CC BY
33
INJ]
М1ЖНАРОДНИЙ НЕВРОЛОГ1ЧНИЙ ЖУРНАЛ
INTERNATIONAL NEUROLOGICAL JOURNAL 1
МЕЖДУНАРОДНЫЙ НЕВРОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ /ORIGINAL RESEARCHES/
УДК 577.1:591.481.1:616-001-036.17-089.843:591.3:591.88 БАРАНЕНКО Б.О.
1нститут нейрох/рургИ im. акад. А.П. Ромоданова НАМН Укра1ни, м. Ки/в
ДОСЛЦЖЕННЯ ДЕГЕНЕРАТИВНИХ ПРОЦЕОВ У НОРАДРЕНАЛНЕРПЧНИХ СИСТЕМАХ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ЩУР1В З ТЯЖКОЮ ЧЕРЕПНО-МОЗКОВОЮ ТРАВМОЮ ТА ВПЛИВ НА НИХ ТРАНСПЛАНТАЦП ФЕТАЛЬНО1
НЕРВОВО1 ТКАНИНИ
Резюме. Проведено до^дження вмсту норадреналту тарiвня експреси гена Ваху корi лiвоiта право' твкуль, гшоталамуа, гшокамш та середньомумозку щурiв через 30дшв псля ексnерuментально'iтяжко' черепно-мозково' травми та трансплантаци фетально' нервово' тканини. Встановлено, що тяжка черепно-мозкова травма призводить до зниження вмсту норадреналшу в корi травмовано' niвкулi та гтоталамуа, а також до тдвищення рiвня проапоптичного гена Вах у вах до^джених структурах головного мозку, що свiдчить про наявшсть деструктивних процеав у мозку тварин у вiддалений перод псля травми. Трансплантащя фетально'нервово'1'тканини експериментальним щурамз тяжкою черепно-мозковою травмою сприяла нормал1защ до^джуваних показнитв.
Ключовг слова: тяжка черепно-мозкова травма, трансплантащя фетально' нервово'1' тканини, норадреналт, апоптоз.
Тяжка черепно-мозкова травма (тЧМТ) е одшею з найбтьш поширених причин швалщизаци та смертност населення молодого та середнього вшу. ТЧМТ викликае первинш локальш та вторинш генератзоваш оргашчш змши в нервовш тканиш, що стають фактором ризику розвитку рiзноманiтних вщдалених шслятравматичних ускладнень у центральнш нервовш системi та в органiзмi в цшому. В основi розвитку значно! частини вщдалених наслщшв тЧМТ лежить пошкодження штегруючих систем мозку [1].
Важливим моментом мiжклiтинноl штеграци в нервовш тканиш е система нейромедiаторiв, на якш базуеться формування структурно-функцюнально! мозатносп мозку. Виходячи з цього, необхщним е ви-вчення питання щодо стану основних нейромедiатор-них систем мозку в умовах черепно-мозково! травми, серед яких важливе мiсце посiдае норадреналшерпчна система мозку. Норадреналшерпчну систему вважають iнтегратором поведшкового збудження та автономних функцiй; з порушенням и функцiонування пов'язують розвиток серцево-судинних захворювань, психiчних порушень, етлепси [2].
Незважаючи на поглиблене вивчення причин виникнення вторинного тканинного дефщиту, який розвиваеться пiсля ЧМТ, мехашзм регуляцп загибелi нейронiв до кшця не встановлений. Вiдстрочена заги-бель нейрошв пiсля травми мозку бтьше пов'язуеться з процесами апоптозу нейрошв та дальних клiтин, i саме апоптоз вважаеться визначальним фактором у патофiзюлоril [3]. Проте наявнi в лiтературi данi щодо загибелi клггин головного мозку пiсля ЧМТ стосують-ся, як правило, гострого шслятравматичного перiоду, тодi як у вщдалеш термiни цi процеси залишаються менш вивченими.
Сьогодш продовжуеться пошук молекул, здатних ефективно шпбувати каскаднi механiзми загибелi
Адреса для листування з автором: Бараненко Б.О.
