CC BY
17
УДК 616.379 - 008.64:616.3-004.6:002.6:681.3 DOI: http://doi.org/10.30978/CEES-2019-4-62
Исследование диагностической значимости
длины теломер и активности теломеразы у пациентов с церебральным атеросклерозом и сахарным диабетом 2-го типа
М. С. Егорова 1, Д. С. Красненков 2, В. Г. Гурьянов 3, В. Е. Кондратюк 3, Н. Д. Тронько 1
' ГУ«Институт эндокринологии и обмена веществ имени В. П. Комиссаренко НАМН Украины», Киев
2 ГУ «Институт геронтологии имени Д. Ф. Чеботарева НАМН Украины», Киев
3 Национальный медицинский университет имени А. А. Богомольца, Киев
Цереброваскулярные заболевания — одна из важнейших причин заболеваемости и смертности среди взрослого населения. Наиболее часто основой поражения сосудистой системы мозга, приводящей к развитию острых и хронических форм нарушений мозгового кровообращения, является генерализованный атеросклероз [7]. Сахарный диабет (СД) сопровождается ускоренными изменениями сосудов, что делает его также ведущей причиной сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и смертности. Ключевые звенья данных изменений — гипергликемия, инсулинорезистент-ность, накопление конечных продуктов гликирования. Гиперинсулинемия и гипергликемия, как и физиологическое старение, активируют процессы хронического воспаления и оксидантного стресса [6, 8]. В стареющем организме, как и в организме пациентов с СД, повышаются уровни различных маркеров воспаления и активность пероксидного окисления липидов. Все это приводит к нарушению синтеза белков, апоптозу клеток и развитию дегенеративных процессов [8].
Одной из причин разной скорости старения сердца и сосудов у пациентов с СД 2-го типа является изначально разная генетическая защищенность от воздействия внешних факторов. Длину теломер (ДТ) и активность теломеразы можно рассматривать как
генетические маркеры биологического возраста сосудов. Теломеры — это концевые участки линейной молекулы ДНК, постепенно укорачивающиеся при каждом делении клеток. Как только длина тело-мерной ДНК становится угрожающе низкой, запускается Р53/Р21 — индуцированное старение клетки при сохранении ее метаболической активности [2, 11]. Имеются данные, что ДТ в лейкоцитах отражает ДТ в стволовых клетках и соответствует их длине в эндотелиальных прогениторных клетках, что позволяет рассматривать данный параметр как биомаркер старения сосудов. Теломераза человека отвечает за поддержание и удлинение теломер и состоит из теломеразного РНК-компонента (ТЕРС) и теломераз-ной обратной транскриптазы (ТЕРТ), каталитического компонента. ТЕРТ использует ТЕРС в качестве шаблона с целью синтеза новых теломерных повторений ДНК при одноцепочечном повторении для поддержания ДТ. Стволовые клетки, кроветворные клетки-предшественники, активированные лимфоциты и большинство раковых клеток имеют высокий уровень деятельности теломеразы для того, чтобы укорачивать теломеры и поддерживать безграничное деление клетки. Однако соматические клетки вообще имеют низкий или «неопределяемый»
Егорова Mapifl Сергивна, к. мед. н., зав. консультативно-дюгностичного вщдшення. E-mail: [email protected]. 030580000-0002-3689-2683; Красненков Дмитро Серпйович, наук ствр. лаборатори етгенетикиЕ-шаН: [email protected]; Гур'янов Вгталм Григорович, к. фв.-мат. н., доцент кафедри менеджменту охорони здоров'я. E-irail: [email protected]; Кондратюк Вгталм Евгенович, д. мед. н., професор, зав. кафедри пропедевтики внутршвх хвороб № 2. Е-шаН: [email protected]; Тронько Микола Дмитрович, д. мед. н., академ1к HAMH УкраТни, директор ДУ «1нститут ендокринологм та обмшу речовин ¡мен В. П. Комгаренка HAMH УкраТни», 04114, м. КиТв, вул. Вишгородська, 69
уровень деятельности теломеразы с лимитированной долговечностью. Теломера и ее целость регулируются с помощью взаимодействия теломеразы и определенных белков [2]. Активность теломеразы снижается с возрастом, но заметно возрастает в ответ на повреждение [2].
У людей теломеры состоят из сотен и тысяч повторяющихся последовательностей ТТАССС на хромосомных концах для поддержания геномной целости [2, 12]. Поскольку репликация ДНК асимметрична вдоль двойной нити, с каждой репликации ДНК и деления клеток последовательности в З'-гидроксильных концах теряют 30—200 нуклеотидов [2]. Теломеры обеспечивают повторяющуюся последовательность на З'-гидроксильном конце, чтобы предотвратить потерю критической генетически зашифрованной информации во время репликации. Кроме того, теломеры покрыты комплексом из таких шести белков: фактор 1 (ТРИ), фактор 2 (ТРР2), репрессор-активатор протеина
1 (Рар1), ТРИ и ТРР2 взаимодействия ядерных белков
2 (Т1М2), трипептидил-пептидаза 1 (ТРР1) и защита тело-мер 1, также известных белков [11], которые упакованы в компактную структуру Т-петли для предотвращения ошибок репликации. Поэтому теломеры были предложены как митотические часы, которые измеряют, сколько раз клетка разделилась. Количество тело-мер, потерянных во время каждого деления клеток, у разных людей варьирует. По данным ранее проведенных исследований установлено, что усиление оксидантного стресса и хронического воспаления связано с более высокой потерей теломер и ускоренным их укорочением. С короткой длиной тело-мер ассоциировано несколько общих факторов риска для ССЗ, таких как курение, СД, гиперхолестеринемия, артериальная гипертензия, ожирение, низкая физическая активность, потребление алкоголя, а также наличие психосоциальных проблем. Однако механизм, лежащий в основе объединения укорочения теломер с этими факторами риска, по-прежнему не уточнен.
