CC BY
23
Известия ТИНРО
2018 Том 195
ТЕХНОЛОГИЯ ОБРАБОТКИ ГИДРОБИОНТОВ
УДК 594-1.05
Е.П. Караулова1, Х.Д. Юн2, Дж.Г. Ким3, С.Х. Пак3, Т.Н. Слуцкая1,
Е.В. Якуш1*
1 Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр, 690091, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4; 2 Биологическая пищевая компания, 120-12, г. Косон, Республика Корея; 3 Кенгсанский национальный университет, 38, г. Тхоньян, Республика Корея
ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТКАНЕЙ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ
Исследована биологическая активность тканей и ферментных гидролизатов трех видов двустворчатых моллюсков: корбикула японская Corbiculajaponica, мерценария Mercenaria mercenaria, анадара Броутона Anadara broughtonii. Установлено, что при ферментативном гидролизе исследуемых мягких тканей двустворчатых моллюсков, происходит достоверное увеличение величины антирадикальной активности для всех исследуемых образцов: в 8,0 раза для C. japonica, в 3,0 раза для M. mercenaria и в 2,5 раза для A. broughtonii. Максимальная антитромбоцитарная активность была определена для гидролизата мягких тканей C. japonica при концентрации белкового гидролизата 10 мг/мл и составила 0,0823 ед. Ангиотензин-ингибирующей активностью обладали только гидролизаты M. mercenaria в концентрации гидролизата 10-100 мг/мл. Максимальная активность в отношении альфа-амилазы и альфа-гликозидазы наблюдалась для гидролизатов мягких тканей M. mercenaria и составила соответственно 7,5 и 7,2 % при концентрации гидролизата 1 мкг/мл. Гепатопротекторная активность, измеренная по выживаемости гепатоцитов HepG2, проявлялась при концентрации гидролизата корбикулы и мерценарии от 100 мкг/мл, анадары — от 200 мкг/мл.
Ключевые слова: двустворчатые моллюски, антиоксидантная активность, ан-гиотензин-ингибирующая активность, гепатопротекторная активность, биологическая активность.
DOI: 10.26428/1606-9919-2018-195-253-264.
Karaulova E.P., Yoon H.D., Kim J.G., Park S.H., Slutskaya T.N., Yakush E.V. Study on biological activity of tissues from bivalve mollusks // Izv. TINRO.—2018. — Vol. 195. — P. 253-264.
* Караулова Екатерина Павловна, кандидат технических наук, старший научный сотрудник, e-mail: [email protected]; ЮнХу Донг, доктор философии, директор, e-mail: hdyyoon@gmail. com; Ким Джонг Гун, профессор, e-mail: [email protected]; Пак Си Хан, доктор философии, заведующая отделом, e-mail: [email protected]; Слуцкая Татьяна Ноевна, доктор технических наук, профессор, заведующая отделом, e-mail: [email protected]; Якуш Евгений Валентинович, кандидат химических наук, доцент, заместитель директора, е-mail: [email protected].
Karaulova Ekaterina P., Ph.D., sénior researcher, e-mail; [email protected]; Yoon Ho Dong, Ph.D., director, e-mail: [email protected]; Kim Jeong Gyun, professor, e-mail: [email protected]; Park Si Hyang, Ph.D., head of department, e-mail: [email protected]; Slutskaya Tatiana N., D.Sc., professor, head of department, e-mail: [email protected]; Yakush Eugeny V., Ph.D., deputy director, е-mail: [email protected].
Biological activity of tissues and enzyme hydrolyzates is investigated for three species of bivalve mollusks: Corbicula japónica, Mercenaria mercenaria, and Anadara broughtonii. Antiradical activity of all samples has increased significantly during their enzymatic hydrolysis: in eight times for C. japónica, in three times for M. mercenaria, and in 2.5 times for A. broughtonii. The highest anti-trombolitic activity (0.0823 units) is found for the hydrolyzate of C. japónica in concentration of 10 mg/mL. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity is found only for the hydrolyzate of M. mercenaria in concentration of 10-100 mg/mL. The maximum inhibitory activity for alpha-amylase and alpha-glycosidase (7.5 and 7.2 %, respectively) is observed for the hydrolyzate ofM. mercenaria in concentration 1 mg/mL. Hepatoprotective activity, measured by survival rate of HepG2 hepatocytes, is detected for the hydrolyzate of tissues for all species in weak concentrations: 0.1 mg/mL for C. japonica and M. mercenaria and 0.2 mg/mL for A. broughtonii.
Key words: bivalve mollusk, antiradical activity, angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity, hepatoprotective activity, biological activity.
Введение
Ткани гидробионтов характеризуются высоким содержанием веществ, обладающих широким спектром биологической активности и могут быть использованы в пищевой технологии как основа для получения биологически активных добавок (БАД). Тем не менее широкое применение и производство БАД из сырья морского происхождения ограничивается их высокой себестоимостью. Одним из путей снижения себестоимости БАД является комплексное и рациональное использование всех органов и тканей морских гидробионтов, в том числе создание технологий получения белковых гидролизатов и концентратов.
