CC BY
67
Получена: 4 сентября 2016 / Принята: 11 октября 2016 / Опубликована online: 31 октября 2016 УДК 616-092+577.21
ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ГИПЕРТОНИЕЙ, ОЖИРЕНИЕМ И ДИАБЕТОМ У ЛИЦ КАЗАХСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕГО ИЗУЧЕНИЯ ВЗАИМОСВЯЗЕЙ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ И МЕТАБОЛОМА
Айнур Р. Акильжанова1, Улан А. Кожамкулов1, Улыкбек Е. Каиров2, Сауле Е. Рахимова1, Айнур Ж. Ахметова1, Даурен А. Ережепов1, Асхат Б. Молкенов2, Жаннур М. Абилова1, Жаксыбай Ш. Жумадилов1
1 Лаборатория геномной и персонализированной медицины Центра Наук о жизни, National Laboratory Astana, Назарбаев Университет, Астана, Казахстан;
2 Лаборатория биоинформатики и вычислительной системной биологии Центра Наук о жизни, National Laboratory Astana, Назарбаев Университет, Астана, Казахстан
Резюме
В данной работе проведена характеристика генетических вариантов, ассоциированных с гипертонией, ожирением и диабетом и проведено сравнение геномных данных 60 образцов с международной базой данных Т-HOD (The Text-mined Hypertension, Obesity and Diabetes candidate gene database (T-HOD).
Проанализированы генетические варианты, выделенные из полных геномов и экзомов и показавшие ассоциацию с развитием гипертонии, ожирением и диабетом по обоим алгоритмическим предикторам патогенности мутаций PolyPhen2 и SIFT. Обнаружено семь генетических вариантов GHRL (rs4684677), MTHFR (rs1801133), OPRM1 (rs1799971), ERBB2 (rs1058808), BDNF (rs6265), PNPLA3 (rs738409), MTRR (rs1801394) генов.
В дальнейшем планируется интеграция данных метаболома и кодирующих и некодирующих генетических вариантов, выявленных из геномного анализа, изменяющих уровень метаболитов в клеточной системе.
Ключевые слова: полные экзомы, геномы, метаболомные исследования, гипертония, ожирение, диабет
Abstract
DETERMINATION OF GENETIC VARIANTS ASSOCIATED WITH HYPERTENSION, OBESITY AND DIABETES IN KAZAKH POPULATION TO STUDY INTERACTION OF GENETIC VARIANTS AND METABOLOME
Ainur Akilzhanovа1, Ulan Kozhamkulov1, Ulykbek Kairov2, Saule Rakhimova1, Ainur Akhmetova1, Dauren Yerezhepov1, Askhat Molkenov2, Zhannur Abilova1, Zhaxybay Zhumadilov1
1Laboratory of Genomic and Personalized Medicine, Center for Life Sciences, National Laboratory Astana, Nazarbayev University, Astana, Kazakhstan;
2Laboratory of Bioinformatics and Computational Systems Biology, Center for Life Sciences, National Laboratory Astana, Nazarbayev University, Astana, Kazakhstan.
Работа выполнена в рамках проекта ««Интеграционный геномный и метаболомный анализ кардиометаболических нарушений в казахской популяции»» по бюджетной программе МОН РК 3907/ГФ4 «Грантовое финансирование научных исследований» на 2015-2017 гг.
30
In this work genetic variants associated with hypertension, obesity and diabetes were characterized, and genomic data of 60 samples were compared using Т-HOD (The Text-mined Hypertension, Obesity and Diabetes candidate gene database (T-HOD) international database.
Genetic variants extracted from whole genomes and exomes, and associated with hypertension, obesity and diabetes based on PolyPhen2 and SIFT algorithmic predictors of mutation pathogenicity were analyzed. Seven genetic variants were detected in GHRL (rs4684677), MTHFR (rs1801133), OPRM1 (rs1799971), ERBB2 (rs1058808), BDNF (rs6265), PNPLA3 (rs738409), MTRR (rs1801394) genes.
In the future metabolomic data and data on coding and non-coding genetic variants determined from genomic analysis, that change the level of metabolites in cell system will be integrated.