Цель работы — определить взаимосвязь ДТ и активности теломеразы с показателями липидного спектра, структурно-функционального состояния сердца и церебральных сосудов, а также вариабельности ритма сердца (ВРС) у пациентов с ЦА 1—3-й степени и СД 2-го типа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В комплексном клинико-инструментальном исследовании принял участие 161 пациент с ЦА 1—3-й степени. Диагноз ЦА формулировали в соо-
тветствии с классификацией атеросклероза Всемирной организации здравоохранения (2015 г.) и подтверждали данными лабораторных и инструментальных методов исследования (ультразвуковая допплерография церебральных артерий, магнитно-резонансная томография (МРТ) головного мозга).
Дизайн исследования: простое, проспективное, нерандомизированное, с последовательным включением пациентов.
В исследование не включали пациентов со всеми формами фибрилляции предсердий, некорри-гируемым уровнем артериального давления (АД) > 160/90 мм рт. ст., нарушениями ритма, требующими проведения антиаритмической терапии, снижением фракции выброса (ФВ < 40 %) по данным двухмерной эхокардиографии (эхоКГ), клинически выраженной сердечной недостаточностью, значительно выраженными нарушениями функции почек и печени, с наркотической или алкогольной зависимостью, перенесенными острыми воспалительными заболеваниями в течение предшествующего месяца. Также в исследовании не принимали участие пациенты, перенесшие реваскуляризацию, с нестабильной стенокардией или инфарктом миокарда и ревматическими пороками сердца.
Всем пациентам проводили общепринятое клиническое, лабораторное (общий анализ крови и мочи, определение липидного профиля, уровня креатинина, мочевины, глюкозы, аспартатамино-трансферазы, аланинаминотрансферазы, билирубина) и инструментальное исследования (трансторакальная эхоКГ, электрокардиография (ЭКГ), ультразвуковая допплерография сосудов головы и шеи, МРТ головного мозга).
Этические аспекты
Протокол исследования был одобрен комитетами по этике ГУ «Институт эндокринологии и обмена веществ имени В. П. Комиссаренко» и ГУ «Институт геронтологии имени Д. Ф. Чеботарева» (оба являются членами Национальной Академии медицинских наук Украины). Все участники дали письменное информированное согласие. Также были учтены Хельсинкская Декларация (2000 г.) и национальные стандарты, касающиеся участия пациентов в исследованиях.
Сбор и хранение образцов крови
Образцы крови отбирали в вакутайнеры, содержащие ЭДТА. На протяжении 30 мин после забора крови выделяли мононуклеарные клетки перифе-
рической крови на градиенте (1,077 г/см3). После выделения клетки замораживали и хранили в жидком азоте при температуре -196 °C. ДНК выделяли из размороженных клеток, используя метод фенол-хлороформной очистки [13]. Чистоту, концентрацию и целость ДНК контролировали с помощью спектро-фотомерии и агарозного гель-электрофореза.
Измерение ДТ
Относительные длины теломер (ОДТ) измеряли с помощью мультиплексной количественной полиме-разной цепной реакции в реальном времени (RT-qPCR — кПЦР-РВ) [4]. Реакционную смесь для ПЦР готовили с использованием коммерческого набора реагентов Luna® Universal qPCR и RT-qPCR (New England Biolabs) с добавлением бетаина (Sigma-Aldrich) до достижения конечной концентрации 1 М. Для мультиплексной кПЦР пару теломерных прай-меров telg и tele (конечные концентрации каждого — 450 нмоль) объединяли с парой праймеров альбумина albu и albd (конечные концентрации каждого — 250 нмоль) в мастер-микс. Список прай-меров, использованных для анализа кПЦР-РВ, приведен в табл. 1.
Профиль термоциклирования был следующим: 95 °С — 15 мин; 2 цикла: 94 °С — 15 с и 49 °С — 15 с; 32 цикла: 94 °С —15 с, 62 °С — 10 с, 74 °С — 15 с и с получением сигнала, 84 °С — 10 с, 88 °С — 15 с и с получением сигнала. Для формирования калибровочной кривой ПЦР проводили для четырех концентраций эталонной ДНК (в двух экземплярах), которые охватывают диапазон 27-кратных серийных разведений.
Все образцы ДНК анализировали в триплетах. Кривые амплификации были сгенерированы с применением программного обеспечения Opticon Monitor 3. Для этого после термоциклирования и сбора исходных данных с помощью программного обеспечения Opticon Monitor 3 для каждой постановки строили две стандартные кривые: для тело-мерного сигнала и для гена сигнала однокопийного гена альбумина. ОДТ были выражены в виде отношения T/S, где Т — число теломерных повторов, а S — число повторов гена альбумина.
Определение активности теломеразы
Теломеразную активность определяли с помощью протокола амплификации тандемных повторов с детекцией в реальном времени (ПАТП-РВ) [3]. Мононуклеарные клетки периферической крови и
клетки HEK293 (положительный контроль) обрабатывали буфером для лизиса NP-40 от Invitrogen (50 ммоль Трис, рН 7,4, 250 ммоль NaCl, 5 ммоль ЭДТА, 50 ммоль NaF, 1 ммоль №3УО4, 1 % Nonidet™ P40 (NP40) 0,02 % NaN3) с 1 ммоль PMSF (Sigma—Aldrich) и 10 мкл/мл (об./об.) раствора с ингибитором протеаз (Sigma-Aldrich) на льду в течение 30 мин. Последующее центрифугирование выполняли при 16 400 g в течение 20 мин при температуре 4 °C. В свежую пробирку переносили 180 мкл супернатанта. Концентрацию белка измеряли с помощью набора для анализа белка Pierce™ BCA (Thermo Scientific) согласно протоколам производителя.