Полученные ранее результаты (Оводова и др., 1990; Аюшин и др., 1997; Купина и др., 2015) свидетельствуют о том, что двустворчатые моллюски являются источником полноценного белка и биологически активных компонентов, могут использоваться в качестве функционального продукта питания. Установлено, что гидролиз белков приводит к достоверному повышению антирадикальной активности (АРА) за счет увеличения количества биологически активных пептидов с молекулярной массой от 1 до 10 кДа (Караулова и др., 2015, 2017). Природные биоантиокислители представляют собой широкий класс химических соединений, которые, помимо прямого антирадикального действия, могут проявлять противоопухолевую, антиишемическую, противовоспалителную, гепатопротекторную активности. Из литературы известно, что пептиды проявляют антиканцерогенные (Leng et al., 2005) и иммуномодулирую-щие свойства (Chalamaiah et al., 2012), снижают уровень холестерина (Chijimatsu et al., 2009), проявляют гепатопротекторный эффект (Hsu et al., 2010). Были выделены пептиды, ингибирующие действие ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), который обладает сосудосуживающим действием и повышает риск заболевания атеросклерозом, инсультом, инфарктом миокарда (FitzGerald, Meisel, 2000). Показано, что пептиды группы казеин-макропептидов обладают антитромбоцитарным эффектом и подавляют агрегацию тромбоцитов (Dunehoo et al., 2006). В литературе описаны положительные результаты испытаний антирадикальных препаратов в профилактике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний (Воронина, 2001; Evran et al., 2014; Sui, Gao, 2014). Установлено, что комплекс пептидных фракций нормализует метаболизм в клетках и регулирует функции печени, снижает токсический эффект лекарств и алкоголя, проявляя гепатопротекторные свойства (Degirolamo et al., 2015; Turcic, Stambuk, 2015). Пептиды используются в профилактике сахарного диабета за счет ингибирования ферментов, участвующих в расщеплении углеводов, — альфа-амилазы и альфа-глюкозидазы, что достоверно приводит к снижению уровня глюкозы в крови (Tundis et al., 2011). Клинические исследования показали, что применение в комплексной терапии сахарного диабета антиоксидантов пептидной природы способствует снижению выраженности микро- и макроангиопатий, улучшает показатели гликемического профиля (Bolignano 2017; Souza, 2017). Имеются данные о возможности лечения сахарного диабета 2-го типа с использованием биоактивных
пептидов из морских организмов (Xia et al., 2017). Многообразие природных форм антиоксидантов, их фармакологических и биологических эффектов может сыграть решающую роль в снижении риска развития раковых и сердечно-сосудистых заболеваний, болезней Альцгеймера и Паркинсона, артритов, диабета, замедлить процессы старения организма.
В этом контексте закономерным представляется предположение о наличии не только антирадикальной, но и других типов биологической активности в тканях исследуемых гидробионтов после ферментативного гидролиза. В данной работе мы продолжили исследование изучение биологической активности гидролизатов гидро-бионтов с целью оценить их гепатопротекторную, антидиабетическую, ангиотензин-ингибирующую и антитромбоцитарную активность.
Материалы и методы
В качестве сырья для исследований использовали мягкие ткани и внутриполост-ную жидкость двустворчатых моллюсков: корбикула японская Corbicula japonica, мерценария Mercenaria mercenaria, анадара Броутона Anadara broughtonii.
Для получения гидролизатов использовали ферментный препарат «Protamex» (Biosis, Busan, South Korea). Гидролиз гомогенатов проводили при температуре 50 оС в течение 3 ч при рН 7. Гидролиз останавливали нагреванием смеси до 80 оС в течение 15 мин. Для оценки биологической активности использовали лиофильно высушенные гидролизаты.
Суммарную антирадикальную активность определяли с использованием 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) (Molyneux, 2004) с регистрацией оптической плотности раствора при 517 нм на планшетном спектрофотометре Polarstar Omega.
Антирадикальную активность рассчитывали по формуле
.А.Р -А-«
АРА -- ■ 100 %,
Ас
где Ac — величина оптической плотности раствора сравнения; As — оптическая плотность исследуемого раствора.
Величину антирадикальной активности рассчитывали как параметр ЕС 50 %—количество исследуемого вещества, необходимое для 5 0 %-ного восстановления радикала ДФПГ.
Гепатопротекторную активность оценивали in vitro с применением культуры клеток человеческих гепатоцитов HepG2. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 (Sigma, USA), содержащей 10 % бычьей сыворотки (Biochrom KG, Germany), с добавлением пенициллина (100 ед./мл) и стрептомицина (100 мг/мл) при 37 оС в увлажненной атмосфере, содержащей 5 % CO2. Для воспроизведения модельной патологии печени применялся 10 %-ный этиловый спирт. Оценку выживаемости клеток проводили с использованием системы подсчета клеток Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Кумамото, Япония).
Антитромбоцитарную активность определяли в соответствии с методом Chang с соавторами (2005) по реакции тромбина с фибриногеном. Антитромбоцитарный эффект оценивали по величине снижения оптической плотности раствора при 655 нм на микропланшетном сканере (Ultraspec 2100 Pro, Amersham Biosciences). За единицу активности принимали количество фермента, необходимого для уменьшения оптической плотности на 0,1 за 60,0 мин реакции.
Ингибирующую активность в отношении альфа-амилазы определяли спектрофо-метрическим методом Hansawasdi с соавторами (2000) по скорости ферментативного гидролиза крахмала. Оптическую плотность измеряли при 595 нм с использованием микропланшетного сканера (Ultraspec 2100 Pro, Amersham Biosciences). Ингибирующую активность рассчитывали по формуле
Í(Ac+)-(Ac-))-(As - Ab)
активностьа-амилазы = ----——- ■ 100%,
(Ac+)-(Ac-)
где активность а-амилазы — ингибирующая активность в отношении альфа-амилазы; (Ас+) — 100 %-ная оптическая плотность раствора субстрата с панкреатической ами-
лазой (Sigma, ЕС 3.2.1.1); (Ас-) — 0 %-ная оптическая плотность раствора субстрата без фермента; As — оптическая плотность исследуемого образца; Ab — оптическая плотность раствора сравнения.