Key words: whole exomes, genomes, metabolomic studies, hypertension, obesity, diabetes
ty^h
ГЕНЕТИКАЛЫК ВАРИАНТТАР МЕН МЕТАБОЛОМНЫН
©ЗАРА БАЙЛАНЫСЫН АНЫКТАУ УШ1Н КАЗАК ПОПУЛЯЦИЯСЫНДА ГИПЕРТОНИЯ, СЕМ1ЗД1К ЖЭНЕ ДИАБЕТПЕН АССОЦИАЦИЯЛАНГАН ГЕНЕТИКАЛЫК ВАРИАНТТАРДЫ ЗЕРТТЕУ
Айнур Р. Акильжанова1, Улан А. Кожамкулов1, Улыкбек Е. Каиров2, Сауле Е. Рахимова1, Айнур Ж. Ахметова1, Даурен А. Ережепов1, Асхат Б. Молкенов2, Жаннур М. Абилова1, Жаксыбай Ш. Жумадилов1
1 Геномды жэне дербес медицина зертханасы, ©Mip туралы гылымдар орталыгы, National Laboratory Astana, Назарбаев Университетi, Астана, Казахстан;
2 Биоинформатика жэне есептеуiш жуйелш биология зертханасы, ©мiр туралы гылымдар орталыгы, National Laboratory Astana, Назарбаев Университет^ Астана, Казахстан
Аталган жумыста гипертония, семiздiк жэне диабетпен ассоциацияланган генетикалы; нус;алар сипатталды, жэне 60 Yлгiнiц геномды; мэлiметтерi Т-HOD (The Text-mined Hypertension, Obesity and Diabetes candidate gene database (T-HOD) халы;аралы; мэлiметтер базасымен салыстырылды.
Толы; геномдар мен экзомдардан белшт алынган, PolyPhen2 жэне SIFT мутациялар патогендтнН алгоритмдт предикторлары бойынша гипертония, семiздiк жэне диабетпен ассоциацияны керсеткен генетикалы; нус;алар анализдендi. Жетi генетикалы; нус;алар GHRL (rs4684677), MTHFR (rs1801133), OPRM1 (rs1799971), ERBB2 (rs1058808), BDNF (rs6265), PNPLA3 (rs738409), MTRR (rs1801394) гендерiнде аны;талды.
Келешекте метаболом жэне жасушалы; жYЙеде метаболиттер децгейш езгертетiн, геномды; анализден аны;талган кодталган жэне кодталмаган генетикалы; нус;алар мэлiметтерiн интеграциялау жоспарлануда.
ty^h сездер: толы; экзомдар, геномдар, метаболомды зерттеулер, гипертония, семiздiк, диабет.
Библиографическая ссылка:
Акильжанова А.Р., Кожамкулов У.А., Каиров У.Е., Рахимова С.Е., Ахметова А.Ж., Ережепов Д.А., Молкенов А.Б., АбиловаЖ.М., ЖумадиловЖ.Ш. Исследование генетических вариантов, ассоциированных с гипертонией, ожирением и диабетом у лиц казахской популяции для последующего изучения взаимосвязей генетических вариантов и метаболома / / Наука и Здравоохранение. 2016. №4. С. 30-42.
Akilzhanovа A.R., Kozhamkulov U.A., Kairov U.Ye., Rakhimova S.Ye., Akhmetova A.Zh., Yerezhepov D.A., Molkenov A.B., Abilova Zh.M., Zhumadilov Zh.Sh. Determination of genetic variants associated with hypertension, obesity and diabetes in kazakh population to study interaction of genetic variants and metabolome. Nauka i Zdravookhranenie [Science & Healthcare]. 2016, 4, pp. 30-42.
Акильжанова А.Р., Кожамкулов У.А., Каиров У.Е., Рахимова С.Е., Ахметова А.Ж., Ережепов Д.А., Молкенов А.Б., Абилова Ж.М., Жумадилов Ж.Ш. Генетикалык варианттар мен метаболомныц езара байланысын аныктау Yшiн казак популяциясында гипертония, семiздiк жэне диабетпен ассоциацияланган генетикалык варианттарды зерттеу / / Гылым жэне Денсаулык сактау. 2016. №4. Б. 30-42.
Введение
Эпидемический рост ожирения, инсулинорезистентности и диабета 2 типа поставили общество под драматический рост риска развития атеросклеротических заболеваний и последующего роста смертности во всем мире [28,7,9,13,5]. Эти промежуточные состояния и биомаркеры находятся под строгим влиянием стиля жизни, диеты, генетических факторов. Роль этих факторов значительно отличается среди различных популяций, так например генетические варианты и их роль в развитии заболевания в одной популяции могут быть неприменимы для другой популяции.
Многие исследования показали, что развитию сердечных, метаболических заболеваний способствуют генетические факторы риска, факторы окружающей среды и образа жизни [6]. Широкомасштабные геномные ассоциативные исследования (GWAS) выявили более сотни полиморфизмов ^Р), которые ассоциированы с сердечнососудистыми заболеваниями, метаболическими нарушениями и ожирением [18,10,16].
Таким образом, очевидно, что генетические факторы играют очень важную роль определении риска заболеваний; однако, величина эффекта для каждого из генетических вариантов слаба,
предположительно, что несколько генетических вариантов оказывают сильный эффект, а большинство различных генетических вариантов имеют
незначительный эффект. Кроме того, многие эпидемиологические исследования выявили
этнические различия в распространенности и преобладании метаболического синдрома (например, выходцы из Южной Азии> Латиноамериканцы^ белокожие> темнокожие). Выходцы из Южной Азии, мигрировавшие в Великобританию, имеют повышенный риск развития метаболических нарушений [6], что демонстрирует важность взаимосвязи «ген -окружающая среда». Многочисленные исследования показали, что, несмотря на важность вопроса, очень трудно изучить взаимодействие «ген - окружающая среда» [12,19,20,23], даже массивные GWAS исследования вряд ли смогут ответить на все вопросы [19,23].