Реакционную смесь для ПАТП-РВ готовили на основе Luna Universal qPCR и RT-qPCR (New England Biolabs) с добавлением EGTA до достижения конечной концентрации 5 ммоль. Конечная концентрация праймеров составила 400 нмоль для ACX и 400 нмоль для TS. К 23 мкл смеси ПАТП-РВ добавляли 2 мкл лизата и инкубировали в течение 30 мин при температуре 30 °C. Затем проводили ПЦР при следующих условиях: 95 °С — 1 мин; 40 циклов: из 95 °С — 15 с, 60 °С — 1 мин и с получением сигнала. ПЦР-продукты количественно определяли с помощью Chromo4 (Bio-Rad) и анализировали с использованием программного обеспечения Opticon Monitor v3.1. Клетки НЕК293 применяли для генерации стандартной кривой, построенной на точках пяти вариантов разведений.
Измерение базовых характеристик
Уровень систолического и диастолического АД (САД и ДАД, мм рт. ст.) измеряли дважды с помощью стандартного сфигмоманометра в положении сидя после отдыха в течение не менее 10 мин. Уровень глюкозы в плазме крови определяли с помощью стандартного метода глюкозооксидазы, а общего холестерина (ХС), ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и триглицеридов (ТГ) — с использованием автоматического анализатора GBG ChemWell 2910 (Awareness Tech. Inc., США) и соответствующих наборов (Global Scientific T5532-1000 и H-7545-320).
Статистический анализ
Для представления результатов в случае количественных переменных рассчитывали среднее значение показателя и его среднеквадратичес-кое отклонение (± SD) в случае нормального закона
Список праймеров, использованных для кПЦР-РВ
Праймер Последовательность нуклеотидов праймера
TS 5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'
ACX 5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3'
telg 5'-ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTG GGTTTGGGTTAGTGT-3'
tele 5'-TGTTAGGTATCC CTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA-3'
albu 5'-CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGAA ATGCTGCACAGAATCCTTG-3'
albd 5'-GCCCGGCCCGCCGCG CCCGTCCCGCCGGAAAAGCATGGTCGCCTGTT-3'
распределения либо медианное значение показателя (Me) и значения первого (QI) и третьего (QIII) квартилей в случае закона распределения, отличного от нормального. Проверку распределения на нормальность проводили с использованием критерия Шапиро—Уилка. Для представления качественных признаков рассчитывали их частоту (%). При сравнении количественных показателей в двух группах использовали t-критерий (в случае нормального закона распределения) и критерий Манна—Уитни (в случае закона распределения, отличного от нормального). Сравнение качественных показателей проводили с помощью точного критерия Фишера.
Для анализа связи показателя T/S (зависимая переменная) с факторными признаками применяли метод построения и анализа логистических моделей регрессии. Показатель отношения шансов (OR) и его 95 % доверительный интервал (95 % CI) рассчитывали с целью оценки степени связи между зависимой и независимыми переменными [1]. Для анализа адекватности моделей регрессии проводили ROC-анализ [1] и определяли площадь под кривой операционных характеристик (AUC). Порог значимости во всех случаях был установлен на уровне р < 0,05.
Статистический анализ выполняли с использованием MedCalc v.18.10 (MedCalc Software Inc., Broekstraat, Бельгия, 1993—2018).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Пациентов разделили на две группы: 1-ю — с ЦА 1—2-й степени, 2-ю — с ЦА 3-й степени (перенесшие ИИ) (табл. 2). Средний возраст пациентов — (65,1 ± 10,5) и (65,4 ± 9,1) года соответственно. Доля мужчин составила 21,2 % в 1-й и 52 % во 2-й группе. Количество пациентов с СД 2-го типа и средним уровнем глюкозы натощак было сопоставимым в обеих группах.
По данным анализа выявлено, что в группе пациентов с ЦА 1—2-й степени уровень общего ХС и ЛПНП был статистически значимо выше (p < 0,05), а ЛПВП — ниже, чем в группе пациентов, перенесших ИИ. Величина КИМ с обеих сторон была значимо (p < 0,05) больше у пациентов 2-й группы. При этом пациенты двух групп не различались по показателям структурно-функционального состояния сердца: ФВ, ММЛЖ, КДО и показатели диасто-лической функции сердца были сопоставимы. Показатель НЧ/ВЧ отражает состояние симпато-парасимпатического баланса ВНС. Более высокие значения этого показателя свидетельствуют о преобладании тонуса симпатического отдела ВНС, что статистически значимо наблюдалось у пациентов 1-й группы, при этом триангулярный индекс и индекс HRV, применяемые для оценки общей ВРС, были сопоставимы в обеих группах и превышали нормальные международные значения. Обе группы были сопоставимы по значениям ДТ и активности теломеразы (p > 0,05).
Для выявления факторов, влияющих на размер теломер, как маркер раннего старения [1, 2] использовали метод построения логистических моделей регрессии с помощью таких категорий: более короткая ДТ — T/S < 2,61 (низкий и средний тертили); более длинная ДТ — T/S > 2,61.
При проведении однофакторного регрессионного анализа выявлена одна статистически значимая (p = 0,02) связь ДТ с показателем ДД Е/А (табл. 3).