Определение ингибирующей активности в отношении альфа-гликозидазы проводили с использованием метода Apostolidis с соавторами (2006) по изменению количества нитрофенил-глюкопиронозида. Оптическую плотность измеряли при длине волны 400 нм с использованием планшетного сканера (Ultraspec 2100 Pro, Amersham Biosciences) и рассчитывали степень ингибирования активности фермента по формуле
А - А
активностьа-гликозидазы = -£-—- ■ 100%,
где Ac — величина оптической плотности раствора сравнения; As — оптическая плотность исследуемого раствора.
Оценку ингибирующей активности в отношении ангиотензинпревращающего фермента проводили в соответствии с методом, описанным Wanasundara с соавторами (2002), основанным на количественном измерении гиппуровой кислоты, выделяющейся под действием АПФ. Супернатант, содержащий гиппуровую кислоту, анализировали на колонке Bondclone C18 (Agilent system, Agilent, Germany), УФ-детектор с длиной волны 228 нм. Показатель ингибирования активности фермента рассчитывали по формуле
Ингибирование АПФ = ■ 100%,
где Cc — содержание гиппуровой кислоты в контрольном образце; Cs — содержание гиппуровой кислоты в исследуемом образце.
Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения Statistica 7. Эксперименты повторялись трижды, а эксперименты с использованием клеточных культур шестикратно. Результаты представлены в виде среднего значения со среднеквадратическим отклонением. Значения и различия между значениями с доверительной вероятностью Р > 0,95 считались статистически достоверными.
Результаты и их обсуждение
Результаты исследования общей антирадикальной активности водорастворимых компонентов и гидролизатов мягких тканей трех видов исследуемых двустворчатых моллюсков показывают (табл. 1), что в водных фракциях тканей корбикулы японской антирадикальная активность максимальная, ЕС 50 % составляет 8,7 мг. Для мерценарии и анадары величина АРА была значительно ниже, ЕС 50 % составила соответственно 43,6 и 59,6 мг сухого вещества. После ферментативного гидролиза исследуемых мягких тканей в описанных условиях наблюдалось достоверное (Р = 0,99) увеличение антирадикальной активности для всех исследуемых образцов: антирадикальная активность водорастворимой фракции корбикулы возросла в 8,0 раза, мерценарии и анадары — соответственно в 3,0 и 2,5 раза.
Таблица 1
Антирадикальная активность водорастворимых компонентов и гидролизатов тканей двустворчатых моллюсков
Table 1
Antiradical activity of water-soluble components and hydrolysates of tissues from bivalve molluscs
Образец Антирадикальная активность, EC 50 %, мг сухого вещества
Водорастворимая фракция* Гидролизат
C. japónica 8,7 ± 1,2 1,10 ± 0,08
M. mercenaria 43,6 ± 2,1 13,80 ± 1,20
A. broughtonii 59,6 ± 1,8 22,70 ± 0,90
* Исследовали всю водорастворимую фракцию измельченных мягких тканей, включая внутриполостную жидкость моллюсков.
Полученные результаты не противоречат литературным данным о том, что при гидролизе происходит высвобождение биологически активных пептидов, сопровождающееся ростом антирадикальной активности (You et al., 2009).
Дальнейшие исследования спектра биологической активности проводили с использованием лиофильно высушенных гидролизатов мягких тканей двустворчатых моллюсков. Наши исследования были сфокусированы на антигипертензивном, анти-тромбоцитарном, антидиабетическом и гепатопротекторном действии.
Величину возможного антитромбоцитарного эффекта оценивали по снижению количества растворимой формы фибрина при реакции взаимодействия фибриногена с тромбином. Тромбин является слабым протеолитическим ферментом. Он действует на фибриноген, отщепляя от молекулы фибриногена низкомолекулярные пептиды. В результате образуются одиночные молекулы фибрин-мономеров. Затем мономеры фибрина объединяются между собой с формированием нитей фибрина и образованием кровяного сгустка. Действие антитромбоцитарных препаратов направлено на снижение способности тромбина гидролизовать фибриноген. Величины антитромбоцитарной активности исследуемых гидролизатов приведены в табл. 2. В качестве сравнения использовали растительный протолитический фермент папаин (Sigma, EC 3.4.22.2), антикоагулянтные (фибринолитические) свойства которого проявляются за счет способности активировать плазминоген с дальнейшим расщеплением фибрина.
Таблица 2
Антитромбоцитарная активность гидролизатов тканей исследуемых двустворчатых моллюсков
Table 2
Antitrombolitic activity of hydrolysates of tissue from bivalve mollusks
Образец Концентрация исследуемого гидролизата, мг/мл Антитромбоцитарная активность, ед.
Папаин (контроль) 1 10 0,0117 ± 0,0031 0,0173 ± 0,0068
C. japonica 1 10 Н/о 0,0823 ± 0,0118
A. broughtonii 1 10 Н/о Н/о
M. mercenaria 1 10 Н/о 0,0471 ± 0,0280
Примечание. Здесь и далее Н/о — активность отсутствует.
Как видно из данных табл. 2, гидролизаты исследуемых тканей корбикулы и мерценарии обладают антитромбоцитарной активностью. Максимальная антитромбоцитарная активность характерна для гидролизата мягких тканей корбикулы при концентрации белкового гидролизата 10 мг/мл — 0,0823 ед., что в 4,5 раза выше антитромбоцитарной активности папаина. Антитромбоцитарная активность гидролизатов мягких тканей мерценарии в концентрации 10 мг/мл превышала активность папаина в 2 раза. Стоит отметить, что в концентрациях исследуемых гидролизатов 1 мг/мл антитромбоцитарная активность не проявлялась. При этом для папаина наблюдали проявление антитромбоцитарной активности и при низких концентрациях. Вероятно, это связано с составом водорастворимых компонентов, проявляющих фибринолитические свойства. Возможно, в случае гидролизатов тканей гидробионтов антитромбоцитарный эффект начинает проявляться после достижения определенного уровня концентрации биологически активных компонентов. В гидролизатах тканей анадары антитромбоцитарной активности обнаружено не было.
