных масел в процессах биотрансформации, протекающих в водных средах, возникает проблема обеспечения хорошего контакта между ферментами микроорганизмов и гидрофобным субстратом. Одним из эффективных подходов к решению этой проблемы является использование синтетических эмульгаторов 7. Вместе с тем, известно, что многие микроорганизмы способны продуцировать собственные эмульгаторы, связанные с клеточной поверхностью или секретиру-ющиеся в водную среду 8. Биоэмульгаторы, как правило, нетоксичны для ферментов, не загрязняют окружающую среду и могут работать в широком диапазоне рН, температур, солености среды. В последние годы в литературе появляются сведения о возможности осуществ-
The potential of vegetable (olive and sunflower) oils hydrolysis in emulsions stabilized by biomass of microorganisms is shown. The promising biocatalyst for implementation of such processes was found.
Key words: bioconversion of vegetable oil; lipases; microorganisms.
ления биотрансформаций в эмульсиях, стабилизированных биоэмульгаторами 9 10.
В настоящей работе осуществлен поиск биокатализаторов, способных осуществлять гидролиз растительных масел в биоэмульсиях. Объектом исследования служили дрожжи Pichia sp. 87-1 и дрожжеподобные грибы рода Geotrichum spp. 85-1, 85-2 и 85-3 из коллекции кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ, у которых предварительно была выявлена способность расти на оливковом масле.
Было обнаружено, что биомасса исследуемых дрожжей и грибов, выращенная на среде с оливковым маслом, стабилизировала эмульсии вода:органический растворитель (хлороформ). Наиболее высокие индексы эмульгации 8 (60— 70 %) были получены для суспензий клеток грибов Geotrichum spp. 85-1 и 85-2 (рис. 1).
80
60
40
20
7
Дата поступления 08.12.09
1 — Pichia sp. 87-1; 2 — Geotrichum sp. 85-1;
3 — Geotrichum sp. 85-2; 4 — Geotrichum sp. 85-3
Рис. 1. Эмульгирующая способность микроорганиз-
мов, %.
0
1
Реакционные массы, содержащие в качестве органической фазы смесь оливкового масла с гексадеканом (0.3 : 0.7 v/v), и суспензии микроорганизмов (1 : 1), после встряхивания также давали стабильные эмульсии с включенными в них клетками. Исследование гидролиза оливкового масла в этих условиях показало, что все штаммы накапливают олеиновую кислоту в реакционной смеси. При этом в большинстве случаев наиболее активно протекал гидролиз при использовании трехсуточной биомассы микроорганизмов. Только в случае штамма Geotrichum sp. 85-3 наибольшая скорость гидролиза была обнаружена при использовании двухсуточной биомассы. Установлено, что наиболее активным является штамм Geotrichum sp. 85-1, образующий олеиновую кислоту со скоростью 800 мкмоль/мл • ч (рис. 2).
о
О 0 1 2 3 4 5 О Время культивирования, сут
-•- Pichia sp. 87-1 Geotrichum sp. 85-2
Geotrichum sp. 85-3 Geotrichum sp. 85-1
Условия культивирования: среда СР-1, t = 30 оС Условия трансформации: фосфатный буфер (рН 7.5) — 1 мл; смесь оливкового масла с гексадеканом (0.3 : 0.7 об/об) — 1 мл; неотмытая от среды биомасса — 50 мг (сырой вес); t = 37 оС, 2 ч
Рис. 2. Зависимость скорости гидролиза оливкового масла в биоэмульсиях, стабилизированных биомассой микроорганизмов, от возраста биомассы.
При исследовании влияния состава органической фазы (гексадекан-оливковое масло) на процесс гидролиза с помощью этого микроорганизма было обнаружено, что скорость реакции возрастает с увеличением содержания оливкового масла (рис. 3). Более того, было установлено, что с помощью биомассы гриба Geotrichum sp. 85-1 можно эмульгировать и гидролизовать с максимальной скоростью чистое растительное масло без внесения дополнительных реагентов.
