CC BY
54
© ГОМЕЛЛЯ М.В., ДОЛГИХ В.В., ФИЛИППОВ Е.С., РЫЧКОВА Л.В.
УДК [616.153.962.4-07:616.12-008.331.1]-053.2
ИССЛЕДОВАНИЕ ФИБРИНОЛИЗА ПРИ ЛАБИЛЬНОЙ И СТАБИЛЬНОЙ ЭССЕНЦИАЛЬНОЙ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ
У ДЕТЕЙ
М.В. Гомелля, В.В. Долгих, Е.С. Филиппов, Л.В. Рычкова
Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН,
Иркутск, директор - член-корр. РАМН Л.И. Колесникова; клиника Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН, гл. врач -д.м.н., проф. В.В. Долгих; Иркутский государственный медицинский
университет, ректор - д.м.н., проф. И.В. Малов; кафедра педиатрии ФПК и ППС, зав. - д.м.н., проф. Е.С. Филиппов.
Резюме. В статье представлены результаты исследования фибринолиза и продуктов паракоагуляции у детей с лабильной и стабильной артериальной гипертензией. Выявлено достоверное снижение активности фактора свертывания XII и увеличение количества растворимых фибрин-мономерных комплексов при лабильной артериальной гипертензии, достоверное снижение активности плазминогена, XII фактора, увеличение количества растворимых фибрин-мономерных комплексов и Д-димера при стабильной артериальной гипертензии. Уровень тромбинемии был выше при стабильной артериальной гипертензии в сравнении с лабильной (по количеству растворимых фибрин-мономерных комплексов и наличию Д-димера).
Ключевые слова: фибринолиз, эссенциальная артериальная гипертензия.
Гомелля Марина Владимировна - к.м.н., научный сотрудник лаборатории экологической педиатрии и реабилитации У РАМН НЦ ПЗС и РЧ СО РАМН,
ассистент каф. педиатрии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов ИГМУ; e-mail: [email protected].
Долгих Владимир Валентинович - д.м.н., проф., заместитель директора по науке Учреждения РАМН НЦ ПЗС и РЧ СО РАМН; e-mail: [email protected].
Филиппов Евгений Семенович - д.м.н., проф., зав. каф. педиатрии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов ИГМУ; e-mail: [email protected].
Частота встречаемости артериальной гипертензии (АГ) среди детей и подростков - 4,8-18,0% [1]. Важным фактором прогрессирования АГ являются нарушения гемостаза, что приводит к частому возникновению тромбозов [1,4,5,6,7,8]. В этой связи проблеме нарушений свертывания крови при АГ посвящено значительное количество фундаментальных исследований, что подчеркивает ее актуальность. Между тем в педиатрии этот важный вопрос изучен недостаточно, что дало нам основание для исследования состояния фибринолиза и показателей продуктов паракоагуляции при лабильной и стабильной АГ (ЛАГ и САГ соответственно) у детей. Нами было проведено исследование частоты и уровня изменений активности плазминогена, фактора (Ф) XII, количества растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) и Д-димера у детей при ЛАГ и САГ.
Материалы и методы
На базе клиники Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН обследовано 205 детей в возрасте от 9 до 17 лет, из них 170 детей с эссенциальной артериальной гипертензией (ЭАГ) и 35 практически здоровых детей. Из числа 170 детей с ЭАГ у 80 (47,1%) была лабильная, у 90 (52,9%) - стабильная артериальная гипертензия. У детей с ЛАГ у 41 (51,2%) выявлены протромботические нарушения гемостаза, которые были подтверждены комплексным исследованием сосудисто-тромбоцитарного и
плазменного гемостаза (1 группа). У детей с САГ протромботические нарушения гемостаза были выявлены у 64 - 71,1% (2 группа). Контрольную группу составили 35 практически здоровых детей. У всех детей впервые исследовали активность плазминогена методом хромогенных субстратов. Фотометрическое определение плазминовой активности проводили после полной активации плазминогена стрептокиназой) (норма-80-120%), ФакторХП - методом коррекции активированного парциального тромбопластинового времени на дефицитной по фактору плазме с основными реагентами фирмы «Roche», Франция (норма-60-140%), продукты паракоагуляции: количество РФМК изучали полуколичественным методом агглютинации бедной тромбоцитами цитратной плазмы с ортофенантролином с реагентами фирмы «Технология Стандарт», Россия. Метод основан на оценке времени появления в исследуемой плазме, содержащей РФМК, хлопьев фибрина после добавления ортофенантролина (норма-3-6 мг/дл); рекомендуемые критерии оценки РФМК при активации гемостаза по данным Д.М. Зубаирова (2000) [2]; А.П. Момот, (2006) [3]: от 3,0 до 6,0 мг/дл - клинически незначимые значения, от 6,0 до 10,0 мг/дл - наблюдательный диапазон, от 10,0 до 20,0 мг/дл - терапевтический диапазон тромбинемии, свыше 20,0 мг/дл - состояние, угрожающее по тромбозам). Содержание Д-димера оценивали методом латекс-агглютинации, использовали моноклональные антитела на латексе (норма- < 0,50 г/л). Исследование показателей проводили на автоматическом коагулометре STA-R Evolution (фирма «Roche»), Франция на базе лаборатории гематологии Иркутского областного консультативно-диагностического центра.
Сравнение полученных результатов проводили по формулам математической статистики. В описании представлены средние значения результатов исследования в группах (М) и значения стандартной ошибки (m). Статистическая обработка данных осуществлялась на персональном компьютере с помощью электронных таблиц Excel с помощью пакета прикладных программ «Statistica for Windous» v. 6,0 (StatSoft, США). Для
установления значимого различия использовался непараметрический критерий Крамера-Уэлча, различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение
При исследовании показателей фибринолиза было выявлено, что активность плазминогена при ЛАГ у детей не изменялась. При САГ у 12 (18,8%) детей активность плазминогена была снижена (менее 80,0%) и отличалась от аналогичного показателя контрольной группы на 40,5% (р<0,01) (табл.1). В контрольной группе изменений активности плазминогена выявлено не было. Из числа этих 12 пациентов при САГ уровень активности плазминогена был в пределах от 80,0 до 70,0% у 8 (66,7%) больных, у 4 (33,3%) больных - в пределах 69,0-60,0%. Выявленные изменения указывают на то, что у 12 (18,8%) детей при стабильной АГ имеется скрытая гиперкоагуляция, характеризующаяся снижением активности плазминогена.
Известно, что плазминоген является основным ферментом фибринолиза, который осуществляет специфический протеолиз фибрина и фибриногена и дефицит плазминогена рассматривается как тромбофилическое состояние. Выявленное снижение активности плазминогена у 12 (18,8% ) детей при САГ, вероятно, является вторичным тромбогенным фактором и может свидетельствовать о наличии хронической гиперкоагуляции в сосудистом русле, что может способствовать развитию и прогрессированию тромботических осложнений.
При изучении активности фактора XII было установлено, что у 5 (12,2%) детей при лабильной артериальной гипертензии активность исследуемого фактора была снижена (менее 50,0%) и отличалась от аналогичного показателя контрольной группы на 64,3% (р<0,001) (табл.1). Из числа этих 5 пациентов с ЛАГ уровень активности фактора XII был в пределах от 50,0 до 40,0% у 3 (60,0%) больных, у 2 (40,0%) больных - 39,0-30,0%. При САГ установлено, что у 8 (12,5%) детей активность фактора XII была снижена (менее 50,0%). В среднем активность фактора XII была меньше контрольных величин на 62,5% (р<0,001) (табл.1). Из числа этих 8 пациентов с САГ уровень активности XII
фактора был в пределах от 50,0 до 40,0% у 4 (50,0%) больных, у 4 (50,0%) больных - в пределах 39,0-30,0%. В контрольной группе изменений активности фактора XII не выявлено. Таким образом, при лабильной и стабильной артериальной гипертензии было выявлено практически одинаковое количество больных, имеющих снижение фактора XII.
