CC BY
34
УДК 615.01:577.1
Ключевые слова: полипренолы, тетрахлорметан, холинэстераза, моноаминоксидаза, крысы
Key words: polyprenol, tetrachloromethane, cholinesterase, monoamine oxidase, rats
Басова И. Н., Розенгарт Е. В., Басова Н. Е., Ягодина О. В.
ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ПОЛИПРЕНОЛьНОГО ПРЕПАРАТА «РОПРЕН»
на активность бутирилхолинэстеразы и моноаминоксидазы в различных органах у крыс при тетрахлорметановой модельной системе острого токсического гепатита
THE STUDY OF EFFECT OF THE POLYPRENOL PREPARATION "ROPREN" OF BUTYRYL CHOLINESTERASE AND MONOAMINE OXIDASE ACTIVITY IN VARIOUS ORGANS IN RATS WITH TETRACHLOROMETANE MODEL SYSTEM
OF ACUTE TOXIC HEPATITIS
ФГБУН «Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова» РАН Адрес: 194223, Россия, Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44 I. M. Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences Address: 194223, Russia, Saint-Petersburg, Torezapr., 44
Басова Ирина Николаевна, научн. сотрудник. Тел. +7 (812) 402-43-04. E-mail: [email protected]
Basova Irina N., Research Assistant. Tel. +7 (812) 402-43-04. E-mail: [email protected] Розенгарт Евгений Викторович, д. б. н., проф., гл. научн. сотрудник Тел. +7 (812) 543-47-62. E-mail: [email protected] Rozengart Evgeniy V., Doctor of Biology Science, Professor, Chief Researcher Tel. +7 (812) 543-47-62. E-mail: [email protected] Басова Наталия Евгеньевна, к. б. н., ст. научн. сотрудник Тел. +7 (812) 543-47-62. E-mail: [email protected] Basova Natalya E., Ph.D. in Biology Science, Senior Research Assistant Tel. +7 (812) 543-47-62. E-mail: [email protected] Ягодина Ольга Викторовна, к. х. н., ст. научн. сотрудник Тел. +7 (812) 542-03-55. E-mail: [email protected] Yagodina Olga V., Ph.D. in Chemical Science, Senior Research Assistant Tel. +7 (812) 542-03-55. E-mail: [email protected]
Аннотация. Целью работы было изучение активности бутирилхолинэстеразы (БХЭ) в печени, сыворотки крови и моноаминоксидазы (МАО) в печени и почках крыс при остром токсическом отравлении тетрахлорметаном (СС14). Представляло интерес применение полипренольного препарата «Ропрен» и его влияние на исследуемые ферменты. Установлено, что ведение СС14 приводит к статистически значимому снижению активности БХЭ в печени и сыворотке крови крыс. Препарат «Ропрен» оказывает выраженное гепатопротекторное действие уже на первых стадиях эксперимента. Активность МАО в печени и почках крыс при действии СС14 повышалась и в течение всего эксперимента оставалась практически без изменений. Препарат «Ропрен» в начальной стадии опыта не снижал показатели активности МАО в печени и почках крыс, но на следующих этапах исследования восстанавливал активность фермента до показателей, соответствующих контрольной группе животных.
Summary. The goal of the work was to study the activity of butyryl cholinesterase (BChE) in the liver, serum and monoamine oxidase (MAO) in the liver and kidneys of rats with acute toxic poisoning of tetrachloromethane (CClJ. The use of polyprenol preparation "Ropren" and its impact on the studied enzymes were of interest. It is found that administration of CCl4 leads to the statistically significant decrease in the activity of BChE in the liver and serum of rats. The preparation "Ropren" showed a strong hepatoprotective effect on rats in the early stages of the experiment. MAO activity in the liver and kidneys of rats increased due to the action of CCl4 and remained practically unchanged during the experiment. The preparation "Ropren" didn't reduce the rates of MAO activity in the liver and kidneys of rats in the initial stage of the experiment. "Ropren" restored the enzyme activity to the levels corresponding to the control group of animals in the following stages of research.