Распространенность сердечно-сосудистых заболеваний в Казахстане является одной из самых высоких в мире [26], и ишемическая болезнь сердца и цереброваскулярные заболевания являются самыми высокими в евразийском регионе, в том числе Европы, России и Центральной Азии [26]. В большом масштабном эпидемиологическом
исследовании, проведенном в Синьцзяне, Китай [27], распространенность артериальной гипертензии была в 2 раза выше у казахов, чем в других этнических группах, но распространенность гипергликемии среди них была низкой (4,7%). Кроме того, центральное ожирение было более распространено у казахов (48%), чем у других этнических групп.
Метаболомика является быстро развивающейся областью, которая обеспечивает новыми биологическими идеями. Определяемая как научное изучение химических процессов, вовлекающих малые
молекулярные метаболиты, метаболомика направлена систематически изучать уникальные химические особенности клеточных процессов, представляющих коллекции профилей метаболитов в данной точке [8].
Метаболом представляет собой совокупность всех метаболитов, являющихся конечным продуктом обмена веществ в клетке, ткани, органе или организме [11]. В то время как данные об экспрессии мРНК генов и данные протеомного анализа не раскрывают полностью всего того, что может происходить в клетке, метаболические профили могут дать мгновенный снимок физиологических процессов в клетке. Одна из задач системной биологии и функциональной геномики -интегрирование данных геномики, протеомики, транскриптомики и метаболической информации для получения более целостного представления о живых организмах.
Сегодня метаболомный анализ идентифицирует широкий спектр метаболитов в клетках, тканях или жидкостях организма, в попытках по созданию библиотек метаболомных биомаркеров для различных состояний заболеваний. Существуют международные базы данных метаболомов.
Учитывая сложную историю формирования казахской популяции, казахи могут иметь множество различных генетических и экологических факторов риска. Для решения этих вопросов, мы предлагаем изучить геномный вклад в формирование метаболома на основе секвенирования лиц казахской национальности и дальнейшего изучения их метаболома.
Этот подход является не только экономически эффективным, т.к. мы основываемся на результатах секвенирования полного генома и полного экзома казахов, но и расширяет наше понимание функциональной роли влияния этих вариантов на эндофенотипы (метаболом), которые отражают биологические или физиологические процессы организма.
Целью исследования является секвенирование полных экзомов и геномов индивидуумов казахской национальности, о которых собрана полная информация о генеалогии (жуз, род и т.д.), а также их
клинические фенотипы (ожирение, статус заболевания, например диабет и клинические биомаркеры). В последующем, для этих субъектов, будет проведена интеграция данных метаболома и кодирующих и некодирующих генетических вариантов, выявленных из геномного анализа, изменяющих уровень метаболитов в клеточной системе.
Материалы и методы
Основная идея исследования заключается в комбинировании геномного и метаболомного подходов для исследования ассоциаций генетических вариантов и метаболитов, являющихся предикторами ожирения, диабета и атеросклероза - промежуточных состояний и заболеваний, которые являются общими для казахов и других популяций мира. В данной работе были отобраны 60 участников исследования казахской национальности, для которых было проведено определение последовательности полного экзома с использованием технологии секенирования нового поколения (NGS) HiSeq2000, Illumina в период 2013-2015 годы. В дальнейшем, мы будем проводить метаболомные исследования и анализ метаболомных данных участников исследования.
Протокол исследования, информированное согласие и все виды рекрутинга были рассмотрены на Локальном этическом комитете «Центра наук о жизни» (выписка из протокола №16 от 11.03.2015г. заседания Этической комиссии ЧУ «Центра наук о жизни», АОО «Назарбаев Университет»). До забора биологических образцов каждому участнику исследования сообщалось о целях и задачах исследования, все участники прочитали и подписали форму информированного согласия и ответили на вопросник, подготовленный для данного проекта.
Рекрутинг участников исследования проводился путем приглашения в исследование на основе добровольного информированного согласия на участие. До забора биологических образцов каждому участнику исследования сообщалось о целях и задачах исследования, все участники прочитали и подписали форму информированного согласия и ответили на
вопросник, подготовленный для данного исследования.
Критерии включения в исследование -возраст от 18 до 80 лет, казахская национальность, отсутствие хронических заболеваний к моменту исследования. Сбор данных у участников исследования проводили путем анкетирования, опроса, заполнения информационных карт.
Создана электронная база данных, содержащая следующие сведения об участниках исследования:
У каждого участника был проведен забор крови и выделение ДНК из цельной крови (для исследования генома, экзома) и плазма крови (для исследования метаболома).