Еще одним фактором, влияющим на риск возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, является активность ангиотензинпревращающего фермента. Повышение активности АПФ приводит к увеличению артериального давления за счет расщепления ангиотензина I до ангиотензина II и деградации сосудорасширяющего пептида бра-
дикинина. Способность гидролизатов тканей двустворчатых моллюсков ингибировать АПФ показана в табл. 3.
Таблица 3
Ингибирующая активность в отношении ангиотензинпревращающего фермента гидролизатов тканей двустворчатых моллюсков
Table 3
Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity of hydrolysates of tissue
from bivalve mollusks
Образец Концентрация гидролизата, мг/мл Ангиотензин-ингибирующая активность, %
1 Н/о
C. japonica 10 Н/о
100 Н/о
1 Н/о
A. broughtonii 10 Н/о
100 Н/о
1 Н/о
M. mercenaria 10 12,4 ± 2,1
100 34,3 ± 3,6
Как видно из данных табл. 3, только гидролизаты мерценарии обладают АПФ-ингибирующей активностью в концентрации 10-100 мг/мл. При более низкой концентрации гидролизата АПФ-ингибирующая активность не наблюдалась. АПФ-ингибирующая активность, в отличие от АРА, существенно зависит от аминокислотной последовательности, длины цепи и гидрофобности пептидов, с чем, вероятно, и связано отсутствие АПФ-ингибирующей активности в гидролизатах корбикулы, обладающих, как установлено, высокой антирадикальной активностью.
В литературе встречаются сообщения об использовании пептидов в качестве ингибиторов ферментов, участвующих в расщеплении углеводов, — альфа-амилазы и альфа-глюкозидазы, что достоверно приводит к снижению уровня глюкозы в крови (Tundis et al., 2011). При исследовании потенциальной возможности гидролизатов моллюсков снижать активности гипогликемических ферментов в качестве сравнения использовали акарбозу, которая применяется в мировой клинической медицине как гипогликемическое лекарственное средство, тормозящее переваривание и всасывание углеводов в тонком кишечнике.
Как видно из полученных данных (табл. 4), гидролизаты проявляют ингибиру-ющую активность в отношении гипогликемических ферментов, которая возрастает с увеличением концентрации. Максимальная активность в отношении амилазы и гликозидазы установлена для гидролизатов мягких тканей мерценарии и составила соответственно 7,5 и 7,2 % при концентрации 1 мкг/мл. Эта величина сопоставима с активностью акарбозы при концентрации 0,1 мкг/мл. Акарбоза является синтетическим гипогликемическим средством и назначается пациентам в тех случаях, когда изменение режима питания или другие гипогликемические средства не обеспечивают эффективного контроля над их состоянием. Поэтому сопоставимость ингибирующей активности гидролизата мерценарии с величиной активности достаточно сильного лекарственного средства, хотя и в разных дозировках активного вещества, является значимой и предполагает проведение дополнительных исследований. Ингибирующая альфа-амилазная и альфа-гликозидазная активности гидролизатов корбикулы ниже активности гидролизатов мерценарии, а в случае ингибирования альфа-амилазы даже ниже ингибирующей активности гидролизата мягких тканей анадары при концентрации 1 мкг/мл.
Гепатопротекторная активность гидролизатов мягких тканей корбикулы японской, мерценарии и анадары была исследована in vitro с применением клеточной культуры человеческих гепатоцитов HepG2 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA). Гепатопротекторную активность определяли, оценивая жизнеспособность клеток в образцах, обработанных 10 %-ным этанолом, в сравнении с контрольной группой (рис. 1).
Таблица 4
Альфа-амилазная и альфа-гликозидазная ингибирующая активность гидролизатов тканей
исследуемых гидробионтов
Table 4
Inhibitory activity for alpha-amylase and alpha-glycosidase of hydrolysates of tissue
from bivalve mollusks
Исследуемый образец Гидролизат, мкг/мл Активность, % ингибирования фермента
а-амилаза а-гликозидаза
Акарбоза (контроль) 0,1 1,0 11,5 ± 2,3 44,7 ± 2,9 7,8 ± 1,9 46,5 ± 3,2
C. japónica 1,0 10,0 0,5 ± 0,4 13,0 ± 0,2 5,6 ± 0,4 15,0 ± 0,8
A. broughtonii 1,0 10,0 6,7 ± 0,1 10,3 ± 1,0 4,8 ± 0,9 10,1 ± 1,3
M. mercenaria 1,0 10,0 7,5 ± 0,9 12,6 ± 1,3 7,2 ± 1,1 18,2 ± 1,4
105 100
95 ' 90 85 80 75 70 65 60
oAnadara broughtoni ' MMercenaria mercenaria □ Corbicula japónica ' □ Контроль (интактные клетки)" В Отрицательный контроль
0,01 0,1 1 10 100 200 Концентрация гидролизата, мкг/мл
Рис. 1. Гепатопротекторная активность гидролизатов тканей двустворчатых моллюсков. Для оценки активности использовали величину выживаемости клеток человеческих гепато-цитов HepG2
Fig. 1. Hepatoprotective activity of hydrolysates of tissues from bivalve mollusks (calculated from survival of human hepatocyte HepG2 cells, %)
При внесении в культуру клеток 10 % этанола (отрицательный контроль) выживаемость клеток достоверно (Р = 0,99) снизилась на 33,6 %. Введение гидролизата корбикулы с концентрацией от 0,01 до 1,0 мкг/мл, гидролизата анадары с концентрацией от 0,01 до 100,0 мкг/мл или гидролизата мерценарии с концентрацией от 0,01 до 10,0 мкг/мл в культуру клеток не привело к росту выживаемости последних на фоне действия 10 %-ного этанола. При внесении 10 и 100 мкг гидролизата корбикулы выживаемость клеток повысилась на 1-2 % по сравнению с отрицательным контролем. Но различия были достоверными (Р = 0,95) только для эксперимента с внесением 100 мкг гидролизата. Внесение гидролизата корбикулы в количестве 200 мкг/мл привело к увеличению выживаемости клеток на 16 % по сравнению с отрицательным контролем с высокой степенью достоверности эксперимента (Р = 0,99). Внесение гидролизата анадары привело к достоверным различиям (Р = 0,95) в количестве выживших клеток при концентрации гидролизата 200 мкг/мл. В присутствии гидролизата мерценарии в
концентрации 10, 100 и 200 мкг/мл выживаемость клеток составила 68,9, 70,5 и 72,6 %, что соответствовало достаточному и высокому уровню достоверности эксперимента (Р = 0,95 и 0,99).