Известно, что недостаток фактора XII характеризуется вероятностью тромботических осложнений, главным образом из-за снижения фибринолитической активности плазмы, так как фактор XII является активатором фибринолиза. На основе полученных результатов, а также литературных данных, свидетельствующих о том, что снижение фактора XII является тромбофилическим состоянием, можно предположить о наличии патогенетической связи между снижением активности фактора XII и тромботическими осложнениями при эссенциальной артериальной гипертензии. У детей с АГ выявленные нарушения, возможно, являются фоном (при АГ имеется продолжительная гемодинамическая травма сосудистого эндотелия, что закономерно снижает его атромбогенные свойства) или даже пусковым механизмом развития предтромботических нарушений при АГ. Следовательно, выявленное снижение активности фактора XII у 5 (12,2%) детей при ЛАГ и у 8 (12,5%) при САГ может способствовать развитию и прогрессированию тромботических осложнений.
Кроме того, при АГ у детей наблюдались изменения показателей паракоагуляции. Установлено, что у 21 (51,2%) пациента при ЛАГ количество РФМК было увеличено (более 6,0 мг/дл) и отличалось от аналогичного показателя контрольной группы в 2,2 раза (р<0,001) (табл.1). Из числа этих 21 пациентов с ЛАГ количество РФМК было в пределах от 6,0 до 10,0 мг/дл у 18 (85,7%) больных, у 3 (14,3%) больных - от 10,0 до 20,0 мг/дл. При САГ количество РФМК было увеличено (более 6,0 мг/дл) у 42 (65,6%) детей и отличалось от аналогичного показателя контрольной группы в 2,6 раза (р<0,001) (табл.1). Из числа этих 42 пациентов с САГ количество РФМК было в пределах от 6,0 до 10,0 мг/дл у 26 (61,9%) больных, у 16 (38,1%) больных - от
10,0 до 20,0 мг/дл. В контрольной группе увеличение количества РФМК (6,5 мг/дл) выявлено у 1 (2,9%) ребенка. При сравнении 1 и 2 группы между собой установлено, что при САГ отмечалось достоверно большее количество больных, имеющих увеличение количества РФМК и более выраженное, чем при ЛАГ (р<0,01).
Известно, что РФМК являются продуктами деградации фибриногена и маркером тромбинемии. Следовательно, как при лабильной, так и при стабильной артериальной гипертензией у детей выявлена скрытая тромбинемия. При этом как при лабильной АГ, так и при стабильной АГ у подавляющего числа детей отмечался наблюдательный диапазон активации гемостаза. При САГ отмечалось достоверно большее количество больных, имеющих терапевтический диапазон тромбинемии (р<0,01).
Изменений количества Д-димера у детей при ЛАГ не было выявлено, в то время как в группе детей с САГ у 2 (3,1%) пациентов количество Д-димера было увеличено (более 0,50 г/л) в 1,8 раза (р<0,01) (табл.1). Из числа этих 2 пациентов с САГ количество Д-димера было в пределах от 0,50 до 0,60 г/л у 100,0% больных. В контрольной группе увеличение количества Д-димера не выявлено.
Известно, что Д-димер является специфическим продуктом деградации фибрина, маркером тромбинемии и его содержание в плазме пропорционально активности фибринолиза и количеству лизируемого фибрина. Можно предположить, что скрытая тромбинемия может быть следствием длительной травмы стенок кровеносных сосудов при САГ у детей.
Таблица
1
Изменение показателей фибринолиза и продуктов паракоагуляции у детей при лабильной и стабильной АГ
Группы р Показатели
исследования Плазминоген ФХ11 РФМК Д-димер
(%) (%) (мг/дл) (г/л)
1 группа (n=41) - 38,0+-3,2 9,3+-0,4 -
2 группа (n=64) 69,0+-4,8 39,8+-3,5 11,1+-0,2 0,56+-0,04
Контрольная группа(n=35) 109,5+-3,5 102,3+-3,4 4,3 +-0,1 0,31+-0,02
р 1-2 - >0,5 <0,01 -
р 1-3 - <0,001 <0,001 -
р 2-3 <0,01 <0,001 <0,001 <0,01
Таким образом, было установлено, что у детей при лабильной АГ имеется
скрытая тромбинемия, характеризующаяся снижением активности фактора XII
и увеличением количества РФМК, а у детей при стабильной АГ - снижением
активности плазминогена, фактора XII, увеличением количества РФМК и Д-
димера. Только при стабильной АГ было выявлено снижение активности
плазминогена и увеличение количества Д-димера. Кроме этого, при стабильной
АГ отмечалось достоверно большее количество больных, имеющих увеличение
количества РФМК и более выраженное при сравнении с лабильнлой АГ. При
этом уровень тромбинемии был выше при стабильной АГ в сравнении с
лабильной АГ (по количеству РФМК и наличию Д-димера). У детей при
лабильной АГ, а особенно при стабильной АГ необходимо комплексное
исследование гемостаза, в том числе на наличие наследственной тромбофилии
с проведением генетических методов исследований. Целесообразно включать
исследование гемостаза в план диагностических мероприятий при
эссенциальной АГ, начиная с детского возраста, а также проводить коррекцию
сдвигов в системе свертывания крови.
THE STUDY OF FIBRINOLYSIS AT LABILE AND STABLE ESSENTIAL ARTERIAL HYPERTENSION AT CHILDREN
M.V. Gomellya, V.V.Dolgikh, E.S. Filippov, L.V. Richkova The Scientific Center of Families' Health Problems And The Reproduction of People and The Siberian Department of the Russian Academy of Medical Sciences,
Irkutsk,
The Irkutsk State Medical University.
Abstract. The paper presents the results of research the fibrinolysis and products of paracoagulation in children with labile and stable arterial hypertension. It was found significant decrease in activity of coagulation factor XII and the increase the amount of soluble fibrin-monomer complexes at labile arterial hypertension, significant decrease of the activity of plasminogen, XII factor, increasing the number of soluble fibrin-monomer complexes and
D-dimer at stable arterial hypertension. Thrombinemia level was higher at stable hypertension in comparison with the labile (by amount of soluble fibrin-monomer complexes and the presence of D-dimer).
Keywords: fibrinolysis, essential arterial hypertension.
Литература
1. Долгих В.В., Колесникова Л.И. Патогенез эссенциальной артериальной гипертензии у детей. - Иркутск: Изд-во ВСНЦ СО РАМН, 1999. - 220 с.
2. Зубаиров Д.М. Тромбофилии // Казанский медицинский журнал. -1996. - №1. - С. 1-5.
3. Момот А.П. Патология гемостаза. Принципы и алгоритмы клинико-лабораторной диагностики. - СПб.: ФормаТ, 2006. - 208 с.
4. Подчерняева Н. Тромбоз в педиатрической практике // Врач. - 2006. - № 9. -
С.20-23.
5. Чупрова А.В., Хозяинова Ж.В., Соловьев О.Н. и др. Состояние системы свертывания крови при артериальной гипертензии у детей // Педиатрия. - 1998. - № 6. - С.48-52.
6. Kjeldsen S.E., Julius S., Hender T. et al. Stroke is more common than myocardial infarction in hypertension analysis based on 11 major randomized intervention trials // Blood Press. - 2001. - Vol.10. - P.190-192.
7. Salomaa V., Rasi V., Kulantinal S. et al. Haemostatic factors a predictors of coronary events and total mortality // Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular
Bioligy. - 2002. - Vol.22, № 2. - P.353-358.
8. Spenser C.G.C., Gurney D., Blann A.D. et al. Platelet and haemoreological markers in high risk hypertensives are improved by tighter blood pressure control and factor modification // Clinical Sciens. - 2000. - Vol.9, № 2. - P.17.
© МАРИНКИН И.О., ЖУРАКОВСКИЙ И. П., ПУСТОВЕТОВА М. Г., АРХИПОВ С. А., КУНЦ Т. А., БИТХАЕВА М.В.
УДК 612.35.014.2+612.112.3:616-002.2]
ВЛИЯНИЕ МОНОХРОМНОГО СИНЕГО СВЕТА НА МОРФОЛОГИЮ ПЕЧЕНИ И ЭКСПРЕССИЮ МАРКЕРОВ ПРОЛИФЕРАЦИИ И МОНОНУКЛЕАРНЫХ ФАГОЦИТОВ ПРИ НАЛИЧИИ ОТДАЛЕННОГО ОЧАГА ХРОНИЧЕСКОГО ВОСПАЛЕНИЯ
И.О. Маринкин, И. П. Жураковский, М. Г. Пустоветова, С. А. Архипов,
Т. А. Кунц, М.В. Битхаева Новосибирский государственный медицинский университет, ректор - д.м.н., проф. И.О. Маринкин; Центральная научно-исследовательская лаборатория,
рук. - д.м.н., проф. М.Г. Пустоветова.