Для выделения ДНК в работе были использованы наборы для выделения ДНК из крови фирмы Promega, выделение проводилось согласно инструкции фирмы-производителя.
Определение количества и качества образцов ДНК проводилось с помощью спектрофотометра Nanodrop 2000 и проведения гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле.
Подготовка и кластеризация библиотек ДНК.
Далее необходимое количество ДНК отбиралось для приготовления библиотек ДНК для секвенирования полного экзома и полного генома.
Библиотеки готовились согласно стандартизованным протоколам Illumina. Для подготовки библиотеки для полногеномного секвенирования использовался TruSeq DNA Sample Preparation протокол, для подготовки бибилиотек для экзомного секвенирования использовался Sure SelectXT2 Target Enrichment Systems for Illumina Multiplexed Sequencing протокол.
Технология секвенирования нового поколения предполагает параллельное считывание информации с сотен миллионов кластеров. Это осуществляется за счет дробления ДНК образца на небольшие фрагменты длиной 200-500 нуклеотидов и последующей амплификации полученных фрагментов в ходе подготовительного этапа приготовления библиотеки. Библиотека, или набор фрагментов ДНК, может быть приготовлена как стандартным способом
(фрагментная библиотека), так и способом mate-pair (сопряженная пара). В последнем случае фрагмент вместе с 21 адаптерной последовательностью фиксированного размера лигируется, а чтения в ходе секвенирования будут производиться в обе стороны от известной последовательности. Амплификация полученных фрагментов необходима для усиления сигнала, подаваемого на считывающий механизм после каждого цикла секвенирования. Амплификация фрагментов ДНК на ячейке используется в приборах Illumina. Результатом данного этапа будет являться 100-200 миллионов пространственно разделенных кластеров коротких фрагментов, на концах которых будут находиться праймерные последовательности, необходимые для секвенирования.
ДНК секвенирование.
Секвенирование на платформе Illumina HiSeq2000 с циклической обратимой терминацией заключается в обратимой терминации секвенирования после каждого цикла. Каждый цикл секвенирования начинается с присоединения к праймерной последовательности одного нуклеотида, комплементарного матрице. Нуклеотид помечен флуорофором (одним из четырех цветов) и имеет на 3' блокирующую группу. Не связавшиеся нуклеотиды, присутствующие в растворе, смываются с подложки, за этим следует детекция сигнала от связавшихся нуклеотидов.
Сборка и картирование геномных последовательностей
Секвенатор нового поколения Illumina HiSeq2000 в результате процесса секвенирования путем синтеза, в конечном виде генерирует *bcl файлы после каждого цикла. Данные *bcl файлы одновременно конвертировались и демультиплексировались. Картирование и выравнивание сиквенсовых ридов на референсный геном человека версии hg19 проводился с помощью bwa [14] и samtools [15]. Сортировка и индексирование ридов, удаление промежуточных файлов, объединение *bam файлов, а также идентификация повторов в них осуществлялась с использованием программного пакета PicardTools. Для
исполнения и запуска программных скриптов были установлены и применялись Java Runtime Environment и R Bioconductor. Фильтрация и детекция геномных вариантов проводилась с помощью GATK [17]. Оценка патогенности полиморфизмов проводилась с помощью алгоритмических предикторов PolyPhen2 и SIFT. Общая схема биоинформатического анализа примененного в нашем исследовании изображена на рисунке 1.
Результаты
Характеристика участников исследования
Для исследования были отобраны 60 участников исследования казахской национальности, для которых было проведено определение последовательности полного экзома с использованием технологии секвенирования нового поколения (NGS) HiSeq2000, Illumina. Исключены лица не казахской национальности, и лица моложе 18 лет.
В таблице 1 представлена характеристика участников исследования.
Участники исследования были разделены на 4 группы:
1) Взрослые старше 45лет и имеющие признаки избыточного веса - 6 человек, возраст >= 45, средний ИМТ (индекс массы тела): 31.9 кг/м2;
2) Взрослые старше 45лет и без избыточного веса - 11 образцов, возраст > =45, средний ИМТ: 26.2 кг/м2;
3) Взрослые младше 45лет и страдающие ожирением (Young and obese) - 4 образца, возраст < 45, средний ИМТ: 31.0 кг/м2;
4) Взрослые младше 45лет и не страдающие ожирением (Young and non-obese) - 39 образцов, возраст < 45, средний ИМТ: 23.3 кг/м2.
Рисунок 1 - Схема биоинформатического анализа полных геномов и экзомов.
Таблица 1.