Сравнение гепатопротекторной активности гидролизатов тканей двустворчатых моллюсков с антирадикальной активностью не позволяет сделать однозначных выводов о взаимосвязи процессов свободнорадикального окисления и гепатопротекторного защитного механизма. Как видно на рис. 1, при внесении в систему гидролизатов корбикулы и мерценарии в количестве 100 мкг/мл степень выживаемости клеток была примерно одинакова и составила 70 %. При увеличении количества вносимого гидро-лизата корбикулы в два раза (200 мкг/мл) степень выживаемости гепатоцитов возросла на 12 %, при увеличении количества вносимого гидролизата мерценарии до 200 мкг/мл полученные значения практически не изменились. Возможно, в случае гидролизата тканей мерценарии гепатозащитный эффект обусловлен только одним фактором, например, исключительно антирадикальной активностью, тогда как при использовании белков и пептидов корбикулы проявляется совокупность гепатозащитных механизмов, связанных со структурой и строением веществ белкового происхождения, входящих в состав гидролизата.
Заключение
Изучение спектра биологической активности (рис. 2) показало, что гидролизаты исследуемых тканей двустворчатых моллюсков обладают различными типами биологической активности. Гидролизаты тканей корбикулы и мерценарии обладают анти-тромбоцитарной активностью. Максимальная антитромбоцитарная активность была определена для гидролизата мягких тканей корбикулы при концентрации гидролизата 10 мг/мл и составила 0,0823 ед., что в 4,5 раза выше антитромбоцитарной активности протеолитического фермента папаина.
Антитр омбоцитарная активность, ед АПФ-ингибирующая активность,%
C.japonica
0,1
A.broughtoni
C.japonica
40
M.mercenaria A.broughtoni
M.mercenaria
Антигликемическая активность,%
C.japonica
20
A.broughtoni
M. mercenaria
Гепатопротекторная активность,%
A.broughtoni
M.mercenaria
Рис. 2. Распределение спектра биологической активности в исследуемых гидролизатах тканей двустворчатых моллюсков: прямая линия — активность альфа-амилазы; пунктирная — активность альфа-гликозидазы
Fig. 2. Spectrum of biological activity in hydrolysates of tissues from bivalve mollusks: solid line — alpha-amylase activity; dotted line — alpha-glycosidase activity
Ангиотензин-ингибирующей активностью характеризуются только гидролизаты мерценарии. Величина АПФ-ингибирующей активности гидролизата мерценарии со-
ставила 12,4 ± 2,1 и 34,3 ± 3,6 % при концентрации гидролизата соответственно 10 и 100 мг/мл. Это согласуется с литературными данными об АПФ-ингибирующей активности пептидов, выделенных из природных источников (Hartmann, Meisel, 2007). Эти пептиды считаются безопасными в сравнении с синтетическими препаратами, чаще всего расщепляются в желудочно-кишечном тракте человека, не вызывая побочных реакций, и могут быть использованы для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний (Je et al., 2009).
Максимальная активность в отношении альфа-амилазы и альфа-гликозидазы установлена для гидролизатов мягких тканей мерценарии и составила соответственно 7,5 и 7,2 % при концентрации гидролизата 1 мкг/мл. Уровень ингибирующей гипогли-кемической активности гидролизата мерценарии сопоставим с величиной активности лекарственного препарата акарбоза, что является значимым показателем и обосновывает перспективность проведения дальнейших исследований в этой области.
Наличие гепатопротекторной активности определено для всех исследуемых гидролизатов. Для гидролизатов корбикулы и мерценарии гепатопротекторный эффект проявлялся при концентрации гидролизата 10 мкг/мл, для анадары различия в степени выживаемости клеток по сравнению с отрицательным контролем становились достоверными при внесении 200 мкг/мл гидролизата. Максимальная степень выживаемости клеток была определена в случае применения гидролизата корбикулы в концентрации 200 мкг/мл и составила 82,3 %, что на 16,0 % выше, чем в эксперименте с воздействием 10 %-ного этанола, но на 18,0 % ниже интактных клеток.