Резюме. Эксперимент проведен на 18 половозрелых крысах-самцах Вистар, у 12 из которых с помощью Золотистого стафилококка создан очаг хронической инфекции в большеберцовой кости. Первую группу составляли животные без воздействия монохромным синим светом, вторую - животные, которым проводился курс светотерапии в течение 14 дней в утренние часы. В качестве контроля служил материал от 6 интактных животных. Выявленные морфологические изменения, при применении монохромного синего света, свидетельствовали об улучшении микроциркуляции в печени; менее выраженных дистрофических изменениях гепатоцитов; уменьшении воспалительной реакции; снижении количества пролиферирующих фибробластов в портальных трактах; уменьшении концентрации сульфатированных гликозаминогликанов в области триад и стенках центральных вен.
Ключевые слова: синий свет, печень, хроническое воспаление, мононуклеарные фагоциты.
Маринкин Игорь Олегович - д.м.н., проф., ректор НГМУ; e-mail: [email protected]
Жураковский Игорь Павлович - к.м.н., ст.н.с. ЦНИЛ; e-mail: murash2003 @yandex.ru.
Пустоветова Мария Геннадьевна - д.м.н., проф., зав ЦНИ, НГМУ; e-mail: [email protected].
Несмотря на огромный прогресс фармакоиндустрии, повсеместно растет интерес к немедикаментозной терапии, в частности, к физиотерапевтическим методам. Среди них важное место занимает светолечение. Определенный интерес представляет изучение использования монохромного синего света при различных патологических состояниях. Считается, что механизм его действия в значительной степени связан с возможностью стимуляции энергетического обеспечения клетки за счет усиления синтеза энергии в митохондриях [2]. Это обусловлено тем, что важнейшие флавопротеины, участвующие в процессах аэробного фосфорилирования, поглощают свет в синей области спектра. Кроме того при воздействии света с длиной волны 410-450 нм отмечается снижение вязкости крови, увеличение скорости кровотока в магистральных сосудах, улучшение микроциркуляции, иммуномодулирующее и бактериостатическое действие [3].
Современные условия техногенной цивилизации способствуют широкому распространению воспалительных заболеваний. Многие исследователи связывают высокую частоту хронических заболеваний различных органов и систем с воздействием неблагоприятных экологических факторов, несвоевременным и неадекватным лечением острых инфекционно-воспалительных процессов, развивающихся на фоне несовершенного иммунного ответа на этиологический фактор [1,4,5]. Принимая во внимание,
что печень является не только одним из главных детоксикационных центров, но и обеспечивает защитные функции организма с помощью резидентных макрофагов и клеточной кооперации, велика вероятность вовлечения ее в патогенетические механизмы хронического воспалительного процесса, вызванного персистенцией бактериальной инфекции. В этой связи определенный интерес представляет изучение особенностей морфологических изменений в печени при наличии отдаленного очага хронического воспаления на фоне общего воздействия монохромным синим светом.
Цель исследования: изучение влияние монохромного синего света на морфологию печени, экспрессию маркеров пролиферации и мононуклеарных фагоцитов при наличии отдаленного очага хронического воспаления.
Материалы и методы
Исследование проведено на 18 половозрелых крысах-самцах Вистар с исходной массой 180-220 г., у которых с помощью золотистого стафилококка был создан очаг хронической инфекции в большеберцовой кости. Первую группу составляли животные без воздействия монохромным синим светом, вторую - животные, которым проводился курс светотерапии в течение 14 дней в утренние часы. В качестве контроля служил материал от интактных животных аналогичного с опытными возраста. Забор материала осуществляли через 2 месяца после воспроизведения хронического остеомиелита. Эксперимент выполнялся с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации по защите позвоночных животных, используемых для лабораторных и иных целей.
Материал фиксировали в 12% формалине и жидкости Теллесницкого. Из залитых в парафин объектов делали серийные срезы толщиной 7 мкм, которые окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином. Коллагеновые волокна выявляли пикрофуксином по Ван Гизону, гликозаминогликаны - альциановым синим при рН 1,0, популяцию тучных клеток оценивали после окраски альциановым синим при рН 1,25 с последующей докраской ядер кармалюмом
Майера, взаимодействие тучных клеток с плазматическими клетками - после комбинированной окраски альциановым синим при рН 1,25 и метиловым зеленым с пиронином.
Для оценки пула всех клеток системы мононуклеарных фагоцитов в печени, в том числе моноцитов, использовали моноклональные антимакрофагальные антитела к антигену, который экспрессируется на мембранах большинства моноцитов/макрофагов (клон 1C7). Для оценки пролиферативной активности клеток использовали антитела к маркеру пролиферации Ki-67 (белку, экспрессирующемуся на всех стадиях клеточного цикла, кроме стадии G0). Для изучения экспрессии в клетках печени маркеров мононуклеарных фагоцитов и пролиферации использовали двухэтапный иммуногистохимический метод. Демаскировку антигенов проводили при инкубировании в растворе тритона Х 100. Препараты последовательно инкубировали с «первыми антителами» к соответствующему антигену/маркеру, вторыми биотинилированными антителами, стрептавидин-пероксидазным комплексом и на конечном этапе окраски в растворе диаминобензидина (DAB) с субстратом, содержащим Н2О2. Зоны клеточных мембран или цитоплазмы, содержащие выявляемые антигены, окрашивались в «специфический» темно-коричневый цвет. Интенсивность такой окраски прямо пропорциональна количеству экспрессируемого маркера.
С помощью программного обеспечения Image J 1,42g (National institutes of Health, USA) определялась площадь, занимаемая коллагеновыми волокнами и сульфатированными гликозаминогликанами в области триад, образованных вокругдольковыми, междольковыми сосудами, стенках и окружении центральных вен, а так же площадь клеточных элементов экспрессирующих антимакрофагальный антиген и маркер пролиферации Ki-67. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «Statistica v.6»: рассчитывали средние величины (M) и их стандартные ошибки (m). Достоверность различий оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни при 95% уровне значимости.
Результаты и обсуждение
При изучении срезов печени, окрашенных гематоксилином Эрлиха и эозином, через 2 месяца после воспроизведения очага хронического воспаления обращало на себя внимание наличие участков как умеренного, так и значительного расширения синусоидных капилляров, в просвете которых часто выявлялись множественные эритроцитарные агрегаты. Центральные вены в большинстве долек были расширены, иногда значительно. В части из них отмечался стаз. Отдельные портальные тракты были инфильтрированы лимфо-и гранулоцитарными элементами. Встречались участки паренхимы с дистрофически измененными клеточными элементами. Цитоплазма таких гепатоцитов имела повышенное сродство к эозину, а ядра чаще были пикнотично изменены. Кроме того, здесь же выявлялись отдельные гепатоциты, ядра которых находились в состоянии рексиса или лизиса. В местах скопления дистрофически измененных гепатоцитов концентрировались лимфоидные элементы. В отдельных случаях при этом формировались временные лимфоидные образования.
На срезах печени, окрашенных пикрофуксином по Ван Гизону (табл. 1), отмечалось достоверное, по отношению к контрольной группе, увеличение площади, занимаемой коллагеновыми волокнами в области триад, образованных как мелкими (вокругдольковыми) сосудами, так и более крупными (междольковыми) сосудами. Было выявлено достоверное возрастание площади, занимаемой коллагеновыми волокнами в стенках и окружении центральных вен у животных 2-й группы по сравнению с контролем. Кроме того, на срезах печени, окрашенных альциановым синим, отмечалось достоверное увеличение площади сульфатированных гликозаминогликанов основного вещества соединительной ткани в области триад, образованных междольковыми сосудами. В то время, как достоверных различий между группами 1 и 2 в распределении хондроитинсульфатов в области триад, образованных более мелкими (вокругдольковыми) сосудами, не
отмечалось. Площадь сульфатированных гликозаминогликанов в стенках и окружении центральных вен была достоверно выше.