04050, м. Ки!в, вул. П. Майбороди, 32 1нститут нейроирурги 1м. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украши
© Бараненко Б.О., 2014
© «М1жнародний невролопчний журнал», 2014 © Заславський О.Ю., 2014
нейронгв та компонентгв нейроглй'. Останнгм часом набула розвитку та теоретичного обГрунтування тка-нинна тeрапiя. Найбiльш ефективною для досягнення поставлено! мети вважаеться фетальна нервова тканина (ФНТ) [4].
Зважаючи на важливу роль процесгв апоптозу у патoгeнeзi черепно-мозково! травми та високу чут-ливiсть до впливу черепно-мозково! травми нейрошв норадреналгнерггчних систем мозку, ми провели до-слгдження рiвня експресй' проапоптичного гена Bax, а також умiсту норадреналгну в структурах головного мозку щурiв, яким була нанесена тяжка ЧМТ, та впливу на цг показники трансплантаци фетально! нервово! тканини (тФНТ).
Матерiали й методи досл^дження
У дoслiджeннях використовували самцiв безпород-них статeвoзрiлих бГлих щурiв масою 180—220 г, а також вагГтних самок з 18-денними eмбрioнами.
Для моделювання тяжко! черепно-мозково! травми застосовували пружинний ударник, модифгкований для нанесення травм малим лабораторним тваринам [5]. Удар наносили в лiву тгм'яно-скроневу дiлянку. При цьому тварин не фгксували.
Для трансплантаци використовували фетальну нервову тканину сенсомоторно! дiлянки кори мозку 18-денних плoдiв щурiв. Перед трансплантацiею видаляли тканинний детрит, що утворився у трав-мoванiй дГлянцг. У лунку пiсля хiрургiчнo!' обробки вводили 2 мм3 ембргонально! нервово! тканини. Трансплантацгю проводили через 2 години шсля нанесення тЧМТ. Для анестези застосовували нембутал (4 мг/100 г живо! ваги). Тварин експериментальних груп декапгтували через 30 дгб шсля нанесення травми та трансплантацп одночасно з тваринами контрольно! групи. Вилучену шсля декаштаци тканину окремих структур головного мозку швидко заморо-жували у рГдкому азотг.
Визначення норадреналгну здгйснювали методом високоефективно! рГдинно! хроматографГ! з електрохг-мгчним детектуванням [6]. Хроматографгю здгйснюва-ли на мгкроколонковому хроматографг «Миллихром» (Росгя).
Екстракцгю РНК здгйснювали фенольним методом у присутностг детергентгв та шпбггоргв нуклеаз [7]. ВихГд та чистоту препарату РНК оцгнювали за поглинанням проби при 260 та 280 нм. КДНК син-тезували з використанням 1—2 мкг РНК та 100 нг олгго(дТ)1218 в 10 мкл розчину, що мгстив 50 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 75 мМ KCl, 3 мМ MgCl2, 50 мМ дитготрейтолу, сумгш дНТФ (1 мМ кожного) та 200 од M-Mlv зворотно! транскриптази (рекомбгнантно!). Для визначення експресГ! гена Bax використовували праймери — 5'-CACCAGCTCTGAACAGATCATGA-3' та 5'-TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGT-3' [8], продукт амплгфгкацГ! становив 541 п.н. 35 циклгв амплгфгкацГ!
%
250200-
150100500
Норадренапш
X
II
1
шм
1 2 3
а) лк
%
300-,
1 2 3 ПК
1 2 3 Гт
Вах
1 2 3 Гк
1 2 3 СМ
2502001501005001 2 3
б) ЛК
X
*
Ii «I» d
I all 1»
123 123 123 123 ПК Гт Гк СМ
Рисунок 1. Умiст норадреналну (а) та р1вень експресй гена Вах (б) у структурах головного мозку щурiв (ЛК — кора л'то! п1вкул1, ПК — кора правоI п1вкул1, Гт — ппоталамус, Гк — ппокамп, СМ — середшй мозок) шсля тЧМТ та трансплантацп ФНТ: 1 — контрольн1 тварини, 2 — тварини з тяжкою черепно-мозковою травмою, 3 — тварини з Iмплантованою шсля травми фетальною нервовою тканиною; * — Р < 0,05
було здшснено при температурi вщпалу 55 °С. Вiзуалi-защя продуклв амплiфiкацii проводилася за допомогою електрофорезу в 2% агарозному гель
Статистичну обробку даних проводили з використанням ^критерш Стьюдента.