Разнообразие форм биологической активности, выявленных в моллюсках, свидетельствует о высоком потенциале этих объектов для разработки БАД и продуктов функционального питания. Полученные результаты являются основанием для исследования комплексного воздействия биологически активных компонентов разной направленности на физиологический статус организма.
Список литературы
Аюшин Н.Б., Петрова И.П., Эпштейн Л.М. Таурин и карнозин в тканях тихоокеанских моллюсков // Вопр. питания. — 1997. — № 6. — С. 6-8.
Воронина Т.А. Антиоксидант мексидол. Основные нейропсихотропные эффекты и механизм действия // Психофармакол. биол. наркол. — 2001. — Т. 1, № 1. — С. 2-12.
Караулова Е.П., Чепкасова А.И. Пептиды морских объектов как потенциальный источник природных антиоксидантов // Изв. ТИНРО. — 2017. — Т. 189. — С. 192-203.
Караулова Е.П., Чепкасова А.И., Слуцкая Т.Н. и др. Антирадикальный эффект низкомолекулярных пептидов экстрактов и гидролизатов тканей гидробионтов // Изв. ТИНРО. — 2015. — Т. 182. — С. 269-276.
Купина Н.М. Основные результаты исследования двустворчатых моллюсков прибрежной зоны Японского моря // Изв. ТИНРО. — 2015. — Т. 182. — С. 249-257.
Оводова Р.Г., Молчанова В.И., Михейская Л.В., Оводов Ю.С. Общая характеристика биогликанов-иммуномодуляторов из беспозвоночных Японского моря // Химия природ. соединений. — 1990. — № 6. — С. 738-742.
Apostolidis E., Kwon Y.I., Shetty K. Potential of cranberry-based herbal synergies for diabetes and hypertension management // Asia Pac. J. Clin. Nutr. — 2006. — Vol. 15, № 3. — P. 433-441.
Bolignano D., Cernaro V., Gembillo G., Baggetta R., Buemi M., D'Arrigo G. Antioxidant agents for delaying diabetic kidney disease progression: A systematic review and meta-analysis // PLoS One. — 2017. — Vol. 12, № 6: e0178699. DOI: 10.1371/journal.pone.0178699.
Chalamaiah M., Dinesh Kumar B., Hemalatha R., Jyothirmayi T. Fish protein hydrolysates: Proximate composition, amino acid composition, antioxidant activities and applications: a review // Food Chem. — 2012. — Vol. 135, Iss. 4. — P. 3020-3038. DOI: 10.1016/j.foodchem.2012.06.100.
Chang G.T., Min S.Y., Kim J.H., Kim S.H., Kim J.K., Kim C.H. Anti-thrombic activity of Korean herbal medicine, Dae-Jo-Whan and its herbs // Vascul. Pharmacol. — 2005. — Vol. 43, Iss. 4. — P. 283-288. DOI: 10.1016/j.vph.2005.08.014.
Chijimatsu T., Tatsuguchi I., Oda H., Mochizuki S. A Freshwater clam (Corbicula fluminea) extract reduces cholesterol level and hepatic lipids in normal rats and xenobiotics-induced hypercholester-olemic rats // J. Agric. Food Chem. — 2009. — Vol. 57, Iss. 8. — P. 3108-3112. DOI: 10.1021/jf803308h.
Degirolamo C., Modica S., Vacca M. et al. Prevention of spontaneous hepatocarcinogenesis in farnesoid X receptor-null mice by intestinal-specific farnesoid X receptor reactivation // Hepatol-ogy. — 2015. — Vol. 61, Iss. 1. — P. 161-170. DOI: 10.1002/hep.27274.
Dunehoo A.L., Anderson M., Majumdar S. et al. Cell adhesion molecules for targeted drug delivery // J. Pharm. Sci. — 2006. — Vol. 95, Iss. 9. — P. 1856-1872. DOI: 10.1002/jps.20676.
Evran B., Karpuzoglu H., Develi S. et al. Effects of carnosine on prooxidant-antioxidant status in heart tissue, plasma and erythrocytes of rats with isoproterenol-induced myocardial infarction // Pharmacol. Rep. — 2014. — Vol. 66, Iss. 1. — P. 81-86. DOI: 10.1016/j.pharep.2013.08.008.
FitzGerald R.J., Meisel Н. Milk protein-derived peptide inhibitors of angiotensin-I-converting enzyme // Br. J. Nutr. — 2000. — Vol. 84, Suppl. 1. — P. 33-37.
Hansawasdi C., Kawabata J., Kasai T. Alpha-amylase inhibitors from roselle (Hibiscus sab-dariffa Linn.) tea // Biosci. Biotechnol. Biochem. — 2000. — Vol. 64, Iss. 5. — P. 1041-1043. DOI: 10.1271/bbb.64.1041.
Hartmann R., Meisel H. Food-derived peptides with biological activity: from research to food applications // Curr. Opin. Biotechnol. — 2007. — Vol. 18, Iss. 2. — P. 163-169. DOI: 10.1016/j. copbio.2007.01.013.
Hsu C.L., Hsu C.C., Yen G.C. Hepatoprotection by freshwater clam extract against CCl4-induced hepatic damage in rats // Am. J. Chin. Med. — 2010. — Vol. 38, № 5. — P. 881-894. DOI: 10.1142/S0192415X10008329.
Je J.Y., Lee K.H., Lee M.H., Ahn C.B. Antioxidant and antihypertensive protein hydrolysates produced from tuna liver by enzymatic hydrolysis // Food Res. Int. — 2009. — Vol. 42, Iss. 9. — P. 1266-1272.
Wanasundara P.K., Ross A.R.S., Amarowicz R. et al. Peptides with angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity from defibrinated, hydrolyzed bovine plasma // J. Agric. Food Chem. — 2002. — Vol. 50, № 24. — P. 6981-6988.