При исследовании тучноклеточной популяции на срезах, окрашенных альциановым синим при рН 1,25 с последующей докраской ядер кармалюмом Майера, а также после комбинированной окраски альциановым синим при рН 1,25 и метиловым зеленым с пиронином, было отмечено. Повышенное содержание в области портальных трактов тучных клеток, обладающих стимулирующим действием на фибробласты как в плане их пролиферации, так и коллагенообразования [6,7], что может служить фактором, приводящим в последующем к фиброзным изменениям. Тканевые базофилы, как правило, располагались в непосредственной близости от плазматических клеток, которые также, в отличие от интактных животных, выявлялись в области триад, что могло свидетельствовать о присоединении аутоиммунного компонента в развивающемся патологическом процессе.
Через 2 месяца после создания очага хронической инфекции, при оценке пролиферативной активности клеток с использованием антител к маркеру пролиферации было отмечено достоверное снижение площади клеточных элементов, экспрессирующих Ki-67 (табл. 2). Вместе с тем количество пролиферирующих фибробластов в зонах портальных трактов значительно возросло, что могло свидетельствовать о повышении риска фибротических осложнений.
При оценке пула клеток системы мононуклеарных фагоцитов в печени с использованием моноклональных антимакрофагальных антител к антигену, экспрессируемому на мембранах моноцитов/макрофагов (клон 1C7), было выявлено, что при персистенции фокальной инфекции отмечалось его достоверное увеличение (табл. 2). Согласно данным литературы, активированные макрофаги являются одним из главных факторов, под воздействием которого клетки Ито выходят из состояния покоя, превращаясь в миофибробласты, способные к выработке внеклеточного матрикса печени.
При изучении морфологической картины срезов печени, в аналогичный срок у группы с проведенным курсом светотерапии, отмечалось сохранение балочных структур и дольчатого строения органа. Центральные и поддольковые вены, в отличие от предыдущей группы, были свободными от форменных элементов, однако при этом отмечалась неравномерность сосудистой реакции: наряду с умеренно расширенными, отмечались неизмененные, а в отдельных дольках несколько спазмированные сосуды. Синусоидные капилляры в перипортальной и промежуточной зонах имели обычное строение, эритроцитарных агрегатов не встречалось. Полученные результаты свидетельствуют о нормализации микроциркуляции в дольках печени. Было обращено внимание, что дистрофические изменения паренхиматозных клеток значительно уменьшились. По сравнению с предыдущей группой распределение хроматина в гепатоцитах оказывалось более равномерным, характерным являлось выявление четко дифференцируемых 2-3 ядрышек. Как исключение в ядрах отмечалось смещение гранул хроматина по направлению к ядерной оболочке, а еще реже образование конгломератов, которые выявлялись на одном из полюсов ядра. Цитоплазма подавляющего большинства гепатоцитов умеренно воспринимала эозин, однако гранулярное ее строение при этом не всегда было четко выражено. В связи с улучшением микроциркуляции и уменьшением дистрофических изменений гепатоцитов скоплений лимфоидных элементов в дольках печени не отмечалось.
На срезах 2-й группы животных, окрашенных пикрофуксином по Ван Гизону, наблюдается достоверное по отношению к 1-й группе снижение площади коллагеновых волокон межклеточного вещества соединительной ткани в области триад, образованных как мелкими (вокругдольковыми), так и более крупными (междольковыми) сосудами. Также было выявлено достоверное, по отношению к группе без воздействия монохромным синим светом, снижение площади коллагеновых волокон в стенках и окружении центральных вен.
При изучении срезов, окрашенных альциановым синим при рН 1,0, обращено внимание на достоверно менее выраженное увеличение площади, занимаемой сульфатированными гликозаминогликанами в области междольковых портальных трактов и стенок центральных вен. Кроме того, у животных, у которых не проводилось воздействие монохромным синим светом, отмечалась менее интенсивное окрашивание указанных структур, что отражало понижение содержания в них сульфатированных гликозаминогликанов.
При изучении популяции тучных клеток, на срезах окрашенных альциановым синим при рН 1,25 с последующей докраской ядер кармалюмом Майера, и после комбинированной окраски альциановым синим при рН 1,25 и метиловым зеленым с пиронином, также как в группе без светового воздействия, было установлено возрастание количества мастоцитов в области портальных трактов по сравнению с интактными животными. Вместе с тем, обращено внимание на то, что в отличие от животных с хроническим воспалительным процессом, у которых не проводилось воздействие монохромным синим светом, плазматические клетки, обладающие активирующим воздействием на тканевые базофилы, в области триад не выявлялись. Вполне вероятно, что одной из причин отмеченного снижения концентрации сульфатированных гликозаминогликанов в портальных трактах и стенках центральных вен, может объясняться отсутствием стимулирующего влияния плазматических клеток на мастоциты, участвующие в ремоделировании матрикса соединительной ткани.
На фоне воздействия монохромным синим светом, при оценке пролиферативной активности клеток с использованием антител к маркеру пролиферации выявлялось достоверное увеличение площади клеточных элементов, экспрессирующих Ki-67, по сравнению с группой, где светотерапия не проводилась. Вместе с тем были получены данные, свидетельствующие о том, что воздействие синим светом приводило к снижению количества пролиферирующих фибробластов в области портальных трактов, что могло
отражать снижение риска фиброза печени, обусловленного наличием отдаленного очага хронического воспаления.
При оценке площади, занимаемой клеточными элементами с экспрессией белка, содержащегося на мембранах моноцитов/макрофагов (клон 1С7), было отмечено достоверное ее снижение.
Таким образом, морфологические изменения печени крыс при наличии отдаленного очага хронического воспаления на фоне общего воздействия монохромным синим светом свидетельствовали об улучшении микроциркуляции в печени, уменьшении застойных явлений в системе печеночных вен, что привело к значительно менее выраженным дистрофическим изменениям гепатоцитов. Это способствовало тому, что воспалительная реакция на повреждающий фактор и гибель паренхиматозных клеток были минимальными. Количество макрофагальных элементов, способных активировать звездчатые клетки, с последующей их трансформацией в миофибробласты, не было повышено. Кроме того, на фоне воздействия монохромным синим светом, в портальных трактах практически не встречались плазматические клетки, что могло отражать уменьшение аутоиммунного компонента воспаления. Несмотря на то, что было выявлено повышенное содержание тучных клеток в области триад, отмечалось снижение концентрации сульфатированных гликозаминогликанов в портальных трактах и стенках центральных вен. Это можно объяснить отсутствием активирующего влияния плазматических клеток на мастоциты, участвующие в ремоделировании матрикса соединительной ткани и снижением количества пролиферирующих фибробластов. Отмеченные выше изменения могут способствовать уменьшению риска развития фиброза печени.
INFLUENCE OF MONOCHROMATIC BLUE LIGHT ON THE LIVER MORPHOLOGY AND EXPRESSION OF MARKERS PROLIFERATION AND MONONUCLEAR PHAGOCYTES AT PRESENCE OF DISTANT NIDUS OF
CHRONIC INFLAMMATION
I. O. Marinkin, I. P. Zhurakovsky, M. G. Pustovetova, S. A. Arkhypov, T. A.
Kunts, M.V. Bitkhaeva
Novosibirsk State Medical University
Abstract. The experiment was conducted at 18 adult Wistar male rats, at 12 of which with the help of Staphylococcus aureus was created a nidus of chronic infection in the tibia. The first group was consisted of animals without influence of monochromatic blue light, the second - the animals, which had the course of light therapy during 14 days in the morning. As a control was material from 6 intact animals. The revealed morphological changes after using monochromatic blue light showed improvement of microcirculation in the liver; less expressed degenerative changes in hepatocytes; reducing of inflammatory reaction; reducing the number of proliferating fibroblasts in portal tracts; reduction the concentration of sulfated glycosaminoglycans in the triads area and central veins walls.
Key words: blue light, the liver, chronic inflammation, mononuclear phagocytes
Литература
1. Бухарин О.В. Значение персистенции бактериальных патогенов для клинической практики // Рос. медиц. вести. - 2000. - Т. V, №3. - С. 18-25.
2. Векшин Н.Л. Фотоника биологических структур / Н.Л. Векшин.-Пущино НЦБИ, 1988. - 163 с.
3. Карандашов В.И., Петухов Е.В., Зродников В.С. Фототерапия. Руководство для врачей. - М.: Медицина, 2001. - 392 с.
4. Карпин В.А. Общая теория патологии: хронический инфекционный процесс // Успехи современного естествознания. - 2005. - № 4. - С. 17-20.