Введение содержащих богатый арсенал биологически
На фоне возросшего в мировой практике активных веществ, насущной проблемой яв-
интереса к созданию лечебно-профилактиче- ляется расширение спектра их физиологи-
ских средств растительного происхождения, ческой эффективности [1]. Одним из таких
препаратов, выделенных из нейтральной части хвои сосны и ели, является «Ропрен», представляющий собой группу полипрено-лов (длинноцепочечных полиизопреновых спиртов - долихолов) [9, 12]. Ранее было показано, что «Ропрен» обладает иммуно-модулирующими свойствами, повышает гуморальный ответ организма на фагоцитоз, что может быть успешно использовано при лечении различных инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний [9, 12]. Кроме того, есть основания предполагать наличие у «Ропрена» определенного энцефало-и гепатопротекторного действия [7]. В этой связи представляло интерес использовать в качестве тестового приема гепатотропную модель печеночной энцефалопатии при введении животным тетрахлорметана (четырех-хлористого углерода, СС14) и осуществить проверку действия в такой системе полипре-нольного препарата «Ропрен». Однако при использовании тетрахлорметановой модели следует учесть, что СС14 является сильным гепатотоксичным агентом, главным образом благодаря выраженному мембранотропно-му эффекту [17]. Поэтому проблема участия биологически активных препаратов может быть связана с анализом мембранного эффекта. Наиболее адекватным поставленным задачам является метод энзимологическо-го анализа, благодаря его универсальности и высокой чувствительности [2].
Ацетилхолинэстераза (НФ 3.1.1.7) является ключевым ферментом, входящим в систему холинергической передачи нервного импульса в головном мозге и мышцах. Бутирилхолинэстераза (НФ 3.1.1.8) (БХЭ) сыворотки крови синтезируется в эндоплаз-матическом ретикулуме клеток паренхимы печени. Поэтому уровень активности БХЭ является одним из показателей функционального состояния печени. Другим ключевым ферментом в обмене биогенных аминов, которые одновременно выполняют функции нейромедиаторов и гормонов (адреналин, норадреналин, серотонин, дофамин, тира-мин и другие амины), является моноаминок-сидаза (НФ 1.4.3.4) (МАО) [14].
Из литературных данных известно, что снижение активности БХЭ наблюдает-
ся при гепатите [16] и циррозе печени [11]. При этом сопоставление биохимических параметров крови и данных биопсии печени показало, что снижение активности холинэ-стеразы коррелирует с обострением гепатита и усилением степени фиброза [21]. При гепатите активность БХЭ на 3-6 день заболевания снижается до 40-50 % от минимального нормального значения и возвращается к норме на 13-15 день. Начавшееся возрастание является благоприятным прогностическим признаком. При тяжелом циррозе активность БХЭ составляет 10-20 % от нормы [11].
МАО является не только ферментом обмена нейромедиаторов и гормонов, но также обладает важной барьерной функцией по инактивации биогенных аминов [3, 18]. Митохондриальные моноаминоксидазы катализируют реакцию окислительного дезаминирования моноаминов в центральной нервной системе и периферических тканях [3]. Согласно бинарной классификации, основанной на чувствительности к ацетиленовым ингибиторам хлоргилину и депренилу, различают два типа ферментов: МАО-А и МАО-Б. МАО-А избирательно тормозится низкими концентрациями хлоргилина, МАО-Б - низкими концентрациями депренила. Основными субстратами этих двух форм являются серотонин для МАО-А и 2-фенилэтиламин для МАО-Б. В дезаминировании тирамина участвуют два типа фермента. МАО содержится практически во всех тканях животных, у млекопитающих наибольшее ее количество обнаружено в печени, почках, селезенке и в тканях мозга. Большое значение для современной медицины имеют данные о нарушениях активности МАО при патологических состояниях [4, 6].
Высокотоксичный промышленный растворитель четыреххлористый углерод (СС14) способен поражать печень и мозг [15]. В организме он подвергается ферментативному разрушению с образованием свободных радикалов, которые связываются с белковыми компонентами мембран [13]. Четыреххло-ристый углерод вызывает острое нарушение кровообращения, приводящее к недостаточному снабжению тканей кислородом.
Это отражается на функционировании многих жизненно важных органов, в первую очередь головного мозга [19]. Комплекс симптомов поражения головного мозга носит название печеночной энцефалопатии (hepatic encephalopathy).
