CC BY
122
20
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
УДК 577.21; 636.082.12; 619
М. Е. Михайлова, Е. Л. Романишко, Н. А. Камыш
ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИЙ СВИНЕЙ
ПО ЛОКУСУ ГЕНА RYR1
Мутация, вызывающая замену 1843С > Т в экзоне 17 гена рецептора рианодина RYR1 в гомозиготном состоянии вызывает у свиней стресс-синдром. Исследование животных-носителей мутации (nn) не выявило, гетерозиготная форма генотипа (Nn) встречается с частотой в среднем 3,79%. Мутантный аллель n во всех исследованных хозяйствах встречался приблизительно с одинаковой частотой (0,02-0,03%). В ЗАО «Советская Белоруссия» выявлено 5,7% скрытых носителей мутации (Nn), в РУП «С/к «Заря» - 2,48%. В исследованных популяциях свиней обнаружено: 4,4% животных породы дюрок, 6,7% - породы крупной белой и 50% животных породы пьетрен обладали гетерозиготными генотипами.
Введение
Современное свиноводство развивается и совершенствуется на основе достижений генетики и биотехнологии. Признавая ведущую роль традиционных методов разведения, следует отметить, что применение только классической селекции уже не может обеспечить должного уровня эффективности селекционно-племенной работы [1].
Использование отбора по генетическим маркерам выводит селекцию на новый уровень, позволяя непосредственно оценивать генотипы, выявлять носителей скрытых мутаций в гетерозиготном состоянии [2].
Селекция свиней с помощью молекулярных маркеров - это поиск особенных различий по ДНК у пород и отдельных особей. До недавнего времени количество ДНК-маркеров, использованных в свиноводстве, было менее 100. Первым, наиболее известным ДНК-маркером стал ген На1 1843, позволяющий контролировать ген стресса свиней. Зачастую фенотипическое изменение признака вызвано мутацией одного единственного нуклеотида в последовательности ДНК (точечные мутации), приводящей к изменению или обрыву аминокислотной последовательности белка. При оценке точечных мутаций с рецессивным типом наследования по фенотипу невозможно разделение гомозиготных носителей и гетерозиготных скрытых носителей наследственных изменений. Это приводит к тому, что даже при выбраковке всех носителей неблагоприятный рецессивный аллель сохраняется в популяции, и хотя с меньшей частотой, но все же проявляется в последующих поколениях. Использование молекулярно-генетических методов не только позволяет разделить популяцию на носителей и неносителей, но и делает возможным диагностику, а следовательно, и выбраковку скрытых носителей [3].
Сегодня в свиноводстве республики уделяется большое внимание разведению пород интенсивного типа, обладающих высокими показателями мясной продуктивности. В то же время интенсивная селекция свиней на мясность привела к нежелательным тенденциям - появлению у них гормональной и вегето-нервной неустойчивости, высокой нервной возбудимости и чувствительности сердечно-сосудистой системы, к ослаблению природной устойчивости, ухудшению качества мяса и увеличению стресс-чувствительности (PSS-синдром). Эти животные слишком «изнежены». Повышенная чувствительность некоторых пород свиней к стрессам становится все более острой проблемой, так как сопровождается большими экономическими потерями от падёжа свиней. Под действием таких стрессовых факторов, как перегрев, скученность, транспортировка, избежать которых в условиях животноводческого комплекса очень трудно, у животных развивается злокачественный гипертермический синдром (MHS - Malignant Hypertermia Syndrome), наблюдается резкое снижение рН на фоне высокой температуры тела (38-40° С), что приводит к гибели животных. Стресс у животных отражается также на качестве мяса. У таких свиней после убоя происходят быстрые биохимические изменения в скелетной мускулатуре (резко увеличивается концентрация молочной кислоты), в результате чего образуется так называемое PSE-мясо (бледная, водянистая, рыхлая свинина с кислым привкусом) или DFD (темная, сухая, жесткая, волокнистая свинина) [4].