Важно учитывать и тот факт, что именно комбинация факторов риска, а не каждый из них отдельно может приводить к укорочению теломер [16]. Для отбора совокупности значимых факторов риска использовали метод пошагового включения/исключения признаков (Stepwise при пороге исключения p > 0,15 и пороге включения p < 0,03). На выделенных значимых факторах риска была построена многофакторная модель логистической регрессии, в кото-
Клинико-инструментальная и лабораторная характеристика пациентов
Показатель 1-я группа (n = 86) 2-я группа(n = 75) Уровень значимости различия,p
Активность теломеразы 3.22 (2.423; 4.23) 2.85 (1.823; 4.627) 0,485
ДТ 2.51 (2.133; 3.298) 2.66 (2.2; 3.52) 0,325
Возраст, годы 65,1 ± 10,5 65,4 ± 9,1 0,83
Пол (м) 18 (21,2%) 39 (52%) 0,001
СД 2-го типа 19 (22,1%) 13 (17,3%) 0,58
ХС, ммоль/л 5.7 (5.2; 6.5) 5.3 (4.4; 6.475) 0,017
ТГ, ммоль/л 1.31 (1.06; 2.38) 1.55 (1.15; 2.54) 0,156
ЛПВП, ммоль/л 1.54 (1.38; 1.687) 1.5 (1.33; 1.54) 0,035
ЛПНП, ммоль/л 3.345 (2.73; 4.32) 2.73 (2.253; 4.13) 0,011
ЛПОНП, ммоль/л 0.585 (0.47; 1.07) 0.69 (0.51; 1.14) 0,167
Глюкоза натощак, ммоль/л 5,1 ± 0,6 5,0 ± 0,7 0,88
ИА 2.7 (2.37; 3.4) 2.7 (2.06; 3.33) 0,739
КИМ_справа, см 1.00 (0.90; 1.02) 1.00 (1.00; 1.10) 0,018
КИМ_слева, см 1.00 (0.90; 1.10) 1.00 (1.00; 1.20) 0,016
Индекс_НМ 8 (6; 9) 7 (5; 9) 0,524
Триангулярный_индекс 112 (88.; 152.) 96 (80.; 134.) 0,233
НЧ/ВЧ -49.275 (-183.25; 1.89) 0.39 (-61.39; 3.242) 0,012
КДО, мл 106 (89.6; 134.) 101 (89.6; 125.3) 0,302
ФВ, % 62,0 ± 4,2 61,9 ± 4,2 0,91
ММЛЖ 193 (152; 244) 173 (137.5; 221.25) 0,211
E/A 0.82 (0.7; 1.14) 0.83 (0.722; 1.13) 0,943
Е/Е' 8 (6; 8) 7 (6; 8.) 0,185
Примечание. Приведено среднее значение ± БЭ в случае нормального закона распределения; Ме (0!; ОШ) — в случае закона распределения, отличного от нормального.
рую вошли показатели, представленные в табл. 4. Также установлена статистически значимая положительная связь ДТ с E/A и ЛПОНП, а также отрицательная — с ФВ и КИМ справа.
Выявлена хорошая согласованность выделенных факторных признаков с риском укорочения ДТ — AUC 0,79 (CI 0,69—0,87) (рис. 1), что может указывать на полноту модели и предикторов ДТ, рассмотренных в данном исследовании. Все представленные в табл. 4 показатели являются весомыми в общей многофакторной модели, хотя статистической значимости для некоторых из них не получено. Вероятно, необходим больший размер выборки.
Для выявления факторов, влияющих на активность теломеразы [1, 2], использовали метод построения логистических моделей регрессии с помощью таких категорий: более низкая актив-
ность теломеразы — T/S < 3,16 (низкий и средний тертили); более высокая активность теломеразы — T/S > 3,16.
При проведении однофакторного регрессионного анализа выявлена статистически значимая (p = 0,02) связь активности теломеразы с мужским полом (табл. 5). Для отбора совокупности значимых факторов риска использовали метод пошагового включения/исключения признаков (Stepwise при пороге исключения p > 0,15 и пороге включения p < 0,03). На выделенных значимых факторах риска была построена многофакторная модель логистической регрессии, в которую вошли показатели, представленные в табл. 6. Также установлена статистически значимая положительная связь активности теломеразы с индексом HRV, отрицательная — с ИА.
Выявлена хорошая согласованность выделенных факторных признаков с риском снижения активнос-
Однофакторный регрессионный анализ показателей липидного обмена, ВРС и структурно-функционального состояния сердца и ДТ
Независимая переменная Коэффициент регрессии, b ± m Уровень значимости отличия коэффициента от 0, p OR (95 % CI)
ИИ, лет -0,47 ± 0,44 0,28 0,6 (0,3-1,5)
СД 2-го типа, лет 0,67 ± 0,48 0,16 2,0 (0,8—5,0)
Возраст, годы -0,022±0,021 0,30 0,97 (0,94—1,02)
Пол (м) 0,00 ± 0,47 1,00 1,0 (0,4—2,5)
ХС, ммоль/л -0,16 ± 0,21 0,45 0,9 (0,6—1,3)
ТГ, ммоль/л 0,31 ± 0,27 0,24 1,4 (0,8—2,3)
ЛПВП, ммоль/л 0,11 ± 1,05 0,92 1,1 (0,1—8,6)
ЛПНП, ммоль/л -0,25 ± 0,21 0,24 0,8 (0,5—1,2)
ЛПОНП, ммоль/л 0,70 ± 0,59 0,23 2,0 (0,6—6,4)
ИА -0,23 ± 0,25 0,35 0,8 (0,5—1,3)
КИМ_справа, см -1,82 ± 1,59 0,25 0,16 (0,01—3,7)
КИМ_слева, см -1,94 ± 1,51 0,20 0,14 (0,01—2,8)
Индекс_НМ 0,035 ± 0,061 0,56 1,0 (0,9—1,2)
Триангулярный индекс 0,0021 ± 0,0040 0,59 1,00 (0,99—1,01)
НЧ_ВЧ -0,00021 ± 0,00050 0,67 1,000 (0,999—1,001)
КДО, мл -0,0022 ± 0,0073 0,76 1,00 (0,98—1,01)
ФВ, % -0,025 ± 0,052 0,63 0,98 (0,88—1,08)
ММЛЖ -0,0037 ± 0,0041 0,37 1,00 (0,99—1,00)
E/A 1,56 ± 0,68 0,02 4,8 (1,3—17,8)
Е/Е' 0,13 ± 0,11 0,25 1,1 (0,9—1,4)
ти теломеразы — АиС 0,73 (С1 0,63—0,83) (рис. 2), что может указывать на полноту модели и предикторов активности теломеразы, рассмотренных в данном исследовании. Все представленные в табл. 6 показатели являются весомыми в общей многофакторной модели, хотя статистической значимости для некоторых не получено. Вероятно, необходим больший размер выборки.