Характеристика участников исследования по группам. _
Группа исследования Старше > 45 лет Младше < 45 лет
Избыточный Без избыточного Избыточный Без избыточного
вес веса вес веса
Количество, человек 6 11 4 39
Средний возраст, лет 50,3±4,7 52,1 ±7,1 36,3±8,7 31,5±8,1
Вес, кг 89,3±6,8 74,3±5,9 98,3±6,9 66,6±7,1
Рост, см 165,5± 167,5± 177,8± 168,7±0,6
ИМТ, кг/м2 32,5±0,8 26,2±0,6 31,0±0,7 23,3±
Объем талии, см 104,0±2,1 111,0±1,7 106,5±1,9 79,4±1,8
Объем бедер, см 90,6±0,9 98,0±0,7 115,8±0,7 96,4±0,6
ОТ/ОБ 0,94 0,89 0,92 0,82
САД, мм рт.ст. 138,0±12,1 118,8±9,2 124,8±6,9 117,1 ±6,2
ДАД, мм рт ст. 82,3±8,0 76,7±6,8 77,9±7,0 77,0±6,7
Характеристика генетических вариантов, ассоциированных с гипертонией, ожирением и диабетом
Для исследования генетических вариантов, ассоциированных с гипертензией, ожирением и диабетом, мы сравнили геномные данные 60 образцов с базой данных Т-HOD (The Text-mined Hypertension, Obesity and Diabetes candidate gene database (T-HOD) http://bws.iis.sinica.edu.tw/THOD.
В настоящее время все больше исследователей сталкиваются с трудностями следовать за изменением статуса генов-кандидатов заболевания в связи с экспоненциальным ростом картирования генов исследований.
База данных генов-кандидатов гипертонии, ожирения и диабета (Т-HOD) разработана, чтобы помочь проследить существующие исследования на трех видах заболеваний: гипертонии, ожирения и диабета, (последний делится на тип 1 и тип 2), с регулярным и полуавтоматическом извлечением
информации о генах, связанных с этими заболеваниями, из недавно опубликованной литературы в данной области.
В настоящее время база Т-HOD содержит 837, 835 и 821 генов-кандидатов, в при
Детальная функциональная аннотация выявленных полиморфизмов проводилась с помощью алгоритмических предикторов, показывающие вероятность влияния замены аминокислоты на функцию белка - PolyPhen2
гипертонии, ожирении и диабете, соответственно. Т-HOD использует современные технологии работы с текстовыми документами, включя систему идентификации заболевания - гены, которые могут быть использованы, чтобы подтвердить связь генов с тремя заболеваниями и обеспечить больше доказательств для дальнейшего исследования. Содержание Т-HOD регулярно обновляется разработчиками базы данных.
При сравнении с базой Т-HOD первоначально выявлено 247 генетических вариантов, связанных с тремя заболеваниями - гипертонией, ожирением и диабетом среди геномных данных у 60 участников исследования. После фильтра значений с отсутствующими показателями осталось 177 генетических вариантов (таблица 2). За отсутствующий показатель по каждому отдельному полиморфизму принималось значение «./.», что говорит о недостаточной информации для точной оценки данной позиции в геноме/экзоме или недостаточности сиквенсового покрытия. Поиск 247 генетических вариантов среди полных геномов и экзомов проводился с помощью разработанного Python скрипта «getSNP.py».
(PP2) и SIFT. Они обратно противоположны друг другу по числовому значению.
В таблице 3 представлено количество обнаруженных генетических вариантов по группам исследования. Среди лиц с
Таблица 2.
Количество генетических вариантов, выявленных у 60 образцов при сравнении с базой данных Т-НРР._
Параметры Количество записей Количество записей после
до удаления удаления
Пустые значения «./.» с частотой более 55 были удалены 247 177
Параметры аллелей/ генотипов SNP До порогового значения После порогового значения
«./.» 8405 4883
Wild-type GT 2542 2481
Heterozygous GT 1876 1833
Mutant GT 1097 1069
Примечание: «./.» - пустое значение, Wild-type GT - дикий тип, Heterozygous GT - гетерозиготный генотип, Mutant GT - мутантный генотип.
избыточным весом наблюдается большее количество мутантных вариантов, как и среди взрослых лиц младше 45лет. Необходимы детальные исследования отдельных полиморфизмов.
Были выделены и проанализированы генетические варианты, показавшие ассоциацию с развитием гипертонии, ожирения и диабетом по обоим агоритмическим предикторам PP2 и SIFT, таких вариантов оказалось 7 в генах rs4684677 GHRL, rs1801133 MTHFR, rs1799971 OPRM1, rs1058808 ERBB2, rs6265 BDNF, rs738409 PNPLA3, rs 1801394 MTRR. В таблице 4 представлена детальная характеристика.
rs1799971(G) аллель в экзоне 1 гена опиоидного mu рецептора OPRM1 вызывает замену аминокислоты в положении 40 аспаргин (Asn) на аспартат (Asp). В литературе полиморфизм известен также как A118G, N40D, или Asn40Asp [3]. Носители хотя бы одного аллеля rs1799971(G) имеют большую предрасположенность к алкогольной зависимости, чем носители rs1799971 (А) аллелей, и, таким образом, препполагается,
rs1801394, также известный как A66G или Ile22Met, является полиморфизмом в гене MTRR метионинсинтетазы. Этот ген кодирует один из двух ферментов, участвующих в производстве метионина. Белок, кодируемый rs1801394 аллеля имеет низкое сродство к MTR и непоследовательно связан с уровнем гомоцистеина, является фактором риска для развития дефектов нервной трубки и развития синдрома в условиях повышенного гомоцистеина.