PSS - это генетически обусловленная аномалия, имеет аутосомно-рецессивный тип наследования. Ранее для выявления стресс-чувствительности животных использовали галотановый
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
21
тест [4]-[6]. Определить наличие мутантного аллеля с помощью этого теста можно только для животных, являющихся рецессивными гомозиготами по RYR-гену, поэтому выбраковка галотан-положительных свиней с целью элиминации дефектного аллеля из популяции неэффективна [7].
MacLennan et al. (1990) и Fujii et. al. (1991) выявили, что причиной злокачественной гипертермии является точковая мутация в экзоне 17 гена рианодинового рецептора, который кодирует экспрессирующий в скелетных мышцах белок кальциевого канала [8]. Эта транзиция в позиции 1843 (С ^ Т) приводит к замене аргенина на цистеин в позиции 615 рианодинрецепторного белка, который находится в саркоплазматическом ретикулуме мышечного волокна, что вызывает нарушение основной функции этого белка, в результате чего происходит ряд биохимических изменений, приводящих к развитию злокачественной гипертермии [9]—[11].
Исследования Н. В. Рыжовой и Л. К. Калашниковой показали, что у пород свиней скороспелая мясная, крупная белая эстонской селекции, ландрас, цивильская и крупная белая выявлен генетический полиморфизм гена RYR1. Во всех исследуемых популяциях свиней обнаружено от 2 до 15% животных - носителей мутантного аллеля гена RYR1 в гетерозиготной форме. Среди животных крупной белой и миргородской пород носителей мутантный аллель не был выявлен. Было обнаружено, что у 8% свиней в геноме есть аллель гена RYR1, поврежденный мутацией в составе гетерозиготного генотипа. Частота мутантного аллеля - 0,042 [12].
Цель исследования - изучить генетическую структуру некоторых популяций свиней пород крупная белая, белорусская мясная, ландрас, дюрок, йоркшир, пьетрен по локусу гена RYR1, ответственному за повышенную стресс-чувствительность.
Материалы и методы исследования. Было проведено ДНК-тестирование 482 особей: хряков-производителей, свиноматок и ремонтного молодняка, разводимых в РУП «С/к «Заря», ЧСУП «Золак-Агро», С/к «Яжевичи», С/к «Багратионовский», ЗАО «Советская Белоруссия» и РСУП «Брестплемпредприятие». Ядерную ДНК выделяли из отщипа ушной раковины животных фенольно-хлороформовым методом [13], [14]. Выделенную ДНК ресуспензировали и измеряли ее концентрацию. Для этого на спектрофотометре определяли степень поглощения раствором ДНК УФ-света с длиной волны 260 nm. Чем больше света поглощает раствор, тем выше концентрация ДНК. Для контроля степени очистки ДНК определяли соотношение оптических плотностей раствора ДНК при длине волны 260 и 280 нм.
Исследование фрагмента гена RYR1 проводили по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Амплификацию фрагмента Ryr-1 гена проводили с праймерами: RYR 56.1: gtg ctg gat gtc ctg tgt tcc ct; RYR 56.2: ctg gtg aca tag ttg atg agg ttt g в течение 35 циклов в следующем режиме: денатурация (94° С - 1 мин), отжиг праймеров (60° С - 1 мин), элонгация (72° С - 1 мин), длительная элонгация (5 мин при 72° С) с предварительной денатурацией при 94° С - 5 мин.
Амплификаты подвергались рестрикции эндонуклеазой Hin6, буфер Y = /Tango™, температура инкубации 37° С. Рестриктаза расщепляет исследуемую ДНК на определённое количество фрагментов фиксированной длины.