Leng B., Liu X.D., Chen Q.X. Inhibitory effects of anticancer peptide from Mercenaria on the BGC-823 cells and several enzymes // FEBS Lett. — 2005. — Vol. 579, № 5. — P. 1187-1190. DOI: 10.1016/j.febslet.2004.12.089.
Molyneux P. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity // Songklanakarin J. Sci. Technol. — 2004. — Vol. 26, Iss. 2. — P. 211-219.
Souza S.R.G., Miranda Neto M.H., Martins Perles J.V.C. et al. Antioxidant Effects of the Quercetin in the Jejunal Myenteric Innervation of Diabetic Rats : Front. Med. (Lausanne). — 2017. — Vol. 4. — 8 p. DOI: 10.3389/fmed.2017.00008.
Sui X., Gao С. Huperzine A ameliorates damage induced by acute myocardial infarction in rats through antioxidant, anti-apoptotic and anti-inflammatory mechanisms // Int. J. Mol. Med. — 2014. — Vol. 33, Iss. 1. — P. 227-233. DOI: 10.3892/ijmm.2013.1546.
Tundis R., Loizzo M.R., Menichini F. et al. Comparative study on the chemical composition, antioxidant properties and hypoglycaemic activities of two Capsicum annuum L. cultivars (Acumi-natum small and Cerasiferum) // Plant Foods Hum. Nutr. — 2011. — Vol. 66, № 3. — P. 261-269. DOI: 10.1007/s11130-011-0248-y.
Turcic P., Stambuk N., Konjevoda P. et al. Modulation of y2-MSH hepatoprotection by antisense peptides and melanocortin subtype 3 and 4 receptor antagonists // Med. Chem. — 2015. — Vol. 11, Iss. 3. — P. 286-295. DOI: 10.2174/1573406410666140914161421.
Xia E.Q., Zhu S.S., He M.J. et al. Marine Peptides as Potential Agents for the Management of Type 2 Diabetes Mellitus-A Prospect // Mar. Drugs. — 2017. — Vol. 15, № 4. DOI: 10,3390/ md15040088.
You L., Zhao M., Cui C. et al. Effect of degree of hydrolysis on the antioxidant activity of loach (Misgurnus anguillicaudatus) protein hydrolysates // Innovative Food Science and Emerging Technologies. — 2009. — Vol. 10(2). — P. 235-240.
References
Ayushin, N.B., Petrova, I.P., and Epshtein, L.M., Taurine and carnosine in tissues of Pacific mollusks, Vopr. Pitaniya, 1997, no. 6, pp. 6-8.
Voronina, T.A., Antioxidant Mexidol. The basic neuropsychotropic effects and mechanism of action, Psychopharmakol. Biol. Narkol., 2001, vol. 1, no. 1, pp. 2-12.
Karaulova, E.P. and Chepkasova, A.I., Peptides of marine animals as a potential source of natural antioxidants, Izv. Tikhookean. Nauchno-Issled. Inst. Rybn. Khoz. Okeanogr., 2017, vol. 189, pp. 192-203.
Karaulova, E.P., Chepkasova, A.I., Slutskaya, T.N., Shulgina, L.V., and Yakush, E.V., Antiradical effect of low-molecular peptides in extracts and hydrolyzates from tissues of water organisms, Izv. Tikhookean. Nauchno-Issled. Inst. Rybn. Khoz. Okeanogr., 2015, vol. 182, pp. 269-276.
Kupina, N.M., The main results of the study of bivalve mollusks in the coastal zone of the Japan Sea, Izv. Tikhookean. Nauchno-Issled. Inst. Rybn. Khoz. Okeanogr., 2015, vol. 182, pp. 249-257.
Ovodova, R.G., Molchanova, V.I., Mikeiskaya, L.V., and Ovodov, Yu.S., General characteristics of immunomodulator bioglycans from invertebrates of the Sea of Japan, Chem. Nat. Compd., 1990, no. 6, pp. 738-742.
Apostolidis, E., Kwon, Y.I., and Shetty, K., Potential of cranberry-based herbal synergies for diabetes and hypertension management, Asia Pac. J. Clin. Nutr., 2006, vol. 15, no. 3, pp. 433-441.