что более подвержены риску развития алкоголизма [25]. Однако, результаты исследовний противоречивы, поддерживая и отвергая данную гипотезу.
Полиморфизм rs1058808 ERBB2 Pro1140Ala ассоциирован с ожирением, полморифзмам HER-2 как фактор риска развития эндометриального рака у корейских женщин [24]. Полиморфизм rs6265 (Val66Met) является полиморфзмом brain-derived neurotrophic factor BDNF гена. Наиболее распространенный G аллель кодирует Val, в то время как аллель А кодирует Met. Аллель может быть защитным против депрессии, когда подвергается повторному поражению. В двух исследованиях британских женщин, носители rs6265 (А) аллелей были с более низким индексом массы тела ИМТ, чем носители rs6265 (G) аллелей [22].
rs738409 является полимофризмом в гене PNPLA3 и связан с жировым гепатозом. Показана ассоциация данного полиморфизма с патологическим ожирением - связь NPLA3 I148M (rs738409) и показателями повреждения печени у лиц европейского происхождения [21].
Полиморфизм ^1801133 МТ^ и ^1801394 MTRR, одни из шести полиморфизмов метаболических путей риска развития ожирения у подростков европейского происхождения [4]. Ранее нами было показано, что полиморфизм ^1801133 MTHFR, генотип ТТ С677Т является независимым фактором риска сердечнососудистых заболеваний и рака молочной железы в казахской популяции [1,2].
Таблица 3.
Количество полиморфизмов SNP, найденных среди участников исследования по группам.
Избыточный вес Без избыточного веса Старше > 45 лет Младше < 45 лет
Wild 128 23 41 110
(Дикий тип)
Heterozygous (Гетеризиготный) 109 27 33 103
Mutant 62 13 16 59
(Мутантный)
Анализ выборки образцов с различными вариантами выявленных генотипов показал (Рисунок 2), что в четырех полиморфизмах мутантный вариант наблюдался в достаточно
высоком проценте образцов - ^1799971 OPRM1 - 21.2%, ге738409 PNPLA3 - 26.9%, ге1801394 MTRR - 21.2%, ге1058808 ERBB2 -50%.
% с диким типом аллеля % гетерозиготных аллелей % с мутантным аллелем
Общее кол-во образцов с данным полиморфизмом
$ tu
s Ё
£ 1Ê m
NM_002454:c.A66G:p.I22M
СП
о 8
3
г— m
3
3A
—I
о.
N
о.
NM_025225:c.C444G:p.I148M
5
6 2 6
in
s NM_170735:c.G196A:p.V66M m
8 0 8 8 5 0
m NM_004448:c.C3508G:p.P1170A
71 91
9M 9R
7P
ю о
NM_000914:c.A118G:p.N40D
3 3
R
NM_005957:c.C665T:p.A222V
7
7 6 4
8 6
R
x
G
NM_001134946:c.A116T:p.Q39L
5.0 52
6.0
9.2
50
Рисунок - 2. Процентное распределение аллелей между выявленными полиморфизмами.
В случае полиморфизма rs1058808 ERBB2 дикий немутантный вариант встречался в 11.5%, что указывает на необходимость исследования данного полиморфизма на большей выборке образцов для более глубокого понимания роли данного полиморфизма у индивидуумов казахской национальности.
Изучение и поиск методики по исследованию метаболома у участников исследования.
Был проведен анализ литературы по выбору оптимального метода изучения полного метаболома у участников. В настоящее время основные аналитические инструменты включают ядерную магнитную спектрометрию (ЯМС) и методы, сочетающие различные платформы, такие как газовая хроматография (ГХ) и жидкостная хроматография (ЖХ), объединенных с масс-спектрометрией (МС). Эти подходы имеют свои сильные и слабые стороны, и лучшее решение может быть определено исследовательскими целями. В целом, ГХ в сочетании с МС является хорошо подходящим методом для метаболомного анализа в связи с высокой разделительной мощностью, воспроизводимостью и чувствительностью масс-селективным детектором.
Выводы
Проведена характеристика генетических вариантов, ассоциированных с гипертонией, ожирением и диабетом и проведено сравнение геномных данных 60 образцов с международной базой данных Т-HOD (The Text-mined Hypertension, Obesity and Diabetes candidate gene database (T-HOD).
Были выделены и проанализированы генетические варианты, показавшие ассоциацию с развитием гипертонии, ожирения и диабетом по обоим алгоритмическим предикторам патогенности мутаций PolyPhen2 и SIFT.