Продукты рестрикции разделяли в 2% агарозном геле в течение 20-40 мин в специальной камере, заполненной 1х ТВЕ-буфером, при напряжении 80-120 V. Для приготовления геля растворяли 2 г агарозы в 98 мл 1х ТВЕ-буфера. Нагревали до 100° С для растворения агарозы, постоянно перемешивая раствор, затем медленно охлаждали до 50-60° С. Добавляли в раствор агарозы Sibr Green 5000х 5-6 мкл на 100 мл раствора. Затем с помощью специальной кюветы и гребенки формировали гель с лунками, в которые внесли пробы в количестве 5-8 мкл, предварительно смешанные с 2 мкл загрузочного буфера (0,05% бромфеноловый синий -100 мг, 3% фикол - 6 г, 25% сахароза - 50 г; довели объем 1х ТВЕ-буфером до 200 мл). Затем исследуемые образцы визуализировали в проходящем УФ-свете на трансиллюминаторе. Полученные результаты регистрировали с помощью фотокамеры и переносили на компьютер для статистической обработки.
Если ДНК расщепляется рестриктазой на два фрагмента длиной 84 и 50 пн относительно маркера, мутация отсутствует, анализируемое животное стрессустойчивое с доминантным гомозиготным генотипом NN; если визуализируется одна яркая полоса длиной 134 пн, анализируемое животное классифицируется как стрессчувствительное с рецессивным гомозиготным генотипом nn (рисунок 1).
22
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
Рисунок 1 - Электрофореграмма ПЦР-ПДРФ анализа по гену RYR1
На рисунке показана электрофореграмма ПЦР-ПДРФ анализа по гену RYR1.
Результаты исследования и их обсуждение
В результате исследования был выявлен полиморфизм гена RYR1, представленный двумя аллелями: N - доминантный дикий, n - рецессивный с точковой мутацией. Определены генотипы: NN - свободные от мутации (устойчивые к стрессу), Nn - скрытые носители. Генотип nn не выявлен (таблица 1).
Таблица 1 - Генетическая структура хряков-производителей, свиноматок и ремонтного молодняка по локусу гена RYR1
Хозяйство Группы животных Комбинация скрещиваний Кол-во голов Частота встречаемости генотипов, % Частота аллелей
NN Nn nn N n
1 2 3 4 5 6 7 8 9
РУП С/к «Заря» Хряки Дюрок 29 96,55 3,45 - 0,98 0,02
34 100,0 - - 1,0 -
Свиноматки 67 95,53 4,47 - 0,98 0,02
Ремонт КБ* х Л х ЭБ 7 100,0 - - 1,0 -
ЭБ х Д х КБ х ЭБ 8 100,0 - - 1,0 -
БМ х БЧП х ЭБ х Л 9 100,0 - - 1,0 -
КБ х ЭБ х БМ х БЧП 7 100,0 - - 1,0 -
В среднем по хозяйству 161 97,52 2,48 - 0,98 ± 0,011 0,02 ± 0,011
ЧСУП «Золак-Агро» Хряки 25 100,0 - - 1,0 -
В среднем по хозяйству 25 100,0 - - 1,0 -
С/к «Яжевичи» Хряки Ландрас 7 100,0 - - 1,0 -
Эстонская беконная 5 100,0 - - 1,0 -
БМ 2 100,0 - - 1,0 -
КБ 5 80,0 20,0 - 0,97 0,3
В среднем по хозяйству 19 94,44 5,56 - 0,99 ± 0,023 0,1 ± 0,023
С/к «Багратио- новский» Хряки Дюрок 5 100,0 - -
КБ 6 100,0 - -
БМ 9 100,0 - -
Эстонская беконная 3 100,0 - -
Свиноматки КБ 90 92,13 7,87 - 0,96 0,04
Ремонт 80 96,25 3,75 - 0,98 0,02
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
23
Продолжение таблицы 1
В среднем по хозяйству 193 94,79 5,21 - 0,97 ± 0,012 0,03 ± 0,012
ЗАО «Советская Белоруссия» Хряки КБ 9 100,0 - - 1,0 -
Дюрок 7 85,72 14,28 - 0,93 0,07
Пьетрен 2 50,0 50,0 - 0,50 0,50
Эстонская беконная 3 100,0 - - 1,0 -
Ландрас 14 100,0 - - 1,0 -
В среднем по хозяйству 35 94,3 5,7 - 0,97 ± 0,028 0,03 ± 0,028
РСУП «Брестплем предприятие» Хряки Ландрас 20 100,0 - - 1,0 -
Йоркшир 20 100,0 - - 1,0 -
Дюрок 5 100,0 - - 1,0 -
Л х Д 5 100,0 - - 1,0 -
В среднем по хозяйству 100,0 - - 1,0 -
ВСЕГО 482 96,21 3,79 - 0,98 ± 0,006 0,02 ± 0,006
*КБ - крупная белая, Л - ландрас, ЭБ - эстонская беконная, БМ - белорусская мясная, Д - дюрок, БЧП - белорусская черно-пестрая.