5. Пекарева Н.А., Трунова Л.А., Белоусова Т.В. и др. К вопросу об активности иммуновоспалительного процесса у детей с хроническим пиелонефритом в стадии клинической ремиссии // Бюл. СО РАМН. - 2008. -Т. 131, №3. - С.52-55.
6. Berton A., Levi-Schaffer F., Emonard H. et al. Activation of fibroblasts in collagen lattices by mast cell extract: a model of fibrosis // Clin. Exp. Allerg. -2000. - Vol.30. - Р. 485-492.
7. Garbuzenko E., Nagler A., Pickholtz D. et al. Human mast cells stimulate fibroblast proliferation, collagen synthesis and lattice contraction: a direct role for mast cells in skin fibrosis // Clin Exp Allergy. - 2002. - Vol.32. -P. 237-246.
8. Garbuzenko E., Berkman N., Puxeddu I. et al. Mast cells induce activation of human lung fibroblasts in vitro // Exp. Lung Res. - 2004. - Vol.30. -P. 705-721.
© КОЗЛОВА М.Б., ФРАНЦИЯНЦ Е.М., ДЖАБАРОВ Ф.Р., РОЗЕНКО Л.Я., КОЛЫЧЕВА Е.В.
УДК 612.4:611.21+611.329-006.6
ТИРЕОИДНЫЙ И ГЛЮКОКОРТИКОИДНЫЙ СТАТУС БОЛЬНЫХ РАКОМ НОСОГЛОТКИ: ОСОБЕННОСТИ ДИНАМИКИ ПОД ВЛИЯНИЕМ ХИМИОЛУЧЕВОЙ И ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ
М.Б. Козлова, Е.М. Франциянц, Ф.Р. Джабаров, Л.Я. Розенко, Е.В. Колычева
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, директор -
д.м.н., проф. О.И. Кит.
Резюме. У больных раком носоглотки выявлены значительные нарушения ти-реоидной и глюкокортикоидной функций. Проведена сравнительная оценка влияния на динамику гормональных показателей двух вариантов противоопухолевого лечения - разработанного метода аутомиелохимиолучевой терапии (АМ-ХЛТ) и традиционной ДГТ. Лечение сопровождалось как однотипными при обоих вариантах изменениями уровней гормонов (снижением концентрации общего Т3 и ТТГ и, в ряде случаев, резкой гипокортизолемией), так и характерными только для АМХЛТ ( нормализацией уровня свободного Т3, более ранней нормализацией общего Т4 , менее выраженным снижением секреции ТТГ). Ключевые слова: рак носоглотки, гормоны, аутомиелохимиолучевая и лучевая терапия.
Козлова Маргарита Борисовна - к.б.н., ст.н.с. гормональной лаборатории ФГБУ «РОСТОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ»; e-mail: super. [email protected].
Франциянц Елена Михайловна - д.б.н., проф., зав. гормональной лабораторией ФГБУ «РОСТОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ»; e-mail: [email protected].
Джабаров Фархад Расимович - д.м.н., зав. отделением лучевых методов лечения ФГБУ «РОСТОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ»; e-mail: [email protected].
По данным литературы, рак носоглотки в общей структуре онкологической патологии составляет 0,1-3%, а среди злокачественных новообразований глотки - 50%. Подавляющее большинство больных с данной локализацией процесса (90-95%), на момент первичного обращения, имеют III-IV стадию заболевания, а у 80% диагностируются регионарные метастазы [2,7].
В связи с анатомическими особенностями носоглотки лечебная тактика в отношении этой категории пациентов не включает хирургическое вмешательство, а ограничивает противоопухолевые мероприятия только лучевой или хи-миолучевой терапией. Это значительно повышает требования к их эффективности и делает актуальными как разработку новых схем и режимов лучевого воздействия и способов введения химиопрепаратов, так и детальное изучение особенностей их влияния на статус жизненно важных систем организма.
Развитие злокачественного процесса сопровождается разнообразными сбоями в функционировании всех регуляторных систем, в том числе и многих подсистем нейроэндокринной системы [3,4,6]. Проводимые противоопухолевые мероприятия, в свою очередь, также способны в разной степени изменять функциональное состояние отдельных эндокринных структур. Особое значение это имеет в тех случаях, когда подобное воздействие проявляется в отношении желез, продуцирующих биорегуляторы полифункционального назначения, каковыми являются, в частности, гормоны щитовидной железы и коры надпочечников, контролирующих состояние всех метаболических процессов в организме, обеспечивающие поддержание общего гомеостаза и развитие адаптационных реакций, обладающие многочисленными физиологическими эффектами, а
также способные влиять на такие связанные с опухолевым ростом события, как скорость пролиферации и апоптоз [1,8]. Системные нарушения уровня подобных биоактивных соединений могут быть одним из факторов, в определенной мере влияющих и на результаты лечения.
Рак носоглотки, в отличие от часто встречающихся локализаций злокачественного процесса, крайне недостаточно изучен как в отношении сопутствующего его развитию функционального статуса различных нейроэндокринных звеньев, так и в плане влияния лечебного процесса на динамику системных гормональных показателей. В то же время при локализации опухоли в носоглотке риск возникновения гормональных сбоев может возрастать в связи с близостью облучаемой области к центральным эндокринным структурам, регулирующим активность периферических звеньев нейроэндокринной системы.
На основании вышеизложенного целью работы было исследование у больных раком носоглотки состояния тиреоидной и глюкокортикоидной функций и сравнительная оценка влияния на гормональный статус больных разработанного в институте способа аутомиелохимиолучевой терапии (АМХЛТ) и традиционной дистанционной гамма-терапии (ДГТ).
Материалы и методы
Гормональный гомеостаз был исследован у 27 больных раком носоглотки обоего пола с Ш-1У стадией заболевания (Т 1-4К 0-зМ0). Возрастная медиана составляла 59,7±2,1 лет. По гистологической структуре опухоли были представлены преимущественно недифференцированным раком носоглоточного типа (59,3%).
Основным методом лечения для всех больных являлась методически аналогичная дистанционная гамматерапия в режиме ускоренного гиперфракционирования (1,5Гр+1,5 Гр на первом этапе и 1,3+1,3 Гр на втором этапе) с расщеплением курса облучения и 2х недельным перерывом до СОД = 65,0±5,2 Гр (ВДФ = 106,0 ед.) на зону первичного очага. На шейный л/коллектор облучение проводилось по одному сеансу в день РОД = 2,4 Гр в дни облучения носоглотки до СОД = 50-60 изо Гр. 15 из наблюдаемых пациентов составили основную
группу, которым дополнительно к лучевой терапии проводилась аутомиелохи-миотерапия [5]. Цисплатин (100 мг/м ), инкубированный с аутокостномозговой взвесью, вводили внутривенно капельно до начала лучевого лечения и в середине планового двухнедельного перерыва. Параллельно больным проводилась полихимиотерапия с введением 5-фторурацила (1000 мг/м ) в дни введения цисплатина, блеомицин (30 мг/м ) вводили однократно во время планового перерыва. 12 больных были включены в контрольную группу, которая получала только ДГТ по аналогичной схеме.
Гормональные исследования проведены радиоиммунным методом с использованием стандартных тест-наборов фирмы «Иммунотех» (Чехия). В крови больных до начала лечения, на его этапах (после 1-го и 2-го этапа) и через 30 дней после лечения определяли содержание общего и свободного тироксина (Т4), общего и свободного трийодтиронина (ТЗ), тиреотропина (ТГГ) и кортизо-ла. Контролем служила группа практически здоровых лиц аналогичного возраста и пола (23 человека).
Полученные результаты обработаны статистически параметрическим методом Стьюдента с применением компьютерной программы «^айБйса у.6,0». Достоверность различий между сравниваемыми показателями оценивали по 1;-критерию. Нулевая гипотеза отвергалась при значениях р<0,05-0,001; при значениях р>0,05, но меньше 0,1 указывали на достоверную тенденцию к отличию показателей (Т).
Результаты и обсуждение
Исследование исходных уровней циркулирующих в крови гормонов выявило у больных ряд значительных нарушений гормонального гомеостаза.
На центральном нейроэндокринном уровне развитие патологии сопровождалось существенным подавлением ТТГ-секретирующей функции гипофиза со статистически достоверным снижением концентрации ТТГ в крови в 1,7 раза (табл.1).