Анализ выборки образцов с различными вариантами выявленных генотипов показал, что в четырех полиморфизмах мутантный вариант наблюдался в достаточно высоком проценте образцов - rs1799971 OPRM1 -
21.2%, ге738409 PNPLA3 - 26.9%, ге1801394 MTRR - 21.2%, ге1058808 ERBB2 - 50%.
Первым этапом по изучению ассоциации генетических вариантов и метаболитов, являющихся предикторами ожирения, диабета и атеросклероза у лиц казахской популяции является секвенирование полных экзомов 60 человек казахской национальности. Для этих субъектов, в дальнейшем, мы будем использовать данные анализа метаболома для определения, как кодирующих, так и некодирующих вариантов, выявленных из нашего геномного анализа, изменяющих уровень метаболитов в клеточной системе. Поскольку метаболиты являются промежуточными биохимическими продуктами, они обеспечивают связь между причинными факторами (геном) и результатом, тем самым расширяя геномику в область функциональной геномики для более глубокого понимания потенциальной патофизиологии и трансляционной медицины.
Интеграционный подход комбинирования геномики и метаболомики позволит значительно улучшить сложные процессы патогенеза данных заболеваний. Данное исследование поможет расширить знания о метаболических нарушениях, повышающих риск кардиометаболических заболеваний у казахов, выявленные метаболиты могут служить в качестве мишени для терапевтического вмешательства. Для практического здравоохранения могут быть предложены новые биомаркеры для диагностики метаболических нарушений, биомаркеры риска развития патологии метаболизма, и последующего развития заболеваний.
У авторов статьи нет конфликта интересов.
Работа выполнена в рамках проекта «Интеграционный геномный и метаболомный анализ кардиометаболических нарушений в казахской популяции»» по бюджетной программе МОН РК 3907/ГФ4 «Грантовое финансирование научных исследований» на 2015-2017 гг.
Литература:
1 Akilzhanova A., Takamura N., Kusano Y., Karazhanova L., Yamashita S., Saito H., Aoyagi K. Association between C677T/MTHFR genotype and homocysteine concentration in a Kazakh population // Asia Pac J Clin Nutr. 2008. V.17(2). P.325-9.
2 Akilzhanova A., Nurkina Z., Momynaliev K., Ramanculov E., Zhumadilov Z., Rakhypbekov T., Hayashida N., Nakashima M., Takamura N. Genetic profile and determinants of homocysteine levels in Kazakhstan patients with breast cancer // Anticancer Res. 2013 Sep. V.33(9). P.4049-59.
3 Berthold H.K., Giannakidou E., Krone W., Trëgouët D.A., Gouni-Berthold I. Influence of ghrelin gene polymorphisms on hypertension and atherosclerotic disease. // Hypertens Res. 2010 Feb. V.33(2). P.155-160.
4 Bokor S., Meirhaeghe A., Ruiz J.R., Zaccaria M., Widhalm K., Gonzalez-Gross M., Amouyel P., Moreno L.A., Molnar D., Dallongeville J. Helena Study Group. Common polymorphisms in six genes of the methyl group metabolism pathway and obesity in European adolescents.// Int J Pediatr Obes. 2011 Jun. -V.6(2-2). - P.e336-344.
5 Burke G.L., Bertoni A.G., Shea S., Tracy R., Watson K.E., Blumenthal R.S., Chung H., Carnethon M.R. The impact of obesity on cardiovascular disease risk factors and subclinical vascular disease: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis // Archives of internal medicine. -2008. V.168(9). P.928-935.
6 Byrne C.D., Wild S.H. The metabolic syndrome. Byrne C.D., Wild S.H., editors. West Sussex, England: John Wiley and Sons; 2005.
7 Chrostowska M., Szyndler A., Paczwa P., Narkiewicz K. Impact of abdominal obesity on the frequency of hypertension and cardiovascular disease in Poland - results from the IDEA study (international day for the evaluation of abdominal obesity) // Blood pressure. 2011 V.20(3). P.145-152.
8 Daviss (April 2005). «Growing pains for metabolomics» The Scientist 19 (8). P.25-28
9 Fox K.A., Despres J.P., Richard A.J., Brette S., Deanfield J.E., Committee I.S., National C-o. Does abdominal obesity have a similar impact on cardiovascular disease and diabetes? A study of 91,246 ambulant patients in 27
European countries // European heart journal.
2009. V.30(24). P.3055-3063.
10 Hindorff L.A., Sethupathy P., Junkins H.A., Ramos E.M., Mehta J.P., Collins F.S., Manolio T.A. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits // Proc Natl Acad Sci U S A. 2009. V.106(23). P.9362-9367.
11 Jordan K.W., Nordenstam J., Lauwers G.Y., Rothenberger D.A., Alavi K., Garwood M., Cheng L.L. «Metabolomic characterization of human rectal adenocarcinoma with intact tissue magnetic resonance spectroscopy». // Diseases of the Colon & Rectum. 2009. 52(3).-P.520-5.