Результаты исследования 482 особей показали, что стрессчувствительных животных-носителей мутации в гомозиготном рецессивном состоянии (nn) не было выявлено, гетерозиготная форма генотипа (Nn) встречалась с частотой в среднем по всем хозяйствам - 3,79%. Мутантный аллель RYRn во всех исследованных хозяйствах встречался приблизительно с одинаковой частотой - 0,02-0,03. Наибольшее количество скрытых носителей мутации (животные с гетерозиготным генотипом Nn) выявлено в ЗАО «Советская Белоруссия», а наименьшее -в РУП С/к «Заря» (5,7% и 2,48% соответственно). В ЧСУП «Золак-Агро» скрытых носителей мутантного аллеля выявлено не было.
Среди породы эстонская беконная, ландрас, белорусская мясная, йоркшир и помесных животных полиморфизма по RYR-гену выявлено не было (таблица 2).
Таблица 2 - Частоты генотипов и аллелей RYRi-гена у свиней Республики Беларусь
Порода Количество голов Частота встречаемости генотипов, % Частота аллелей
NN Nn nn N n
Дюрок 46 95,4 4,6 - 0,98 0,02
Пьетрен 2 50,0 50,0 - 0,5 0,5
Ландрас 41 100,0 - - 1,0 -
Эстонская Беконная 11 100,0 - - 1,0 -
Крупная белая 20 93,3 6,7 - 0,97 0,03
Белорусская мясная 11 100,0 - - 1,0 -
Йоркшир 20 100,0 - - 1,0 -
Из исследованных животных пород дюрок, крупная белая и пьетрен 4,4%, 6,7% и 50% животных соответственно были гетерозиготными носителями злокачественной гипертермии. Такой высокий процент носителей мутации среди животных породы пьетрен может быть связан с недостаточностью выборки, однако такие показатели хорошо соотносятся с литературными данными, согласно которым наличие мутантного аллеля у породы пьетрен составляет 31-100% [15].
Выводы
В результате исследования был выявлен аллельный полиморфизм гена RYR1. Мутантный аллель RYRn встречался с частотой 0,02, доминантный аллель RYRN - c частотой 0,98 в среднем по всем хозяйствам. Животных с генотипом nn выявлено не было. Частота встречаемости особей с генотипом Nn в среднем по всем хозяйствам 3,79%. Среди исследованных пород наибольший процент животных-носителей мутантного аллеля выявлен у пород пьетрен (50%), дюрок (4,4%) и крупной белой (6,7%).
24
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
Проблема скрининга племенной продукции очень актуальна, особенно в условиях интенсивного завоза высокопродуктивных племенных животных из-за рубежа. Проведение генотипирования по RYR-гену позволяет выявить и удалить из популяции скрытых носителей злокачественной гипертермии, что будет способствовать увеличению откормочной, мясной продуктивности и улучшению качества свинины.
Список сокращений
RYR1 - ген рианодинового рецептора;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
PSS-синдром (porcine stress syndrom) - синдром стресса;
MHS - Malignant нурейегтіа syndrome) злокачественный гипертермический синдром;
PSE-мясо - (pale, soft, exudative) экссудативное мясо;
DFD-мясо - (dark, firm, dry);
ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов;
ПЦР - полимеразная цепная реакция.