Одновременно с этим у больных было нарушено равновесие в системе общий Т4 - свободный Т4 за счет повышенного содержания общей фракции гор-
мона (в 1.3 раза) при выраженной недостаточности его биологически активной свободной формы (ниже нормы в 1.4 раза). Сбой физиологического равновесия обнаружен также в системе общий Т3 - свободный Т3: в крови пациентов был значительно повышен (в 1.6 раза) уровень активной фракции Т3 на фоне нор-мальношо содержания общего Т3. Учитывая, что все эффекты тиреоидных гормонов опосредуются в клетках-мишенях свободными формами, обнаруженные изменения их уровней могут вести к нарушению многочисленных процессов, находящихся под их регуляторным влиянием.
Таблица 1
Содержание тиреоидных гормонов и кортизола в крови больных раком носоглотки
до лечения и на его этапах
Гормоны, ед. Здоровые Больные
До лечения после 1 -го этапа лечения после 2-го этапа лечения через 1 месяц после лечения
Т4 общий , нмоль/л 124,67±5,30 161,67±15,92: 117,25±13,612 110,0±12,892 120,0±8,672
165,0±16,17 15 126,67±21,88
Т4 свободный, пмоль/л 17,0±1,39 11,88±0,72: 8,88±1,781 11,50±1,291 16,0±2,603
9,95±0,92: 10,67±0,67:
Тз общий, нмоль/л 2,11±0,12 2,24±0,38 1,37±0,251,2 0,60±0,111А3 1,55±0;091,2,4
1,40±0,221Д2 1,37±0,201,2,5
Тз свободный, пмоль/л 3,90±0,29 6,35±0,78: 3,87±0,512 3,70±0,172 5,70±0,401,3,4
5,71±0,4815 5,20±0,211,5
ТТГ, цМЕ/л 1,81±0,19 1,07±0,25: 0,73±0,131 1,16±0,0713 1,08±0,121Т3
0,79±0,131 0,74±0,081,5
Кортизол, нмоль/л 342,31±17,36 515,0±57,95: 585,17±57,371 (n12) 48,0±6,1112 (пЗ) 580,0±49,111(п12) 51,60±7,1712(п3) 565,0±44,451 49,51±5,16
430,0±36,0315(п8) 50,0± 4,9612(п4) 640,0±61.1713(п8) 36,0±2,3112(п4)
Примечание: статистически достоверное отличие от показателя 1 - у здоровых людей; 2 -до начала лечения; 3 - после 1-го этапа лечения; 4 - после 2-го этапа лечения; 5 - после аналогичного этапа АМХЛТ. Т - тенденция к изменению. Больные после лечения: верхняя строка - показатели в основной группе, нижняя - в контрольной группе.
Реакция надпочечников на злокачественный процесс выражалась повышением кортизолпродуцирующей функции с полуторократным увеличением уровня циркулирующего гормона. Известно, что активация коры надпочечников является одной из приспособительных реакций, поддерживающих резистентность организма. Однако длительное гиперактивное состояние может вес-
ти к истощению синтетических возможностей кортикоцитов и к развитию отрицательного влияния повышенной концентрации кортизола на активность иммунной системы, что имеет особое значение у больных с онкопатологией.
АМХЛТ вызывала у больных неоднозначные изменения гормонального го-меостаза. Так, уровень в крови общего Т4 уже после 1-го этапа полностью нормализовался и оставался на уровне физиологической нормы и после 2-го этапа, и через месяц после окончания лечения. Следует отметить, что снижение до нормы его исходно высокой концентрации происходило на фоне отсутствия достоверных изменений в содержании ТТГ, секреция которого на всех этапах исследования, особенно после 1-го этапа, была значительно подавлена. Это свидетельствует, вероятно, о том, что в изменении общего уровня циркулирующего Т4 у больных ведущая роль принадлежала не механизму отрицательной обратной связи, являющегося у здоровых людей основным фактором, регулирующим функциональные взаимоотношения в звене гипофиз - щитовидная железа. В отличие от общего Т4, концентрация свободной формы гормона в процессе лечения оставалась, как и до его начала, сниженной, однако через 30 дней ее уровень в крови также нормализовался.
В динамике содержания общего Т3 под влиянием АМХЛТ была выявлена иная направленность - его исходно нормальная концентрация после 1-го курса лечения существенно снизилась (в 1,6 раза) и в еще большей степени (в 2,3 раза) она уменьшилась под влиянием дальнейшего лечебного воздействия. Через месяц после лечения уровень общего Т3 у больных основной группы имел направленность к повышению, однако его нормализации в течение этого срока не произошло. Поскольку главным источником циркулирующего Т3 являются различные ткани организма, в которых осуществляется дейодирование Т4, снижение уровня в крови общего Т3 свидетельствует о выраженном ингибирующем влиянии данного вида лечения на тканевой метаболизм тироксина. Содержание свободного Т3, напротив, снизилось до нормы после 1 -го этапа и не подвергалось изменению после 2-го, однако спустя месяц вновь был отмечен его статистически достоверный рост.
Реакция на лечение кортизолобразующей функции коры надпочечников у пациентов основной группы имела резко различающийся индивидуальный характер. В подавляющем большинстве случаев (12) уровень кортизола на всех исследованных этапах достоверно превышал норму в среднем в 1,7 раза, однако у 3 больных он резко снижался уже после 1-го этапа лечения и по сравнению с исходным показателем (в 9,6 раза), и по сравнению со здоровыми людьми (в 7,1 раза). На низком уровне содержание кортизола в крови сохранялось у этих пациентов и в дальнейшем.
У больных контрольной группы исследования были проведены после 1-го и 2-го этапов лечения. Сравнение полученных данных с показателями у пациентов основной группы позволили выявить как однонаправленные, так и отличающиеся изменения гормонального статуса. Так, 2-й этап лечения при обоих вариантах терапии завершался нормализацией высокого фонового содержания в крови общего Т4, сохранением исходно сниженного уровня свободного Т4 и повышенной у большинства обследованных кортизолообразующей функции надпочечников, а также снижением в результате лечения исходно нормальной концентрации общего Т3 и резким падением в ряде случаев уровня кортизола (у 3 больных основной группы и у 4 - контрольной). При этом у больных контрольной группы, в отличие от получивших комплексное лечение, была в большей степени снижена секреция ТТГ, в меньшей степени подавлялась продукция общего Т3 и не происходило нормализации уровня его свободной формы. АМХЛТ по сравнению с ДГТ сопровождалась более ранней (уже после 1-го этапа лечения) нормализацией исходно высокого уровня общего Т4.
При оценке влияния обоих видов лечения на динамику гормональных показателей обратил на себя внимание факт неоднозначного изменения глюкокорти-коидного статуса больных, проявившегося резким снижением у части пациентов уровня циркулирующего кортизола. В ходе дальнейшего наблюдения за 12 из пролеченных обоими видами терапии больных было установлено, что у 7 пациентов с возникшей на фоне лечения выраженной гипокортизолемией через 2-7 месяцев после его окончания отмечалась генерализация процесса, в то время как
у 5 больных, у которых концентрация гормона в ходе лечения оставалась повышенной, признаки прогрессирования заболевания отсутствовали в течение 14-25 месяцев. Полученные результаты свидетельствуют о том, что недостаточная кортизолпродуцирующая активность надпочечников является одним из значимых сбоев гормонального гомеостаза, сочетающихся, независимо от варианта противоопухолевой терапии, с меньшей продолжительностью бессимптомного периода. Это указывает на целесообразность включения в схему ведения больных раком носоглотки повторных определений в процессе лечения уровня кор-тизола в крови с целью его возможной своевременной коррекции, направленной на улучшение результатов лечения.
Таким образом, обобщая в целом результаты проведенного исследования, можно заключить, что далеко зашедшие стадии развития рака носоглотки сопряжены с существенными нарушениями у больных тиреоидной и глюкокорти-коидной функций. АМХЛТ и ДГТ вызывали в основном однонаправленные изменения исходного гормонального статуса. Это позволило рассматривать лучевое воздействие в качестве основного повреждающего гормональный гомеостаз фактора, тогда как его сочетание с АМХТ наряду с более высокой эффективностью [5], способствовало развитию менее выраженных нарушений секреции ТТГ, нормализации содержания свободного Т3 и более ранней по сравнению с ДГТ нормализацией общего Т3.