12 Khoury MJ, Adams MJ, Jr., Flanders WD. An epidemiologic approach to ecogenetics. // Am J Hum Genet. 1988. V.42(1). P.89-95.
13 Lavie C.J., Milani R.V., Ventura H.O. Obesity and cardiovascular disease: risk factor, paradox, and impact of weight loss // Journal of the American College of Cardiology. 2009. V.53(21). P.1925-1932.
14 Li H., Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform // Bioinformatics. 2009. Vol. 25, № 14. P. 17541760.
15 Li H., Handsaker B., Wysoker A., Fennell T., Ruan J., Homer N., Marth G., Abecasis G., Durbin R. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools // Bioinformatics. 2009. Vol. 25, № 16. P. 2078-2079.
16 Manolio T.A., Collins F.S., Cox N.J., Goldstein D.B., Hindorff L.A., Hunter D.J., Mc Carthy M.I., Ramos E.M., Cardon L.R., Chakravarti A., Cho J.H., Guttmacher A.E., Kong A., Kruglyak L., Mardis E., Rotimi C.N., Slatkin M., Valle D., Whittemore A.S., Boehnke M., Clark A.G., Eichler E.E., Gibson G., Haines J.L., Mackay T.F., Mc Carroll S.A., Visscher P.M.. Finding the missing heritability of complex diseases // Nature. 2009. V.461(7265). P.747-753.
17 Mc Kenna A., Hanna M., Banks E., Sivachenko A., Cibulskis K., Kernytsky A., Garimella K., Altshuler D., Gabriel S., Daly M., DePristo M.A. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data // Genome Res.
2010. Vol. 20, № 9. P. 1297-1303.
18 Monda K.L., North K.E., Hunt S.C., Rao D.C., Province M.A., Kraja A.T. The genetics of obesity and the metabolic syndrome // Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 2010. V.10(2). P. 86-108.
19 Ober C., Vercelli D. Gene-environment interactions in human disease: nuisance or opportunity? // Trends Genet. 2011. V.27(3). P.107-115.
20 Ottman R. An epidemiologic approach to gene-environment interaction // Genet Epidemiol. 1990. V.7(3). P.177-85.
21 Romeo S., Sentinelli F., Dash S., Yeo G.S., Savage D.B., Leonetti F., Capoccia D., Incani M., Maglio C., Iacovino M., O'Rahilly S., Baroni M.G. Morbid obesity exposes the association between PNPLA3 I148M (rs738409) and indices of hepatic injury in individuals of European descent. // Int J Obes (Lond). 2010 Jan. V,34(1). P.190-194.
22 Shugart Y.Y., Chen L., Day I.N., Lewis S.J., Timpson N.J., Yuan W., Abdollahi M.R., Ring S.M., Ebrahim S., Golding J., Lawlor D.A., Davey-Smith G. Two British women studies replicated the association between the Val66Met polymorphism in the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and BMI // Eur J Hum Genet. 2009 Aug. V.17(8). P.1050-1055.
23 Terwilliger J., Lee J.H. Natural experiments in human gene mapping: The
intersection of anthropological genetics and genetic epidemiology. In: Crawford M, editor. Anthropological Genetics: Theory, Methods, and Applications. Cambridge: Cambridge University Press; 2007. P. 38-76.
24 Tong S.Y., Ha S.Y., Ki K.D., Lee J.M., Lee S.K., Lee K.B., Kim M.K., Cho C.H., Kwon S.Y. The effects of obesity and HER-2 polymorphisms as risk factors for endometrial cancer in Korean women // BJOG. 2009 Jul., V.116(8). P.1046-1052.
25 van den Wildenberg E, Wiers R.W., Dessers J., Janssen R.G., Lambrichs E.H., Smeets H.J., van Breukelen G.J.. A functional polymorphism of the mu-opioid receptor gene (OPRM1) influences cue-induced craving for alcohol in male heavy drinkers // Alcohol Clin Exp Res. 2007 Jan. V.31(1). P.1-10.]
26 WHO. Highlights on health in Kazakhstan. 1999.
27 Yan W., Yang X., Zheng Y., Ge D., Zhang Y., Shan Z., Simu H., Sukerobai M., Wang R. The metabolic syndrome in Uygur and Kazak populations // Diabetes Care. 2005. V.28(10). P. 2554-5.
28 Zalesin K.C., Franklin B.A., Miller W.M,. Peterson E.D., Mc Cullough P.A. Impact of obesity on cardiovascular disease // The Medical clinics of North America. 2011. V.95(5). P.919-937.
Контактная информация:
Акильжанова Айнур Рахметуловна - д.м.н., PhD, ассоциированный профессор, руководитель Лаборатории геномной и персонализированной медицины, ЧУ «National Laboratory Astana», Назарбаев университет.
Почтовый адрес: проспект Кабанбай батыра, 53, кабинет 9519В, 010000, г. Астана E-mail: [email protected] Телефон: +7 7172 70 65 01