ОБСУЖДЕНИЕ
Вопрос о взаимосвязи атеросклероза, в том числе липидного обмена (ЛПОНП), КИМ и биологии тело-мер в настоящее время окончательно не решен. Одни исследователи считают, что не существует связи между проявлениями субклинического атеросклероза и ДТ, подчеркивая, что более короткие теломеры не связаны с атеросклерозом [10, 12]. Существует ряд работ, в которых получены противоположные результаты. Высказано предположение о том, что взаимосвязь ДТ с развитием ССЗ может быть опосредована влиянием так называемых модулирующих факторов, которые определяют
выраженность оксидантного стресса и хронического воспаления. Ускоренное укорочение теломер может приводить к старению эндотелия и возникновению атеросклероза с дальнейшим развитием ССЗ [9, 12].
Клинических работ, в которых изучали взаимосвязь ДТ со структурно-функциональным состоянием миокарда и диастолической функцией ЛЖ, мало [5, 12]. В исследовании «New castle 85+» с участием людей в возрасте > 85 лет не было обнаружено взаимосвязи ДТ с гипертрофией миокарда и увеличением ИММ ЛЖ, в то время как выявлена значимая связь с ФВ ЛЖ [12]. Следует отметить, что в данном исследовании принимали участие лица с различными ССЗ.
В недавно проведенном популяционном исследовании Asclepios с участием здоровых лиц без явных ССЗ (> 2500 человек в возрасте 35—55 лет) после поправки на пол, возраст и факторы сердечно-сосудистого риска связь ДТ лимфоцитов с параметрами структуры, такими как ИММ ЛЖ и КДР, не обнаружена [5].
Многофакторный анализ показателей липидного обмена, ВРС и структурно-функционального состояния сердца и ДТ
Независимая переменная Коэффициент регрессии, b ± m Уровень значимости отличия коэффициента от 0, p OR (95 % CI)
СД 2-го типа 1,09 ± 0,57 0,055 3,0 (1,0-9,1)
ЛПОНП 2,02 ± 0,78 0,01 7,5 (1,6-34,9)
ИА -0,52 ± 0,29 0,08 0,6 (0,3-1,1)
КИМ_справа -4,68 ± 2,10 0,03 0,009 (0,002—0,57)
КДО -0,017 ± 0,010 0,10 0,98 (0,96—1,00)
ФВ -0,17 ± 0,08 0,04 0,85 (0,72—0,99)
E/A 2,75 ± 0,94 0,004 15,6 (2,5—98,6)
Иные результаты получены во Фремингемском исследовании с участием 850 человек, в котором ДТ лейкоцитов оказалась прямо связана с ММ ЛЖ и ФВ ЛЖ. Следует отметить, что такая взаимосвязь обнаружена только для лиц с артериальной гипертензи-ей, в то время как в группе нормотоников она была недостоверна.
В нашем исследовании была установлена отрицательная связь ДТ с КИМ. Объяснить это можно тем, что в клинической практике ДТ определяется в лимфоцитах и по существу отражает ДТ в стволовых и прогениторных клетках. Эти клетки, участвуя в репарации повреждения и процессах дифференциации тканей, играют важную роль в поддержании тканевого гомеостаза, в том числе в стенке сосуда, обеспечивая сохранность
Sensitivity: 59.5 Specificity: 88.4 Criterion: >0.5812
0 20 40 60 80 100
100-Specificity
Рис. 1. ROC-кривая 7-факторной модели прогнозирования риска снижения ДТ AUC 0,79 (95 % CI 0,69—0,87)
эндотелиальной функции. Но так как жесткость сосудов в большей степени определяется состоянием внеклеточного матрикса, возможно, существуют клетки и в матриксе, репликативная активность которых определяет сосудистую жесткость. Или, вероятно, более медленное укорочение теломер влияет на состояние матрикса не через репликативную активность. Несмотря на то что накапливается все больше доказательств того, что укорочение теломер лимфоцитов является ключевым компонентом уменьшения резервов стволовых клеток и возраст-ассоциированной дегенерации тканей, в частности повышения сосудистой жесткости, объяснение этого факта пока нет, что свидетельствует о необходимости проведения дальнейших исследований.