Одним из последствий поражения печени при введении CC14 является значительное снижение скорости синтеза белка [5]. По данным литературы изменения активности БХЭ в печени при отравлении тетрахлор-метаном мало изучены.
Материал и методика
Опыты были проведены на крысах-самцах линии Wistar весом 180-200 г. Были сформированы 3 группы животных: контрольная и 2 опытные, в каждой группе по 21 крысе. У животных были замерены исходные показатели здоровья: вес и внешний вид. Рацион питания животных сбалансирован по международным стандартам. Контроль - интактные крысы. У крыс первой опытной группы вызывали острый токсический гепатит путем введения СС14 в дозе 0,2 мл / 100 г веса подкожно в течение 4 дней. Крысам 2-й опытной группы также вводили подкожно CCl4 по указанной схеме. Затем давали препарат «Ропрен» в виде масляного раствора вместе с мясным фаршем, начиная со 2-го дня эксперимента. «Ропрен» в дозе 60 мг/кг веса крысы получали на протяжении всего опыта.
По 7 животных каждой группы забивали путем декапитации на 7-е, 14-е и 21-е сутки исследования, собирали кровь и извлекали печень и почки.
Сразу после препарирования органы были заморожены и хранились в морозильной камере бытового холодильника при -5 °С. Сыворотку крови отделяли центрифугированием в течение 3 мин. при 600 g и также замораживали.
Активность БХЭ была исследована в гомогенатах печени, приготовленных на 0,0075 М калий-фосфатном буфере рН 7,4 (1 : 9 вес : объем) в стеклянном цилиндрическом гомогенизаторе и центрифугированных 3 мин. при 600 g для удаления ядер и обрывков клеток. Перед измерением актив-
ности надосадочную жидкость разводили в 100 раз тем же буфером. Сыворотку крови отделяли центрифугированием в течение 3 мин. при 600 g и перед измерением активности разводили в 100 раз тем же буфером.
Активность БХЭ измеряли по методу Эллмана [10]. Реакционная среда (1 мл) содержала: 0,05 М фосфатный буфер, рН 7,5, 0,001 М субстрата (ацетилтиохолина бромида), 0,0005 М реактива Эллмана (5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота)), 0,05 мл препарата фермента. Через 40120 минут (в зависимости от активности препарата) реакцию останавливали добавлением 0,05 мл 0,05%-го раствора прозерина и измеряли оптическую плотность раствора при 412 нм на спектрофотометре Specol (Carl Zeiss).
Источником активности МАО служили митохондрии печени и почек подопытных крыс, частично очищенные от балластного белка посредством их экстракции в 0,0075 М калий-фосфатном буфере рН 7,4. Митохондрии выделяли из 10 % гомогена-та в 0,25 М сахарозе центрифугированием 20 мин. при 13 000 g (после удаления ядер и обрывков клеток предварительным центрифугированием гомогената 3 мин. при 600 g). Полученную митохондриальную фракцию повторно осаждали центрифугированием в растворе 0,0075 М фосфатного буфера, рН 7,4 (20 мин., 13 000 g), затем суспендировали в том же буфере (20-25 мг белка в 1 мл) и хранили при -20 °С. Для получения фрагментов митохондриальных мембран суспензию митохондрий оттаивали, суспендировали в 10-кратном объеме 0,0075 М фосфатного буфера, рН 7,4, и центрифугировали на холоду при 20 000 g. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок, содержащий фрагменты митохондриальных мембран, суспендировали в том же буферном растворе.
Полученные вышеуказанными способами ферментные препараты хранили в замороженном виде при -5 °С до исследования, в течение 2-3 дней.