Результати та Тх обговорення
Для вщповщ на питання про стан метаболiзму норадреналшерпчних систем та наявшсть дегенеративних процешв у тканиш мозку шсля тяжко черепно-мозковоi травми та трансплантаци ми дослщжували вмiст нор-адреналшу, а також рiвень експреси проапоптичного гена Вах в окремих структурах головного мозку щурiв, а саме: у корi лiвоi (травмованоi) та правоi пiвкуль, п-поталамусi, гшокамш та середньому мозку. Дослiдження проводили в контрольнш групi тварин, у груш тварин iз тЧМТ через 30 дiб пiсля '11 нанесення та в груш тварин iз тЧМТ та тФНТ 18-денних ембрюшв щурiв (рис. 1). Отриманi результати вказують на наявнiсть суттевих дегенеративних процешв у функцюнальних структурах головного мозку експериментальних тварин через один мюяць шсля травмування.
Так, у мющ удару — лiвiй корi через 30 дiб пiсля тЧМТ рiзко (у 2,5 раза) знижений рiвень норадреналiну i, навпаки, тдвищений (у 2,3 раза порiвняно з групою контрольних тварин) рiвень експресй гена Вах, який е
показником активност апоптичних процешв. У тварин, яким шсля тЧМТ була iмплантована ФНТ сенсомо-торно! кори, у тканиш кори лiво! пiвкулi вiдмiчаеться уповшьнення активностi процесiв апоптозу, а також шдвищення вмiсту норадреналшу (на 11 %), але повно-го повернення цих показниыв до !х рiвня в iнтактних тварин не вщбуваеться. Динамiка вмiсту норадреналiну в корi право! пiвкулi вiдрiзняеться вiрогiдним його пщ-йомом як у груш травмованих тварин, так i в груш тварин з тЧМТ та тФНТ (189 та 192 % вщповщно). Наведеш даш можуть вказувати на розвиток компенсаторних процешв у протилежнш щодо зони травмування швкуль При цьому рiвень експресй проапоптичного гена Вах у корi право! швкуш тварин, що потягали ди тЧМТ, все ж значно перевищував рiвень даного показника в штак-тних тварин, хоча ця рiзниця була дещо менш виражена порiвняно з корою травмовано! пiвкулi. Трансплантащя фетально! нервово! тканини сприяла нормал1защ! рiвня експресй Вах у цьому вщдш мозку.
Отже, результати дослщжень дегенеративних проце-сiв у корi головного мозку щурiв у тслятравматичному перiодi свiдчать про формування шшо! нейрохiмiчно! органiзацi! iнтегративних взаемодiй, характерною ри-сою яко! е пдвищення мiжпiвкульно! асиметри, що, як вщомо, властиве мозку з пiдвищеною судомною готов-нiстю. 6 дослiдження, що вказують на пряму кореляцiю вираженост мiжпiвкульно!' асиметри з норадреналiном та рiвнем судомно! готовностi [9]. Трансплантащя ФНТ призводить до зсуву цього негативного сшввщношення.
Результати дослiджень умюту норадреналiну та рiвня експресй Вах у гшокамш — структурi лiмбiчноl' системи мозку, що також вщграе одну з найважливiших ролей у формуванш ептептиформних станiв пiсля ЧМТ, свщчать, що через 30 дiб пiсля травми у тварин з тЧМТ та тЧМТ + тФНТ рiвень норадреналшу в гiпокампi близький до контрольного значення, рiвень експресй проапоптичного гена Вах в гшокамш щурiв, яким була нанесена тЧМТ, перевищував цей показник в контрольнш груш тварин на 53 %. Щ змши е менш вираженими порiвняно з iншими дослiджуваними структурами мозку. Трансплантащя ФНТ призводить до нормалiзацi! в гшокамш як ушсту норадреналшу, так i рiвня експресй гена Вах.