Sensitivity: 85.7 Specificity: 51.2 Criterion: > 0.3911
Рис. 2. ЙОС-кривая 7-факторной модели прогнозирования риска снижения активности теломеразы АиС0,73 (95 % С10,63—0,83)
Однофакторный регрессионный анализ показателей липидного обмена, ВРС, структурно-функционального состояния сердца и активности теломеразы
Независимая переменная Коэффициент регрессии, b ± m Уровень значимости отличия коэффициента от 0, р OR (95 % CI)
ИИ 0,28 ± 0,43 0,52 0,8 (0,3—1,8)
СД 2-го типа 0,44 ± 0,47 0,35 0,6 (0,3—1,6)
Возраст -0,0049 ± 0,0030 0,10 1,00 (0,99—1,00)
Пол (м) 7,5 ± 2,5 0,02 1790 (3,5—911000)
ХС -0,42 ± 0,41 0,31 0,7 (0,3—1,5)
ТГ -0,10 ± 0,13 0,44 0,9 (0,7—1,2)
ЛПВП 0,073 ± 0,061 0,23 1,07 (0,95—1,21)
ЛПНП -0,021 ± 0,021 0,31 0,98 (0,94—1,02)
ЛПОНП 0,22 ± 0,47 0,63 1,2 (0,5—3,1)
ИА -0,40 ± 0,22 0,07 0,67 (0,43—1,03)
КИМ_справа -0,38 ± 0,27 0,16 0,7 (0,4—1,2)
КИМ_слева 0,61 ± 1,05 0,56 1,8 (0,2—14,4)
Индекс_НМ -0,30 ± 0,21 0,16 0,7 (0,5—1,1)
Триангулярный индекс -0,84 ± 0,59 0,16 0,4 (0,1 — 1,4)
НЧ_ВЧ -0,52 ± 0,28 0,06 0,60 (0,35—1,02)
КДО -0,01 ± 1,55 0,99 0,99 (0,04—20,5)
ФВ -0,83 ± 1,47 0,57 0,43 (0,02—7,8)
ММЛЖ 0,094 ± 0,064 0,14 1,10 (0,97—1,24)
E/A 0,0038 ± 0,0040 0,33 1,00 (0,99—1,01)
Е/Е' -0,00030 ± 0,00051 0,56 1,000 (0,999—1,001)
Таблица 6
Многофакторный анализ показателей липидного обмена, ВРС, структурно-функционального состояния сердца и активности теломеразы
Независимая переменная Коэффициент регрессии, b ± m Уровень значимости отличия коэффициента от 0, р OR (95 % CI)
ЛПОНП -1,07 ± 0,66 0,11 0,3 (0,1 — 1,3)
ИА -0,76 ± 0,35 0,03 0,5 (0,2—0,9)
Индекс HRV 0,54 ± 0,24 0,03 1,7 (1,1—2,8)
Триангулярный индекс -0,028 ± 0,015 0,07 0,97 (0,94—1,00)
Е/Е' -0,28 ± 0,13 0,03 0,75 (0,58—0,98)
ЛПОНП -1,07 ± 0,66 0,11 0,3 (0,1 — 1,3)
ВЫВОДЫ
1. ДТ и активность теломеразы сопоставимы у лиц пожилого возраста с ЦА 1—2-й степени и перенесших ИИ, в том числе с СД 2-го типа.
2. На основании многофакторного регрессионного анализа выявлено наличие связи ДТ с ЛПОНП, КИМ, ФВ и диастолической функцией ЛЖ у пациен-
тов с ЦА разной степени, в том числе с СД 2-го типа (АиС 0,79; С1 0,69—0,87).
3. На основании многофакторного регрессионного анализа обнаружена связь активности теломеразы с ИА и ИРУ у пациентов с ЦА разной степени, в том числе с СД 2-го типа (АиС 0,73; 95 % С1 0,63—0,83).
Ни грантов, ни государственного финансирования не было.
Конфликта интересов нет.
Участие авторов: поиск литературы, дизайн исследования, сбор, анализ и интерпретация данных, написание статьи — М. С. Егорова; выполнение лабораторных исследований — Д. С. Красненков; статистическая обработка данных — В. Г. Гурьянов; анализ и рецензирование данных — В. Е. Кондратюк; рецензирование данных — Н. Д. Тронько.
ЛИЕРАТУРА/РЕРЕРЕЫСЕБ
1. Гур'янов ВГ, Лях ЮС, Парм ВД та ¡н. Поабник з бюста-тистики. Аналв результат^ медичних дослщжень у пакет¡ EZR (R-statistics). ОВ. Короткий, ОВ. Чалий, КО Чалий, ЯВ Цехмктер: Навч. пос¡бник. К.: Вктка, 2018:208.
2. Koliada AK, Krasnenkov DS, Vaiserman AM. Telomeric aging: mitotic clock or stress indicator? Frontiers in genetics. 2015;6(82):24.
3. Banerjee, Partha P., Shankar Jagadeesh. Non-radioactive assay methods for the assessment of telomerase activity and telomere length. Methods in molecular biology (Clifton N.J.). 2009;523:383-394.
4. Cawthon RM. Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative PCR method. Nucleic. Acids Res. 2009;361(9355):1-7.
5. Denil SL, Rietzschel ER, De Buyzere ML et al. On cross-
sectional associations of leukocyte telomere length with cardiac systolic, diastolic and vascular function: the Asklepios study. PLoS One. 2014;9(12):e115071.
6. Krasnienkov DS, Khalangot MD, Kravchenko VI et al. Additional Impact of Glucose Tolerance on Telomere Length in Persons With and Without Metabolic Syndrome in the Elderly Ukraine Population Hyperglycemia attenuates the association between telomere length and age in Ukrainian population. Experimental gerontology. 2018;110:247-252.
7. Ellehoj H, Bendix L, Osler M. Leucocyte Telomere length and risk of cardiovascular disease in a cohort of1,397 danish men and women. Cardiology. 2016;133:173177. [PubMed]
8. Khalangot M, Krasnienkov D, Vaiserman A et al. Leukocyte telomere length is inversely associated with post-load but not with fasting plasma glucose levels. Experimental Biology and Medicine. 2017;242(7):700-708.
9. Lehrer PM, Gevirtz R. Heart rate variability biofeedback: how and why does it work? Front Psychol. 2014;5:756.
10. Gielen M, Hageman GJ, Antoniou EE et al. Body mass index is negatively associated with telomere length: a
collaborative cross-sectional meta-analysis of 87 observational studies. The American journal of clinical nutrition. 2018;108(3):453-475.
11. Khalangot M, Krasnienkov D, Vaiserman A et al. Leukocyte telomere length is inversely associated with post-load but not with fasting plasma glucose levels. Experimental Biology and Medicine. 2017; 242(7):700-708.
12. Plohova EV, Akasheva DU, Tkacheva ON et al. Age-related remodeling of the left ventricle: is there a connection to the cellular aging? Cardiovascular Therapy and Prevention. 2015;14(2):52-7.