THYROID AND GLUCOCORTICOID STATUS IN PATIENTS WITH NASO-PHARYNGEAL CANCER: FEATURES OF THE DYNAMICS UNDER THE INFLUENCE OF CHEMO- AND RADIOTHERAPY
M.B. Kozlova, E.M. Frantsiyants, F.R. Dgabarov, L.Ya. Rozenko, E.V. Kolycheva
Federal State Institution "Rostov Cancer Research Institute" Ministry of Health and
Social Development of Russian Federate Abstract. 1п patients with nasopharyngeal cancer were revealed significant alteration in thyroid and glucocorticoid functions. It was made a comparative evaluate of the impact on the dynamics of the hormonal parameters of two variants in antitumor treatment - developed method automielochemoradiation therapy (AMCRT) and traditional DHT . The treatment was accompanied by the same type in both cases changes in hormone levels (decrease of the concentration of total T3 and TSH and, in some cases, a sharp hypocortizolemia), and typical only to AMCRT (normalization
of the free T3 level, an earlier normalization of the total T4, less pronounced decrease in the secretion of TSH .)
Key words: nasopharyngeal cancer, hormones, automielochemoradiation and radiation therapy
Литература
1. Абдувалиев А. А., Гильдиева М.С., Саатов Т.С. Тироксиновая регуляция пролиферации эстроген- и прогестеронотрицательнеых клеток рака молочной железы. // Рос. онкол. журн. - 2006. - №2. - С. 15-18.
2. Белоусова Н.В., Поддубный Б.К., Унгадзе Г.В. и др. Современная диагностика рака носоглотки // Соврем. онкол. - 2000. - Т. 2, № 3. - С. 3-11.
3. Берштейн Л.М. Онкоэндокринология: традиции, современность и перспе-тивы. СПб.: Наука, 2004. - 343 с.
4. Козлова М.Б., Верещак М.А., Кашубина М.В. и др. Физиологически активные соединения и хирургический стресс: динамика содержания в крови больных с абдоминальными опухолями при анестезии на аутокрови // Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической онкологии. М., 2006. - С. 249-254.
5. Колычева Е.В., Джабаров Ф.Р. Непосредственная эффективность химио-лучевого лечения местно-распространенного рака носоглотки. //Сиб. онкол. журн. - 2009. - №1. - С.101-102.
6. Сидоренко Ю.С., Козлова М.Б., Айрапетов К.Г., Франциянц Е.М. Влияние метастатической болезни мозга на состояние тиреодной и глюкокортикоид-ной функций у онкологических больных // Вестн. Южн. Научн. Центра. - 2007. - Т.3. № 1. - С. 67-73.
7. Чиссов В.И., Старинский В.В., Ременник Л.В. Злокачественные новообразования в Российской Федерации в 2003 г. (Заболеваемость и смертность). -М., 2004. - С. 3-128.
8. Lissoni P., Messina G., Balestra A. et al. Efficacy of cancer chemotherapy in relation to synchronization of cortisol rhythm, immune status and psychospiritual profile in metastatic non-small cell lang cancer/ // In vivo. - 2008. - T. 22, № 2. - P. 257262.
© ДОМЕ С.В.
УДК 543.552.054.1
ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ L-ТИРОКСИНА
С.В. Доме
Новосибирский государственный медицинский университет, ректор -
д. м. н., проф. И.О. Маринкин, кафедра фармацевтической химии, зав. -
д.фарм. н., проф. Е.А. Ивановская.
Резюме. Цель данной работы - разработка методики количественного определения L-тироксина в модельном растворе и индивидуальном препарате с помощью инверсионной вольтамперометрии. Для этого исследовали рабочие условия вольтамперометрического поведения L-тироксина, а именно оценили влияние различных факторов (потенциал накопления, время накопления, скорость развертки, природы фонового электролита) на потенциал и величину тока восстановления тироксина. Объект исследования - L-тироксин («Sigma», Италия). В результате выполнения работы определены рабочие характеристики количественного определения L-тироксина в модельном растворе и монопрепарате.
Ключевые слова: вольтамперометрия, L-тироксин.
Доме Сергей Владимирович - преподаватель каф. фармацевтической химии НГМУ; e-mail: [email protected].
L-тироксин - гормон щитовидной железы, который образуется под контролем тиреотропного гормона. Регулирует практически все процессы обмена, прямо или опосредованно. По химической структуре представляет
собой Ь-2-амино-3-[4-(3,5-дийод-4-гидрокси-фенокси)-3,5-дииодфенил] пропионовую кислоту.
На сегодняшний день в контроле качества лекарственного препарата Ь-тироксин (далее - тироксин) для количественной оценки его содержания используется высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [3]. Этот метод является длительным и трудоемким (экстракция лекарственного вещества из таблетки - около двух часов) с применением таких ядовитых и токсичных веществ как ацетонитрил и метанол [1].
Кроме этого классического метода, в научной литературе встречаются упоминания об электрохимических способах определения тироксина в модельных растворах с использованием различных типов электродов (ртутный капающий, графитовый, модифицированный графитовый, стеклоуглеродный электроды). Однако эти разработки в большинстве своем обладают чисто научным характером, имеющим своей целью развитие физической электрохимии, изучение поведения Ь-тироксина при использовании того или иного электрода [2,3,4]. Методики, имеющие практическое значение, как правило, опираются на предварительную хроматографическую очистку пробы с применением как самых простых вариантов колоночной хроматографии, так и ВЭЖХ со спектральной детекцией.
В мире уже были попытки разработать методику количественного определения тироксина методами вольтамперометрии и полярографии. Имеются данные о количественном определении тироксина в моче катодной квадратно-волновой вольтамперометрией после
предварительного выделения методом ВЭЖХ на ртутно-капающем электроде [5]. В этой же статье упоминается об использовании ионно-обменной хроматографии для разделения иодидов, тетрайодтиронина и трийодтиронина в фармацевтических препаратах с дальнейшим количественным определением методом дифференциально-импульсной полярографией. На электроде происходило восстановление тироксина, в
реакции участвовало восемь электронов и восемь протонов, йод в тироксине замещался на водород:
ЯШ + Н+ + 2ё ^ ЯН + На1-Китайские ученые в процессе разработки новых модифицированных цетилтриметиламмония бромидом вращающихся графитовых и стеклоуглеродных электродов на основе нанотехнологий количественно определяли тироксин в модельных растворах. В данном случае, тироксин взаимодействовал с цетилтриметиламмонием бромидом и отщеплял два атома иода, в реакции участвовали четыре электрона. М. Г№ашо1;о е1 а1. исследовали восстановление тироксина на серебряном электроде и пришли к выводу, что этот процесс протекает в одну стадию, в то время как на ртутно-капающем происходит в несколько стадий [6]. Необходимо отметить, что китайскими учеными был выяснен механизм окисления Ь-тирозина на модифицированных, но стеклоуглеродных электродах в процессе определения методом квадратно-волновой вольтамперометрией:
Цель исследования - разработка методики количественного определения Ь-тироксина в модельном растворе и индивидуальном препарате с помощью инверсионной вольтамперометрии.
Материалы и методы Объект исследования - Ь-тироксин, относится к производным аминокислот и имеют следующую структуру Ь-2-амино-3-[4-(3,5-дийод-4-гидрокси-фенокси)-3,5-дииодфенил] пропионовая кислота. Молекулярная масса тироксина 776,87 г/моль.
Использовали вольтамперометрический анализатор ТА-4 (Россия) (ОАО НПП «Томьаналит», Томск, Россия). В двухэлектродной ячейке индикаторным электродом служил ртутно-пленочный (пленка ртути, нанесенная электрохимически на отшлифованную серебряную подложку,
закрепленную во фторопласте), электродом сравнения - хлорид-серебряный. Для деаэрирования и перемешивания раствора использовали азот с содержанием кислорода не более 0,001%. Стандартный раствор 2х10-1 мг/л готовили из субстанции L-тироксина («Sigma», Италия) растворением точной навески в 0,01 М NaOH. Стандартные растворы меньшей концентрации получали последовательным разбавлением исходного раствора.
Статистическую обработку результатов исследования проводили в соответствии с требованиями Государственной фармакопии (ГФ) [1].