Секреторна дiяльнiсть гшоталамуса регулюеться рiзними нейромедiаторними системами мозку; нор-адреналiн, як вважають, мае бтьш виражену стимулюючу дю. З отриманих нами даних видно, що через 30 даб пiсля травми вмют норадреналiну в цiй структурi у травмованих тварин був у 1,4 раза нижчим, шж у контрольних. Iмовiрно, що одшею з причин недостатностi нейроме-дiаторного забезпечення норадреналшерпчно! системи в гшоталамуш при тЧМТ е досить висока штенсивнють апоптичних процесiв у цш структурi мозку навiть через 30 дiб пiсля Г! нанесення, про що свщчить рiвень експресй гена Вах (в 2 рази вище порiвняно з контрольною групою). Трансплантацiя фетально! нервово! тканини сприяла поверненню вмюту норадреналшу до рiвня
контрольних значень. Експрешя гена Вах у гiпоталамусi тварин, яким була трансплантована ФНТ, також значно знизилася, але все ще перевищувала показник контрольно! групи. Отже, тяжка ЧМТ призводить до зниження вмюту норадреналшу в гшоталамуш тварин навпъ через один мюяць пiсля !Г нанесення, що е вагомою причиною порушення адекватного реагування функцюнальних систем у вщповщь на зовнiшнiй вплив i може призводити до розвитку вщдалених наслiдкiв, що проявляються у виглядi ендокринних розладiв, а транспланташя ФНТ е перспективним методом запобиання таким процесам.
Пюлятравматичш змiни, як свщчать клiнiчнi данi, у рядi випадк^в можуть провокувати паркiнсонiчнi явища. Особлива роль в оргашзацп рухово! функцГГ належить нiгрострiарному дофамiнергiчному шляху; норадреналь ну вiдводиться роль фактора, що справляе модулю-ючий вплив на актившсть дофамiнергiчних нейронiв на рiвнi середнього мозку [10]. За нашими даними, умют норадрен^iну та рiвень експресГГ гена Вах в середньому мозку тварин через 30 даб шсля перенесено! тЧМТ не вщ-рiзнявся вiд iнтактних щурiв, а у тварин з тЧМТ та тФНТ показник умюту норадреналшу був навиъ на 35 % вищий за контрольний. Отже, вщдалеш насл!дки ЧМТ у виглядi порушень рухових функцiй, ймовiрно, спричиняються розладами функцюнування iнших нейромедiаторних систем мозку або розладами !х iнтеграцi!.
Таким чином, отримаш данi свiдчать про високу актившсть процешв апоптозу у бтьшоста дослщжених структур головного мозку та порушення нейромедiа-торного, зокрема норадреналшерпчного, забезпечення !х функцiонування (особливо кори травмовано! швкуш та гшоталамусу) у вiддаленому пiслятравматичному перiодi. Введення фетально! нервово! тканини сприяе гальмуванню процесiв апоптозу та вiдновленню вмюту норадреналшу в рiзних функцiон^ьних структурах.
Висновки
Тяжка ЧМТ призводить до зниження вмюту норадреналшу у функцюнальних структурах головного мозку щурiв, а саме у корi лiво! (травмовано!) швкуш та гшоталамуш через 30 дiб пiсля травми. У корi контра-латер^ьно! право! швкуш мозку спостерiгаеться ста-тистично вiрогiдне пiдвищення вмiсту норадрен^iну.
Рiвень експресй проапоптичного гена Вах у головному мозку щурiв через 30 дiб шсля тЧМТ перевищуе контрольш значення у бтьшоста дослiджених структур головного мозку: у корi лiво! (травмовано!) пiвкулi та гiпоталамусi — бтьше нiж на 200 %, у гшокамш та корi право! швкуш мозку — на 153 та 190 % вщповщно.
Трансплантащя алогенно! фетально! нервово! тканини сприяе пщтримщ вмiсту норадреналiну у гшоталамуш травмованих тварин в межах, близьких до контрольних, та його шдвищенню, але не повному вщновленню в лiвiй (травмованiй) пiвкулi головного мозку, а також гальмуванню рiвня ексреси Вах у дослiджених структурах головного мозку.
Список лператури
1. Patt S. Neuropathologies sequelae of traumatic injury in the brain. An overview/S. Patt, N. Brodhun//Exp. Toxicol. Pathol. — 1999. — Vol. 51, № 2. — P. 119-123.
2. Отелин В.А. Функциональная морфология медиаторных систем головного мозга / Отелин В.А. // Журн. невр. и психиатр. — 1998. — № 1. — С. 54-58.