13. Sambrook J, Russell DW. Purification of nucleic acids by extraction with phenol: chloroform. CSH Protoc. 2006;1:16-22.
РЕЗЮМЕ
Исследование диагностической значимости длины теломер и активности теломеразы у пациентов с церебральным атеросклерозом и сахарным диабетом 2-го типа М. С. Егорова1, Д. С. Красненков 2, В. Г. Гурьянов3, В. Е. Кондратюк3, Н. Д. Тронько1
1 ГУ «Институт эндокринологии и обмена веществ имени В. П. Комиссаренко НАМН Украины», Киев
2 ГУ «Институт геронтологии имени Д. Ф. Чеботарева НАМН Украины», Киев
3 Национальный медицинский университет имени А. А. Богомольца, Киев
Цереброваскулярные заболевания — одна из важнеийших причин заболеваемости и смертности среди взрослого населения.
Цель работы — определить взаимосвязь длины теломер (ДТ) и активности теломеразы с показателями липидного спектра крови, структурно-функционального состояния сердца и церебральных сосудов, а также вариабельности ритма сердца у пациентов с церебральным атеросклерозом (ЦА) I—III степени и сахарным диабетом (СД) 2-го типа.
Материалы и методы. В комплексном клини-ко-инструментальном исследовании принял участие 161 пациент с ЦА I—III степени. Теломеразную активность определяли в соответствии c протоколом амплификации тандемных повторов с детекцией в реальном времени. Относительные ДТ измеряли с помощью мультиплексной количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Результаты и обсуждение. Пациентов разделили на две группы: 1-ю — с ЦА I—II степени, 2-ю — с ЦА III степени (перенесшие ишемический атеротромботический инсульт — ИИ). Средний возраст больных — (65,1 ± 10,5) и (65,4 ± 9,1) года соответственно. Доля мужчин составила 21,2 % в 1-й группе и 52 % во 2-й. Для выявления факторов, влияющих на размер теломер как маркер раннего старения, использовали метод построения логистических моделей регрессии по таким категориям: более короткая ДТ — T/S < 2,61 (низкий и средний тертили); более длинная ДТ — T/S — выше 2,61. Для отбора совокупности значимых факторов риска применяли метод пошагового включения/ исключения признаков (Step wise при пороге исключения p > 0,15 и пороге включения p < 0,03). На выделенных значимых факторах риска строили многофакторную модель логистической регрессии. Установлена статистически значимая положительная связь ДТ с показателем диастолической функции сердца Е/А и липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП), а также отрицательная связь с фракцией выброса (ФВ) и комплексом интима — медиа (КИМ) справа. Для выявления факторов, влияющих на активность теломеразы, использовали метод построения логистических моделей регрессии. Для этого применяли такие категории: более низкая активность теломеразы — T/S < 3,16 (низкий и средний тертили) и более высокая активность теломеразы — T/S выше 3,16. Установлена статистически значимая положительная связь активности теломеразы с индексом общего напряжения вегетативной регуляции (HRV), а также отрицательная — с индексом атеро-генности (ИА).
Выводы. ДТ и активность теломеразы сопоставимы у больных пожилого возраста с ЦА I—II степени и перенесших ИИ, в том числе с СД 2-го типа. На основании многофакторного регрессионного анализа выявлено наличие связи ДТ с ЛПОНП, КИМ, ФВ и диастолической функцией ЛЖ у пациентов с ЦА разной степени, в том числе с СД 2-го типа (AUC 0,79; CI 0,69—0,87). По данным многофакторного регрессионного анализа установлено наличие связи активности теломеразы с ИА и HRV у пациентов с ЦА разной степени, в том числе с СД 2-го типа (AUC 0,73; 95 % CI 0,63—0,83).
Ключевые слова: церебральный атеросклероз, сахарный диабет 2-го типа, относительная длина теломер, активность теломеразы.
РЕЗЮМЕ
Дослщження д1агностичноТ значущост довжини теломер та активносп теломерази у пащснлв ¡з церебральним атеросклерозом
1 цукровим дiабетом 2-го типу
М. С. Егорова1, Д. С. Красненков 2, В. Г. Гур'янов3, В. €. Кондратюк3, М. Д. Тронько1
1ДУ «iHcmumym ендокринологи та обм'!ну речовин iменi В. П. Kомicаренка НАМН Украни», Ки)в
2 ДУ «1нститут геронтологи iменi Д. Ф. Чеботарьова НАМН Украни», Кив
3 Нацюнальний медичний ун'!верситет iменi О. О. Богомольця, Кив
Цереброваскулярн захворювання — одна з най-важлив1ших причин захворюваносп i смертносп серед дорослого населення.
Мета роботи — визначити взаемозв'язок довжини теломер (ДТ) i активносп теломерази з показниками лтщного спектра, структурно-функцюнального стану серця, церебральних судин та варiабельностi ритму серця у па^енпв iз церебральним атеросклерозом (ЦА) 1—3-го ступеня i цукровим дiабетом (ЦД) 2-го типу.
Матерiали та методи. У комплексному клЫко-Ыструментальному дослщжены узяв участь 161 патент з ЦА 1—3-го ступеня. Теломеразну активнкть визнача-ли за допомогою протоколу амплiфiкацiT тандемних повтсрв з детещею в режимi реального часу. Вщносы ДТ вимiрювали за допомогою мультиплекснот ктьккнот полiмеразноT ланцюговот реакци в реальному час.