Содержание белка в ферментных препаратах определяли по методу Лоури. Активность МАО определяли спектрофотометри-ческим методом (при 420 нм) по количеству
аммиака, образующегося (за 60 мин.) в результате ферментативной реакции окислительного дезаминирования моноамина ти-рамин гидрохлорида (Sigma, США). Пробы (конечный объем 2,5 мл) содержали фрагменты митохондриальных мембран в количестве, соответствующем ~3 мг белка, субстрат 2мМ тирамин и 0,0075 М фосфатный буфер, рН 7,4. Пробы инкубировали 60 мин. при 37 °С в атмосфере О2. После окончания инкубации в пробы добавляли по 1 мл 50%-й трихлоруксусной кислоты, образовавшийся осадок белков удаляли центрифугированием при 7 500 g в течение 5 мин. В безбелковом фильтрате определяли освобожденный в процессе моноаминоксидазной реакции аммиак по модифицированному методу Конвея с последующей несслеризацией.
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Полученные нами данные об активности БХЭ в печени и сыворотке крови крысы представлены в таблице 1.
Установлено, что введение четырех-хлористого углерода приводит к снижению активности БХЭ (водорастворимого фермента) в печени и сыворотке крови, возникает частичная солюбилизация мембраносвязан-ных белков, происходит нарушение целостности мембран гепатоцитов, угнетение их активности и нормального функционирования. Эти параметры постепенно повышаются с течением времени и приходят в норму
Таблица 1.
Активность БхЭ (мкмоль АТх в мин на г ткани) на 7, 14, 21-й день эксперимента
День эксперимента Группа животных Печень Сыворотка крови
7 Контроль 0,33±0,04 0,68±0,05
Опыт 1 0,24±0,03* 0,23±0,03*
Опыт 2 0,21±0,09 0,59±0,05**
14 Контроль 0,43±0,07 0,87±0,08
Опыт 1 0,26±0,08* 0,46±0,03*
Опыт 2 0,39±0,04** 0,90±0,13**
21 Контроль 0,37±0,07 0,77±0,08
Опыт 1 0,49±0,09 0,83±0,06
Опыт 2 0,41±0,09 0,94±0,13
Примечание: * - статистически достоверное (р < 0,05) отличие от контроля; ** - статистически достоверное (р < 0,05) отличие от опыта 1.
Таблица 2.
Активность МАО (нмоль освобожденного аммиака в мин на мг белка) на 7, 14, 21-й день эксперимента
День эксперимента Группа животных Печень Почки
7 Контроль 2,26±0,16 0,92±0,07
Опыт 1 3,37±0,14* 1,33±0,09*
Опыт 2 3,15±0,12* 1,30±0,11*
14 Контроль 2,31±0,18 1,02±0,07
Опыт 1 3,51±0,14* 1,43±0,06*
Опыт 2 2,91±0,13** 1,39±0,08*
21 Контроль 2,40±0,17 1,11±0,07
Опыт 1 3,53±0,17* 1,58±0,11*
Опыт 2 2,73±0,18** 1,47±0,10*
Примечание: * - статистически достоверное (р < 0,05) отличие от контроля; ** - статистически достоверное (р < 0,05) отличие от опыта 1.
на 21-й день опыта. При использовании препарата «Ропрен» активность БХЭ сыворотки близка к норме уже на 7-й день, а активность БХЭ печени - на 14-й день приема.
При оценке функционального состояния печени, ее детоксикационных свойств очень характерным показателям является уровень фермента МАО в крови и в самом органе. При жировом перерождении печени, в том числе врожденном ожирении и гипергликемии печени мышей, активность МАО была повышена в среднем на 40 % [20].
Полученные результаты по изучению действия активности МАО печени и почек крыс на модели острого токсического гепатита приведены в таблице 2.
В результате проведенных исследований показано, что СС14 активирует МАО печени через 7 дней после начала эксперимента на 49 %, через 14 дней - на 52 %, через 21 день -на 47 %. Таким образом, через 3 дня, через 10 дней и 17 дней после прекращения действия канцерогена не наблюдалось восстановления активности фермента.