3. Raghupathi R. Cell death mechanisms following traumatic brain injury / R. Raghupathi // Brain Pathol. — 2004. — Vol. 14, № 2. — Р. 215-222.
4. Politis M. Brain imaging after neural transplantation / M. Poli-tis, P. Piccini//Prog. Brain Res. — 2010. — № 184. — P. 193-203.
5. Гельфанд В.Б. Закрытая черепно-мозговая травма / В.Б. Гельфанд, М.Д. Маламуд, В.Г. Истратов. — Кишинев: Штиинца, 1986. — 278 с.
6. Бонецкий А.А. Определение катехоламинов плазмы крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на
Бараненко Б.А.
Институт нейрохирургии им. акал. А.П. Ромоданова НАМН Украины, г. Киев
ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ В НОРАДРЕНАЛИНЕРГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС С ТЯЖЕЛОЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМОЙ И ВЛИЯНИЕ НА НИХ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ФЕТАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ ТКАНИ Резюме. Исследовано содержание норадреналина и уровень экспрессии гена Вах в коре левого и правого полушарий, гипоталамусе, гиппокампе и среднем мозге крыс через 30 дней после экспериментальной тяжелой черепно-мозговой травмы и трансплантации фетальной нервной ткани. Установлено, что тяжелая черепно-мозговая травма приводит к снижению содержания норадреналина в коре травмированного полушария и гипоталамусе, а также к повышению уровня проапоптического гена Вах во всех исследованных структурах головного мозга, что указывает на наличие деструктивных процессов в мозге животных в отдаленный период после травмы. Трансплантация фетальной нервной ткани экспериментальным крысам с тяжелой черепно-мозговой травмой способствовала нормализации исследованных показателей.
Ключевые слова: тяжелая черепно-мозговая травма, трансплантация фетальной нервной ткани, норадреналин, апоптоз.
микроколоночном хроматографе «Миллихром»/ А.А. Бонецкий, В.И. Федоров //Лаб. дело. — 1989. — № 4. — С. 21-25.
7. Клеменс М. Выделение эукариотической матричной РНК (мРНК)/М. Клеменс//Транскрипция и трансляция. Методы: пер. с англ.[редкол.:Б.Хеймс, С.Хиггинс]. — М.:Мир, 1987. — C. 254-275.
8. Diminished penile expression of vascular endothelial growth factor and its receptors at the insulin-resistant stage of a type II diabetic rat model: a possible cause for erectile dysfunction in diabetes / S. Jesmin, I. Sakuma, A. Salahldin [et al.]// J. of Mol. Endocrinology. — 2003. — № 31. — Р.401-418.
9. Сергиенко Н.Г. Биогенные амины и возбудимость головного мозга / Н.Г. Сергиенко, В.И. Грищенко, Г.А. Логинова. — К.: Наукова Думка, 1992. — 147с.
10. McKeran R.O. The biochemistry of diseases of the central nervous system / R.O. McKeran // Biochemical aspects of human disease [Ed. R.S. Elkells, A.S. Tavil]. — London — Edinburg: Oxford, 1983. — P. 435-480.
Отримано 22.10.13 I
Baranenko B.O.
Institute of Neurosurgery named after acad. A.P. Romodanov of National Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine
RESEARCH OF DEGENERATIVE PROCESSES IN THE BRAIN NORADRENERGIC SYSTEMS OF RATS WITH SEVERE CRANIOCEREBRAL INJURY AND IMPACT ON THEM OF FETAL TISSUE TRANSPLANTATION Summary. Norepinephrine content and level of Bax gene expression were investigated in the left and right hemisphere cortexes, hypothalamus, hippocampus and mesencephalon of rats in 30 days after an experimental severe craniocerebral injury and fetal nervous tissue transplantation. It is discovered that severe craniocerebral injury causes the decline of norepinephrine content in the damaged hemisphere cortex and hypothalamus and also to increase in the level of proapoptotic Bax gene expression in all investigated brain structures that indicates destructive processes in the brain of animals in a remote period after a trauma. Fetal nervous tissue transplantation to experimental rats with severe craniocerebral injury contributes to the normalizations of investigated indexes.
Key words: severe craniocerebral injury, fetal nervous tissue transplantation, norepinephrine, apoptosis.