Bolignano, D., Cernaro, V., Gembillo, G., Baggetta, R., Buemi, M., and D'Arrigo, G., Antioxidant agents for delaying diabetic kidney disease progression: A systematic review and metaanalysis, PLoS One, 2017, vol. 12, no. 6, art. ID e0178699. doi 10.1371/journal.pone.0178699
Chalamaiah, M., Dinesh Kumar, B., Hemalatha, R., and Jyothirmayi, T., Fish protein hy-drolysates: Proximate composition, amino acid composition, antioxidant activities and applications: a review, Food Chem., 2012, vol. 135, no. 4, pp. 3020-3038. doi 10.1016/j.foodchem.2012.06.100
Chang, G.T., Min, S.Y., Kim, J.H., Kim, S.H., Kim, J.K., and Kim, C.H., Anti-thrombic activity of Korean herbal medicine, Dae-Jo-Whan and its herbs, Vasc. Pharmacol., 2005, vol. 43, no. 4, pp. 283-288. doi 10.1016/j.vph.2005.08.014
Chijimatsu, T., Tatsuguchi, I., Oda, H., and Mochizuki, S., A freshwater clam (Corbicula fluminea) extract reduces cholesterol level and hepatic lipids in normal rats and xenobiotics-induced hypercholesterolemic rats, J. Agric. Food Chem., 2009, vol. 57, no. 8, pp. 3108-3112. doi 10.1021/ jf803308h
Degirolamo, C., Modica, S., Vacca, M., Di Tullio, G., Morgano, A., D'Orazio, A., Kannisto, K., Parini, P., and Moschetta, A., Prevention of spontaneous hepatocarcinogenesis in farnesoid X receptor-null mice by intestinal-specific farnesoid X receptor reactivation, Hepatology, 2015, vol. 61, no. 1, pp. 161-170. doi 10.1002/hep.27274
Dunehoo, A.L., Anderson, M., Majumdar, S., Kobayashi, N., Berkland, C., and Siahaan, T.J., Cell adhesion molecules for targeted drug delivery, J. Pharm. Sci., 2006, vol. 95, no. 9, pp. 1856-1872. doi 10.1002/jps.20676
Evran, B., Karpuzoglu, H., Develi, S., Kalaz, E.B., Soluk-Tekkeçin, M., Olgaç, V., Dogru-Abbasoglu, S., and Uysal, M., Effects of carnosine on prooxidant-antioxidant status in heart tissue, plasma and erythrocytes of rats with isoproterenol-induced myocardial infarction, Pharmacol. Rep., 2014, vol. 66, no. 1, pp. 81-86. doi 10.1016/j.pharep.2013.08.008
FitzGerald, R.J. and Meisel, H., Milk protein-derived peptide inhibitors of angiotensin-I-converting enzyme, Br. J. Nutr., 2000, vol. 84, suppl. 1, pp. 33-37.
Hansawasdi, C., Kawabata, J., and Kasai, T., Alpha-amylase inhibitors from roselle (Hibiscus sabdariffa Linn.) tea, Biosci., Biotechnol., Biochem., 2000, vol. 64, no. 5, pp. 1041-1043. doi 10.1271/bbb.64.1041
Hartmann, R. and Meisel, H., Food-derived peptides with biological activity: from research to food applications, Curr. Opin. Biotechnol., 2007, vol. 18, no. 2, pp. 163-169. doi 10.1016/j.cop-bio.2007.01.013
Hsu, C.L., Hsu, C.C., and Yen, G.C., Hepatoprotection by freshwater clam extract against CCl4-induced hepatic damage in rats,Am. J. Chin. Med., 2010, vol. 38, no. 5, pp. 881-894. doi 10.1142/ S0192415X10008329
Je, J.Y., Lee, K.H., Lee, M.H., and Ahn, C.B., Antioxidant and antihypertensive protein hydrolysates produced from tuna liver by enzymatic hydrolysis, Food Res. Int., 2009, vol. 42, no. 9, pp. 1266-1272.
Wanasundara, P.K., Ross, A.R.S., Amarowicz, R., Ambrose, S.J., Pegg, R.B., and Shand,
P.J., Peptides with angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity from defibrinated, hydrolyzed bovine plasma, J. Agric. Food Chem., 2002, vol. 50, no. 24, pp. 6981-6988.
Leng, B., Liu, X.D., and Chen, Q.X., Inhibitory effects of anticancer peptide from Mercenaria on the BGC-823 cells and several enzymes, FEBSLett., 2005, vol. 579, no. 5, pp. 1187-1190. doi 10.1016/j.febslet.2004.12.089
Molyneux, P., The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 2004, vol. 26, no. 2, pp. 211-219.
Souza, S.R.G., Miranda Neto, M.H., Martins Perles, J.V.C., Vieira Frez, F.C., Zignani, I., Ramalho, F.V., Hermes-Uliana, C., Bossolani, G.D., and Zanoni, J.N., Antioxidant effects of the quercetin in the jejunal myenteric innervation of diabetic rats, Front. Med. (Lausanne), 2017, vol. 4. doi 10.3389/fmed.2017.00008
Sui, X. and Gao, C., Huperzine A ameliorates damage induced by acute myocardial infarction in rats through antioxidant, anti-apoptotic and anti-inflammatory mechanisms, Int. J. Mol. Med., 2014, vol. 33, no. 1, pp. 227-233. doi 10.3892/ijmm.2013.1546
Tundis, R., Loizzo, M.R., Menichini, F., Bonesi, M., Conforti, F., Statti, G., De Luca, D., de Cindio B., and Menichini, F., Comparative study on the chemical composition, antioxidant properties and hypoglycaemic activities of two Capsicum annuum L. cultivars (Acuminatum small and Ceras-iferum), Plant Foods Hum. Nutr, 2011, vol. 66, no. 3, pp. 261-269. doi 10.1007/s11130-011-0248-y Turcic, P., Stambuk, N., Konjevoda, P., Kelava, T., Gabricevic, M., Stojkovic, R., Aralica, G., Modulation of y2-MSH hepatoprotection by antisense peptides and melanocortin subtype 3 and 4 receptor antagonists, Med. Chem., 2015, vol. 11, no. 3, pp. 286-295. doi 10.2174/157340641066 6140914161421
Xia, E.Q., Zhu, S.S., He, M.J., Luo, F., Fu, C.Z., and Zou, T.B., Marine peptides as potential agents for the management of type 2 diabetes mellitus-A prospect, Mar. Drugs, 2017, vol. 15, no. 4. doi 10.3390/md15040088
You, L., Zhao, M., Cui, C., Zhao, H., and Yang, B., Effect of degree of hydrolysis on the antioxidant activity of loach (Misgurnus anguillicaudatus) protein hydrolysates, Innovative Food Sci. Emerging Technol., 2009, vol. 10, no. 2, pp. 235-240.
Поступила в редакцию 27.07.2018 г.
После доработки 6.08.2018 г.
Принята к публикации 11.10.2018 г.