Литература
1. Эрнст, Л. К. Генетические основы селекции сельскохозяйственных животных / Л. К. Эрнст. - М. : РАСХН, ВгНиИ животноводства, 2004. - 733 с.
2. Brascamp, E. Evaluation of six lines of pigs for crossing / E. Brascamp // Reproduction andfattening in pure breeding. - 1979. - № 96. - P. 60-61.
3. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA-polymerase / R. K. Salkl [et al.] // Science. - 1988. - V. 239. - P. 487-491.
4. Archibald, A. L. Inherited halothane-induced malignant hyperthermia in pigs / A. L. Archibald // Breeding for disease resistance in farm animals. - CAB Intern. - Wallingford, Oxon, UK, 1991. - P. 449-466.
5. Eds. Chrousos, G. P. Stress: basic mechanisms and clinical implications / G. P. Eds. Chrousos // Annals of The New York Acad. Sci. - 1995. - V. 771. - Р. 755.
6. Bouchard, T. J. Genes, environment and personality / T. J. Bouchard // Science - 1994. - V. 264. -P. 1700-1711.
7. Топіха, В. С. Стресчутливість свиней породи дюрок внутрішньопородного типу «Степовий» / В. С. Топіха, О. О. Стародубець // Вісннк аграрноі науки Причорномор’я. - Вип. 2. - 2008 - C. 150-154.
8. Identification of mutation in porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia / J. Fujii, K. Otsu, F. Zorzato [et al.] // Science. - 1991. - V. 253. - P. 448-451.
9. Hardge, T. The influence of RYR1-genotype and breed on fattening performance carcass value and meat quality / T. Hardge, A. Scholz // 45th Annual Meeting of the EAAP. - Edinburg. - September 5-8. - 1994. - P. 340.
10. Russo, V. Study of halothane locus by PCR-typing of CRC gene in pig breeds rearded in Italy / V. Russo // Int: Abstr. XXIV. Int. Conf. Anim. Genetics. - Praha. - 1994. - P. 137.
11. O'Brien, P. J. Porcine malignant hyperthermia susceptibility: Hipersensitive calcium - release mechanism of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum / P. J. O'Brien // Vet. Res. Commun. - 11. - 1987. - P. 527-559.
12. Рыжова, Н. В. Ген RYR1 и продуктивность свиней мясных пород / Н. В. Рыжова, Л. К. Калашникова // Животноводство России. - 2003. - С. 46-47.
13. Зиновьева, Н. А. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных / Н. А. Зиновьева, Е. А. Гладырь // Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных : материалы Междунар. науч. конф., 19-20 дек. 2002 г. / ВГНИИ животноводства. - Дубровицы, 2002. - С. 44.
14. ДНК-технология оценки сельскохозяйственных животных / Л. А. Калашникова [и др.]. -ВНИИплем. - 1999. - 148 с.
15. Анализ генетической структуры популяций хряков-производителей по локусу гена RYR1 / И. П. Шейко [и др.] // Зоотехническая наука Беларуси : сб. науч. тр. / редкол.: И. П. Шейко (гл. ред.) [и др.] -Т. 39. - 2004. - С. 166-170.
Summary
A genetic structure of some pig populations of major breeds in RB was studied for RYR1 gene locus. Mutation that causes replacement 1843C > T in exon 17 receptor gene rianodina RYR1 in the homozygous state causes stress syndrome by pigs. The animals-carriers of the mutation (nn) are not revealed during the studying. Geterozyt form of genotype (Nn) occurs with a frequency of approximately 3,79%. The frequency of the preferable allele N of RYR-gene was revealed to be 0,98. The mutant w-allele was shown to occur in Duroc, Large White and Pietrain breeds of the studied sample with the same frequency, on the average 3,79%.
Поступила в редакцию 02.02.11.