Результати та обговорення. Па^енпв роздтили на двi групи: 1-шу — з ЦА 1—2-го ступеня, 2-гу — з ЦА 3-го ступеня (як перенесли iшемiчний атеротромботичний Ысульт — II). Середый вк хворих — (65,1 ± 10,5) i (65,4 ± 9,1) року вщповщно. У 1-й грут частка чолов^в стано-вила 21,2 %, у 2-й — 52 %. Для виявлення чинниюв, що впливають на розмiр ДТ як маркер раннього стартня, використовували метод побудови лопстичних моделей регреси iз застосуванням таких категорм: коротша ДТ —T/S < 2,61 (низький i середнм тертилО; довша ДТ—T/S > 2,61. Для вщбору сукупносл значущих чинни^в ризи-ку використовували метод покрокового включення/ виключення ознак (Stepwise при порозi виключення p > 0,15 i порозi включення p < 0,03). На видтених значущих чинниках ризику побудована багатофакторна модель лопстичнот регресм. Встановлений статистично значу-щий позитивний зв'язок ДТ з показником дiастолiчноT функци серця Е/А i рiвнем лтопротерв дуже низькот щтьносл (ЛПДНЩ), а також негативний — iз фращею викиду (ФВ) i комплексом Ытима — медiа (К1М) право-
руч. Для виявлення чинниюв, що впливають на актив-нкть теломерази, використовували метод побудови лопстичних моделей регресГГ за такими категортми: б¡льш низька активн¡сть теломерази — T/S < 3,16 (низь-кий ¡ середн¡й тертил¡); б¡льш висока активысть теломерази — T/S > 3,16. Виявлено статистично значущий позитивний зв'язок активносл теломерази з ¡ндексом загального напруження вегетативно!' регуляци (HRV), а також негативний зв'язок з ¡ндексом атерогенносп (1А).
Висновки. ДТ ¡ активн¡сть теломерази можна порв няти у пац¡eнт¡в литого в¡ку з ЦА 1—2-го ступеня, як¡ перенесли II, у тому чи^ з ЦД 2-го типу. На пщст^ багатофакторного регрессного анал¡зу виявлено наявн¡сть зв'язку ДТ з ЛПДНЩ, KIM, ФВ та д^столтною функц¡eю ЛШ у пацкнпв з ЦА р¡зного ступеня, у тому числ з ЦД 2-го типу (AUC 0,79; CI 0,69—0,87). На пщста-в¡ багатофакторного регрессного анал¡зу встановле-но наявнкть зв'язку активност¡ теломерази з 1А ¡ HRV у пац¡eнт¡в з ЦА рвного ступеня, у тому чиш з ЦД 2-го типу (AUC 0,73; 95 % CI 0,63—0,83).
Ключов1 слова: церебральний атеросклероз, цукровий д^бет 2-го типу, вщносна довжина тело-мер, активнкть теломерази.
SUMMARY
Study of the diagnostic significance of telomere length and telomerase activity in patients with cerebral atherosclerosis and type 2 diabetes mellitus M. S. Yehorova1, D. S. Krasnenkov2, V. G. Gurianov3, V. Ye. Kondratiyk3, N. D. Tronko1
11nstitute of Endocrinology and Metabolism
named after V. P. Komisarenko of the NAMS of Ukraine, Kyiv
2 Institute of Gerontology named after D. F. Chebotarev NAMS of Ukraine, Kyiv
3 O.O. Bogomolets National Medical University, Kyiv
Cerebrovascular diseases areamongst the most important causes of morbidity and mortality in adult population.
Objective — to determine the relationship between telomere length and telomerase activity with lipid spectrum, structural and functional status of the heart and cerebral vessels and heart rate variability in patients with cerebral atherosclerosis (CA) of stages 1—3and type 2 diabetes mellitus.
Materials and methods. In a comprehensive clinical and instrumental study, 161 patients with CA 1—3stages were included. Telomerase activity was determined using a
Дата надходження до редакцп 24.10.2019 р.
real-time tandem repeat amplification protocol. The relative lengths of telomeres were measured using multiplex quantitative polymerase chain reaction in real time.
Results and discussion. Patients were divided into 2 groups: 1 — with CA ofstage 1-2, 2 — with CA of stage 3 (with history of ischemic atherothrombotic stroke — AS). Mean age = 65.1 ± 10.5 and 65.4 ± 9.1 years, respectively. The percentage of men was 21.2 % in group1 and 52 % in the group 2. To identify factors that influence telomere size as a marker of early aging, the method of constructing logistic regression models was used. In building the models, the following categories were used: shorter telomere length — T/S < 2.61 (lowest and middle tercile); longer telomere length — T/S over 2.61. For selection of a set of significant risk factors, the method of step-by-step inclusion/exclusion of signs was used withexclusion threshold p > 0.15 and inclusion threshold p < 0.03. A multivariate logistic regression model was built on the identified significant risk factors. A statistically significant positive relationship was established between the telomere length and the E/A (diastolic function of the heart) and LPVLD, as well as negative relationships with the EF and the intima-media complex (IMC) on the right. To identify factors affecting telomerase activity, the method of constructing logistic regression models was used. In building the models, the following categories were used: lower telomerase activity — T/S < 3.16 (lowest and middle terciles); higher telomerase activity — T/S above 3.16. A statistically significant positive correlation of telomerase activity with the total stress index of the vegetative regulation HRV was also established, as well as a negative correlation with the atherogenic index.
Conclusions. Telomere length and telomerase activity are comparable in elderly patients with CA of stage 1—2 and history of ischemic atherothrombotic stroke, including type 2 diabetes mellitus. Based on a multifactor regression analysis, the relationship between telomeres length and LPVLD, IMC, EF and LV diastolic function was detected in patients at different stages of CA, includingtype 2 diabetes (AUC 0.79; CI 0.69—0.87). Based on multivariate regression analysis the association of telomerase activity with atherogenic index and total stress index of vegetative regulation of heart rhythm was revealed in patients at different stages of CA, including type 2 diabetes (AUC 0.73; 95 % CI 0.63—0.83).
Key words: cerebral atherosclerosis, type 2 diabetes mellitus, relative telomere length, telomerase activity.