Известно, что многие митохондриаль-ные ферменты клеток печени, в том числе и МАО, в процессе гепатоканцерогенеза изменяют свою активность [8]. В основе этого явления лежат два основных механизма: прямое повреждающее действие химических канцерогенов и изменение репродукции митохондрий под их влиянием. Полученные в настоящей работе экспериментальные данные, возможно, могут быть объяснены возникновением под влиянием химических канцерогенов, в том числе СС14, морфофунк-циональных сдвигов, проявляющихся в стимуляции процессов пролиферации в ткани печени. Препарат «Ропрен» не оказывал восстанавливающего действия на активность МАО в печени через 7 дней эксперимента. Через 14 дней наблюдалось снижение активности МАО на 17 % по сравнению с опытом 1 (на 26 % по сравнению с контролем), через 21 день - на 23 % по сравнению с опытом 1 (на 14 % по сравнению с контролем). Таким образом, действие препарата «Ропрен» проявляется на ранних этапах воздействия и частично способствует восстановлению активности МАО печени. Влияние препарата
«Ропрен» на МАО печени может быть объяснено, во-первых, изменением молекулярных свойств самого фермента и, во-вторых, преобразованием свойств митохондриальных мембран, на которых локализована МАО. Изменение свойств самого фермента, возможно, включает связывание входящего в состав его активного центра металла ^п2+, Си2+), сульфгидрильных групп или флавино-вого кофактора.
Установлено, что введение тетрахлорме-тана активирует МАО в митохондриях почек через 7 дней после начала эксперимента на 45 %, через 14 дней - на 40 %, через 21 день -на 42 %. Таким образом, в течение всего эксперимента, после прекращения действия канцерогена и при применении препарата «Ропрен» не наблюдалось восстановления активности фермента в почках.
Заключение
В результате проведенных исследований на модели острого гепатита у крыс линии Wistar и действия препарата «Ропрен» на функциональное состояние ключевых ферментов обмена нейромедиаторов - холинэ-стераз и моноаминоксидаз - печени, почек и сыворотки крови установлено, что ведение СС14 приводит к статистически значимому снижению активности БХЭ в печени и сыворотке крови крыс и свидетельствует о поражении ткани печени. Препарат «Ро-прен» оказывает выраженное гепатопро-текторное действие уже на ранних стадиях эксперимента.
Активность МАО в митохондриях печени и почек крыс повышалась при действии че-тыреххлористого углерода в опыте и до конца эксперимента - в течение 21-го дня оставалась практически без изменений. Это указывает на изменение репродукции митохондрий, что приводит к нарушению процессов дезаминирования моноаминов в организме, и мембрано-связанная моноаминоксидаза не может полностью выполнять свою главную барьерную функцию по инактивации биогенных аминов и токсического агента - СС14. И как следствие нарушение функции МАО ведет к нарушению обмена нейромедиаторов и гормонов. Препарат «Ропрен» в начальной
стадии эксперимента не оказывал восстановительного действия на активность МАО в печени и почках. Однако со второй половины эксперимента и до конца исследования - вызывал снижение высокой активности МАО печени, возникшей в результате токсического гепатита, на 17 % и 23 % соответственно по сравнению с опытом 1, т. е. способствовал восстановлению активности МАО, соответствующей контролю интактных крыс.
Список литературы
1. Беспалов, В. Г. Изучение и применение лечебно-профилактических препаратов на основе природных биологически активных веществ / под ред. В. Г. Беспалова, В. Б. Некрасовой. - СПб., 2000.
2. Бресткин, А. П. Холинэстеразы наземных животных и гидробионтов / А. П. Бресткин, Л. П. Кузнецова, С. Н. Моралев, Е. В. Розенгарт, Л. М. Эпштейн. -Владивосток, 1997. -466 с.
3. Горкин, В. З. Система аминоксидаз: современные достижения в исследованиях природы, функций и их нарушений / В. З. Горкин, Л. И. Овчинникова // Вопросы мед. химии. - 1993. - Т. 39. - № 4. - С. 2-10.
4. Горкин, В. З. Аминоксидазы и их значение в медицине / В. З. Горкин. - М. - 1981. - 335 с.
5. Колобаев, В. И. Включение 1-14С-глицина в общий белок и субклеточные фракции печени крыс в различные сроки после введения тетрахлорметана / В. И. Колобаев // Вопр. мед. хим. - 1977. - Т. 1. -С. 23-26.
6. Овчинникова, Л. Н. Природные модуляторы ами-ноксидаз / Л. Н. Овчинникова // Вопр. мед. химии. -1988. - Т. 34. - № 6. - С. 16-23.