Установлено, что в выбранных условиях липаза Geotrichum sp. 85-1 способна
Содержание масла в органической фазе, %
Условия культивирования: среда СР-1, t = 30 оС. Условия трансформации: фосфатный буфер рН = 8.0—1 мл; смесь оливкового масла с гексадеканом — 1 мл; неотмытая от среды биомасса — 50 мг (сырой вес); t = 37 оС, 2 ч.
Рис. 3. Зависимость скорости гидролиза оливкового масла в присутствии биомассы Geotrichum sp. 85-1 от состава органической фазы
гидролизовать подсолнечное масло, содержащее 64% линоленовой кислоты, практически с той же скоростью, что и оливковое масло, состоящее на 72% из олеиновой кислоты, что свидетельствует о нестрогой субстратной специфичности этого биокатализатора в отношении жирнокислотного состава липидов.
Материалы и методы
Микроорганизмы выращивали на среде СР-1 (%): оливковое масло — 1; дрожжевой экстракт - 0.3; KH2PO4 - 0.1; Na2HPO4 • 12H2O -0.1; MgSO4 • 7H2O - 0.05; (NH4)2SO4 - 0.1; агар-агар - 1.8; при температуре 30 оС в течение 1-3 сут (в зависимости от условий эксперимента).
Выращенную биомассу собирали с поверхности среды, суспендировали в 0.2 М фосфатного буфера (pH 7.5) из расчета 50 мг биомассы на 1 мл буфера.
В пробирку с 1 мл полученной суспензии добавляли 1 мл органической фазы (хлороформа или смеси растительного масла с гекса-деканом) и резкими движениями встряхивали для образования эмульсии.
Индекс эмульгации Е24 оценивали через 24 ч как отношение высоты эмульсионного слоя к общей высоте жидкости в пробирке 8.
Трансформацию растительного масла осуществляли при инкубировании полученных
эмульсий при 37 оС в течение 2 ч. Реакцию останавливали добавлением 2 мл смеси этанол : ацетон 1:1 (v/v). Продукты гидролиза (в основном олеиновую кислоту) оттитровыва-ли 0.05N раствором NaOH в присутствии 0.1% раствора тимолфталеина. В качестве контрольного варианта использовали реакционную смесь, в которой реакцию останавливали сразу же после эмульгирования. Скорость реакции определяли в микромолях олеиновой кислоты, освобождающейся за 1 ч в процессе гидролиза субстрата.
Литература
1. Shimizu S, Kawashima H, Akimoto K, Shinmen Y, Yamada H. // Appl Microbiol Biotechnol.-1989.- V. 32.- Р. 1.
2. Krings U., Berger R. G. //Appl. Microbiol Biotechnol.- 1998.- V. 49.- Р. 1.
3. Kitamoto D., Isoda H., Nakamura T. // J. Biosience and Bioengineering.- 2002.- V. 94, № 3.- Р. 187.
4. Stransky K., Zarevucka M., Kejik., Wimmer Z., Mackova M., Demnerova K. // Biochemical Engineering Journal.- 2007.- V. 34.- Р. 209.
5. Kojima Yu., Sakuradani E., Shimizu S. // J. Bioscience Bioingeneering.- 2006.- V. 101.-Р. 496.
6. Akoh C. C., Chang S-W., Lee G-C., Shaw J-F. / /J. Agric. Food Chem.- 2007.- V. 55.- Р. 8995.
7. Stamatis H., Xenakis A., Kolisis F. N. // Biotechnology Advances.- 1999.- V. 17.-Р. 293.
8. Елисеев С. А., Кучер Р. В. Поверхностно-активные вещества и биотехнология.- Киев: Нау-кова думка, 1991.- 60 с.
9. de Carvalho C.C.C.R., da Fonseca M.M.R. // J. Mol. Catal. B: Enzymatic.- 2002.- V. 19-20.-Р. 389.
10. Калимуллина Л. Я. Петухова Н. И. Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2008.- Т. 15, № 1.- С. 8.
Работа выполнена при поддержке аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы), проект №2.1.2/5048 «Создание научных основ хемо-, регио- и энантионаправленной биотрансформации органических соединений и биоокисления сульфидов металлов»