Результаты и их обсуждение
Выбор ртутно-пленочного электрода в качестве индикаторного обусловлен способностью органических соединений образовывать со ртутью устойчивые или малорастворимые соединения. Еще одним преимуществом такого электрода является возможность получения более четкого аналитического сигнала тироксина, служащего количественной характеристикой определяемого вещества, что повышает разрешающую способность метода. Тироксин легко адсорбируется на рабочей поверхности ртутно-пленочного электрода, что позволяет концентрировать его на рабочем электроде.
В качестве фоновых электролитов были исследованы растворы солей KCl, NaCl, NH4NO3, KNO3, NH2PO4, N2SO4, N2CO3 и NaOH, боратные буферы (рН=8-11). Исходя из полученных результатов, в качестве фонового электролита был выбран боратный буфер с рН=10, так как при его использовании на вольтамперограмме наблюдалась четкая волна восстановления тироксина. Кроме того, данный раствор обеспечивал широкую рабочую область, хорошую электропроводность и необходимую площадь для обработки сигнала. В кислой среде при подобранных условиях сигнал тироксина отсутствовал, а в нейтральной и слабощелочной - резко сужалась рабочая область и возрастала величина остаточного тока, при этом невозможно было зафиксировать высоту волны
тироксина. Результаты эксперимента показали, что оптимальным решением является электролиз без добавления дополнительных электролитов. На вольтамперограмме наблюдается четкий пик при - 0,18В (рис. 1).
Рис. 1. Вольтамперограмма тироксина на фоне 0,05 М боратного буфера, рН=10, ЕН=-1,8В, стир (х10-8) М: 1 - 0; 2 - 2; 3 - 4.
Оптимальным потенциалом концентрирования экспериментально подобран -1,8 В (рис. 2). При повышении значения потенциала концентрирования появлялся дополнительный пик в области -0,6 - -0,4 В. Основной же пик тироксина при 0,18В становился искаженным и практически нерегистрируемым, также снижалась величина аналитического сигнала.
Рис.2. Зависимость силы тока от потенциала накопления в модельном растворе.
Условия определения: фон - боратный буфер (рН=10); иэ - 150 сек.; wр - 50 мВ/с; концентрация тироксина в ячейке - 2 ■ 10-2 мг/л.
Для определения оптимального времени электролиза, с целью получения более выраженного сигнала, была апробирована область значений данного показателя от 20 до 240 сек. Высота сигнала возрастала пропорционально времени пропускания до 150 сек, при этом достигалось максимальное значение величины тока растворения накопленных осадков с поверхности ртутно-пленочного электрода и хорошая воспроизводимость результатов. При времени накопления менее 150 сек величина тока растворения не достигала максимального значения, что снижало чувствительность определения исследуемого вещества. При увеличении времени накопления более 150 сек происходило насыщение осадка на электроде, аналитический сигнал тироксина искажался и затруднялась обработка вольтамперограмм (рис.3)
Рис. 3. Зависимость силы тока от времени накопления в модельном растворе.
Условия определения: фон - боратный буфер (рН=10); Еэ - (-1.800); wр - 50 мВ/с; концентрация тироксина в ячейке - 2 ■ 10-2 мг/л.
Наряду с имеющимися параметрами экспериментальным путем была определена рациональная скорость развёртки потенциала, равная 50 мВ/с, при замедлении или ускорении которой границы аналитического сигнала становились нечёткими, что затрудняло обработку поляризационных кривых (рис.4).
Рис.4. Зависимость силы тока от скорости развертки в модельном растворе
Условия определения: фон - боратный буфер (рН=10); Еэ - (-1.800); и - 150 сек; концентрация тироксина в ячейке - 2 ■ 10 2 мг/л
Таким образом, в результате проведённых исследований была установлена способность и подобраны рациональные условия концентрирования тироксина на поверхности ртутно-пленочного электрода, сопровождающиеся регистрацией сигнала вещества на вольтамперограмме.
Зависимость величины силы тока от логарифма концентрации тироксина
в водных растворах имела прямолинейный характер в интервале
8 2
концентраций 2х10 -2х10 мг/л (рис.5), следовательно, в данном диапазоне концентраций аналитический сигнал прямо пропорционален концентрации.
Рис. 5. Зависимость величины силы тока от логарифма концентрации тироксина.
Правильность методики определяли методом «введено-найдено». Статистическая обработка полученных результатов, представленная в табл. 1, показывает, что относительная ошибка методики в модельном растворе не превышает 3,03%.
Таблица 1
Результаты теста «введено-найдено» при количественном определении тироксина в модельном растворе (п=10, /=9, Р=0,95; 0,05М боратный буфер,
ЕН=-1,8В)
Полученные условия методики определения тироксина в модельном растворе адаптировали на таблетки. Вначале необходимо избавиться от содержащихся в них вспомогательных веществ.
Для этого, согласно государственной фармакопее XI издания [3], 20 таблеток растирали в ступке. Полученный порошок растворяли в 200 мл 0,01 М раствора гидроксида натрия при перемешивании магнитной мешалкой в течение 10 мин. Раствор фильтровали, фильтрат переносили в мерную колбу на 1л. Доводили объем жидкости до 1 л 0,01 М раствором гидроксида натрия. Отбирали 1 мл полученного раствора, переносили в мерную колбу и доводили объем до 1 л (также раствором гидроксида натрия). Процедуру повторили еще раз. Из полученного раствора вновь отобрали 1 мл и перенесли в мерную колбу на 10 мл, объем довели до метки водой. Затем провели измерение с теми же параметрами как и в модельном растворе. Метрологические характеристики методики, адаптированной на лекарственный монопрепарат представлены в табл. 2 и 3, из которых видно, что ошибка определения тироксина в лекарственном препарате составляет 1,82%.
Таблица 2
Результаты теста «введено-найдено» количественного определения тироксина в препарате (n=10, f=9, Р=0,95; 0,05Мборатный буфер, Ен=-1,8В)
Таблица 3
Расчет относительной ошибки методики при определении тироксина в лекарственном препарате.
Правильность разработанной методики оценивали методом «введено-найдено» с добавлением стандартного раствора. Погрешность анализа рассчитывали в соответствии с государственной фармакопеей [1].
Таким образом, экспериментально определены оптимальные условия электролиза: состав и рН фонового электролита; потенциал и время пропускания азота; границы и скорость развёртки потенциала. На основе разработанной методики подобраны оптимальные условия определения тироксина в лекарственном препарате.
VOLTAMMETRIC QUANTITATIVE DETERMINATION OF L-THYROXINE
S.V. Dome
Novosibirsk State Medical University
Abstract. The aim of this work - the development of method of quantitative determination of
L-thyroxine in the model solution and individual preparation with the help of inversion voltammetry. For this purpose the operating conditions of voltammetric behavior of L-thyroxine were investigated, namely, evaluated the influence of various factors (potential of accumulation, the period of accumulation, sweep rate, the nature of the supporting electrolyte) on the potential and magnitude of the current of thyroxine recovery. The object of study - L-thyroxine («Sigma», Italy). As a result of the work were defined the characteristics of the quantitative determination of L-thyroxine in the model solution and monotherapy.
Key words: Voltammetry, L-thyroxine.
Литература
1.Государственная фармакопея СССР. XI издание. - М.: Медицина, 1987. - Вып. I. - Общие методы анализа. - 337 с.
2. Органическая электрохимия: Кн.1. / Под ред. М. Бейзера и Х. Лунда. - Пер. с англ. - М.: Химия, 1988. - 469 с.
3.Hernlindez L., Hernhdez P., Nieto O. Determination of Thyroxine in Urine by Cathodic Stripping Square-wave Voltammetry // Analyst. -1994. - Vol. 119. - P.1579-1583.
4. Iwamoto M., Webber A., Osteryoung R.A. Cathodic Reduction of Thyroxine and Related Compounds on Silver // Anal. Chem. - 1984. -Vol.56. - P. 1202-1206.
5.Kazemifard A.G., Moore D.E., Aghazadeh A. Identification and quantitation of sodium-thyroxine and its degradation products by LC using electrochemical and MS detection // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2001. - Vol. 25, № 5-6. - Р. 697-711.
6. Wang F., Fei J., Hu S. The influence of cetyltrimethyl ammonium bromide on electrochemical properties of thyroxine reduction at carbon nanotubes modified electrode // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. - 2004. - Vol.39, № 1-2. - P. 95-101.