7. Свидерский, В. Л. Сравнительное исследование действия полипренольного препарата «Ропрен» из хвойных растений на ключевые ферменты холинерги-ческого и моноаминергического типов нервной передачи / В. Л. Свидерский, А. Е. Хованских, Е. В. Розен-гарт, С. Н. Моралев, О. В. Ягодина, В. С. Горелкин, И. Н. Басова, Б. Н. Кормилицын, Т. В. Никитина, В. И. Рощин, В. С. Султанов //ДАН. - 2006. -Т. 408. - № 3. - C. 414-417.
8. Холодосова, И. А. Биохимические аспекты канцерогенеза / И. А. Холодосова. - М. -1979. - 335 с.
9. Bluger, A. C. Harvesting and utilization of tree foliage / A. C. Bluger, J. P. Rubens , V. I. Roshchin // IUFRO project group. - Riga, 1989. - P. 4-19.
10. Ellmann, G. H. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity / G. H. Ellmann, R. D. Countney, V Jr. Anders, K. M. Featherstone // Biochem. Pharmacol. - 1961. - V. 7. - P. 88-95.
11. Kekwick, R. G. Serum-cholinesterase activity in health and in liver disease / R. G. Kekwick // Biochem. J. - 1960. - Vol. 76. - P. 420-424.
12. Khidrova, N. K. Plant polyprenols and their biological activity / N. K. Khidrova, Kh. M. Shakhidoya-tov // Chemistry of natural compounds. - 2002. -V. 38. - N 2. - P. 107-121.
13. Melin, A. M. Fourier-transform infrared spectroscopy: a pharmacotoxicologic tool for in vivo monitoring radical aggression / A. M. Melin, A. Perromat, G. Deleris //Can. J. Physiol. Pharmacol. - 2001. -Vol. 79. - N. 2. - P. 158-165.
14. Moralev, S. N. Comparative Enzymology of Cholinesterases / S. N. Moralev, E. V. Rozengart // La Jolla. Ca. International University Lines. - 2007. - 485 p.
15. Pentyala, S. N. Effect of carbon tetrachloride on inositol 1,4,5-trisphosphate dependent and independent regulation of rat brain microsomal Ca2+ flux / S. N. Pentyala, P. J. Vig, B. S. Sekhon, D. Desaiah // Cell. Signal. - 1994. - Vol. 6. - N. 4. - P. 561-567.
16. Pietschmann, H. Differences in serum cholinesterase and serum glutamic oxalacetic transaminase activity in liver diseases / H. Pietschmann // Wien. Z. Inn. Med. - 1960. - Vol. 41. - P. 409-14.
17. Sanzgiri, U. Y. Uptake, distribution, and elimination of carbon tetrachloride in rat tissues following inhalation and ingestion exposures / U. Y. Sanzgiri, V. Srivatsan,
C. E. Dallas // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 1997. -V. 143. - N 1. - P. 120-129.
18. Silverman, R. B. Radical thoughts about the life of MAO / R. B. Silverman // Prog. Brain. Res. - 1995. -V. 106. - P. 23-31.
19. Stanley, N. N. Effect of liver failure on the cerebral circulatory and metabolic responses to hypoxia in the goat / N. N. Stanley, N. S. Cherniack // Clin. Sci. Mol. Med. -1976. - Vol. 50. - N. 1. - P. 15-23.
20. Tong, J. H. Liver monoamine oxidase in the obese-hyperglycaemic (ob/ob) mouse / J. H. Tong, M. Limson-Zamora, A. D'lorio, N. Begin-Heick // Biochem J. -1979 - V. 177. - P. 943-949.
21. Zou, Z. S. Relationship between cholinesterase, prothrombin activity and albumin and the pathology of the liver / Z. S. Zou, S. J. Xin, B. S. Li, J. M. Zhao, Z. G. Liu, Y. L. Mao, H. Q. Xing, H. H. Shen, X. Qi,
D. Y. Chen, J. M. Chen // Zhonghua Shi Yan. He. Lin. Chuang. Bing. Du Xue. Za Zhi . - 2001. - Vol. 15. - N. 4. - P. 349-351.
Ф
Аппарат для импульсной биосинхронизированной электромагнитной терапии «УМИ-05»: www.invetbio.spb.ru/products/magnit.html
