CC BY
11| х-- .. V > It
ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ^
ТОКСИКОЛОГИЯ
УДК 574.583:595.3
ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ИЗОФОРМ НАНОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ТИТАНА НА ПЛАНКТОННЫХ РАКООБРАЗНЫХ CERIODAPHNIA AFFINIS LILLJEBORG
В.А. Гремячих, И.И. Томилина
ИБВВ РАН, Федеральное государственное бюджетное учреждение Институт биологии внутренних вод им. И.Д.Папанина РАН, 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузский р-н, Российская Федерация
Изучено влияние различных концентраций водных суспензий наночастиц ТЮ2 (в изоформах ана-таза и рутила) на выживаемость и плодовитость ветвистоусого рачка СегюёарИша affinis. В 400 и 100 мг/л анатаза за 7 суток отмечено статистически значимое снижение выживаемости рачков. Средняя продолжительность жизни животных достоверно отличалась от контрольных значений в суспензиях рутила 2 и 0,2 мг/л, анатаза - во всех исследованных концентрациях. Значение показателя снижалось с увеличением концентрации вещества (г = -0,21; р < 0,02). Изоформы диоксида титана оказывали негативное влияние на репродуктивную функцию цериодафний. Зарегистрировано достоверное снижение суммарной плодовитости рачков за жизненный цикл для анатаза в концентрациях 0,2 и 0.02 мг/л и рутила - 0,2 мг/л. Анатаз в равных с рутилом концентрациях оказывал на цериодафний более выраженное токсическое действие, что, связано с меньшими размерами его частиц.
Ключевые слова: диоксид титана, наночастицы, токсичность, цериодафнии.
Введение. Среди известных на сегодняшний день наноматериалов наиболее широко производятся и используются наночастицы (НЧ) диоксида титана. Только в США четыре крупные компании вырабатывают в год более 100 000 тонн НЧ ТЮ2, к 2025 году их производство прогнозируется довести до 2,5 млн. тонн [1]. НЧ ТЮ2 применяются в различных отраслях промышленности и в медицине. 57 % используется в строительстве в составе лакокрасочной продукции, цемента, облицовочных плиток, 26 % — в производстве пластмасс, 13 % — бумаги, 4 % — в электронике, косметике (солнцезащитный крем, зубная паста и др.), пищевой промышленности
(пищевые добавки), а также в производстве керамики, типографской краски, зеркал и т.д. [2].
Диоксид титана существует в виде нескольких модификаций. В природе чаще встречаются кристаллы диоксида титана с тетрагональной сингонией (анатаз, рутил), реже - с ромбической сингонией (брукит). НЧ ТЮ2 производятся в изо-формах нанорутила и наноанатаза в виде кристаллов, наносфер или лент [3].
Очевидная неполнота и противоречивость информации об особенностях поведения наномате-риалов в сочетании с реальными перспективами резкого увеличения их содержания в среде обитания человека и других биологических объек-
Гремячих Вера Алексеевна (Gremyachikh Vera Alekseevna), кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологии и токсикологии водных животных, Федеральное бюджетное учреждение Институт биологии внутренних вод им. И.Д.Папанина РАН, 152742, пос. Борок, Ярославская обл., Некоузский р-н, Российская Федерация, [email protected]
Томилина Ирина Ивановна (Tomilina Irina Ivanovna), кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории физиологии и токсикологии водных животных, Федеральное бюджетное учреждение Институт биологии внутренних вод им. И.Д.Папанина РАН, 152742, пос. Борок, Ярославская обл., Некоузский р-н, Российская Федерация, tomil@ ibiw. yaroslavl.ru
Токсикологический вестник n.5 (134)
тов выдвигает на первый план проблемы биобезопасности нанотехнологий и наноматериалов [4]. Роль живых организмов в их распространении в окружающей среде практически не исследована [5]. Гидробионты (особенно беспозвоночные) могут влиять на перемещение наноматериалов в пределах и за пределами водоемов. Одним из условий получения адекватной оценки безопасности техногенных наночастиц является использование традиционных тест-организмов, включенных в стандартные программы биотестирования многих стран, в том числе и России.
Цель работы - оценить изменения биологических параметров (выживаемости, плодовитости и интенсивности размножения) Ceriodaphnia affinis L. при действии разных изоформ наноча-стиц диоксида титана.
Материалы и методы исследования. Суспензии TiO2 готовили методом диспрергирования навески порошка в отстоянной артезианской воде на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-2Т в режиме 0,5 А, 44 кГц. Концентрации исследуемых частиц от 400 до 0,002 мг/л получали путем последовательного разведения маточной суспензии (400 мг/л) непосредственно перед опытом на отстоянной артезианской воде. Наночастицы диоксида титана были представлены в виде двух изоформ: анатаза, размером до 50 нм и форме, близкой к сферической; и рутила, имеющего форму палочек или стержней диаметром около 10 и длиной до 100 нм.
В качестве тест-объекта использовали вет-вистоусого рачка Ceriodaphnia affinis Lillijeborg, 1862 (Cladocera, Crustacea). Токсичность соединений титана исследовали по стандартной методике [6]. В первые сутки от рождения рачков помещали по одному в стаканчики с 15 мл тестируемого раствора или суспензии и наблюдали либо в течение 7 суток (0,002 - 400 мг/л), либо на протяжении всего жизненного цикла (0,002 - 2 мг/л). Ежедневно регистрировали количество живых организмов, число пометов и молоди у каждой самки. Исследовали выживаемость, продолжительность жизненного цикла и индивидуальную плодовитость животных.
Результаты обрабатывали статистически, используя метод однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и процедуру LSD-теста при уровне значимости р=0,05 [7]. Статистический анализ результатов проводили с помощью пакета программ STATGRAPHICS Plus 2.1.
Результаты и обсуждение. Во всём исследованном диапазоне концентраций суспензий наноча-стиц диоксида титана, за исключением анатаза в концентрации 400 мг/л, за 48 часов экспозиции зарегистрирована 90-100 % выживаемость цери-одафний (табл. 1). Достоверное снижение выживаемости рачков за 7 суток экспозиции отмече-
но в суспензии анатаза в концентрациях 400 и 100 мг/л. Плодовитость рачков за указанный период, как по среднему количеству помётов на 1 самку, так и по количеству молоди на 1 самку во всех концентрациях была ниже контрольных значений. Анатаз в диапазоне концентраций 400 - 100 мг/л подавлял плодовитость цериодафний на 8090%. Снижение плодовитости рачков за указанный период экспозиции достоверно зависело от концентрации вещества (для рутила г = -0,48; р = 0,00; для анатаза г = -0,51; р = 0,00).
Влияние низких концентраций наночастиц диоксида титана (2-0,002 мг/л) на цериодафний исследовали в опытах, охватывающих весь их жизненный цикл. Выживаемость рачков в первую и вторую недели эксперимента во всех опытных вариантах не отличалась от контрольных значений (табл. 2) К концу 3-й и 4-й недели отмечена тенденция к снижению выживаемости цериодаф-ний, для анатаза в концентрации 0,2 мг/л - достоверная. Средняя продолжительность жизни животных достоверно отличалась от контрольных значений в суспензиях всех исследованных веществ и концентраций, за исключением рутила в концентрации 0,002 мг/л. Значение показателя в суспензии рутила не зависело от концентрации НЧ (г = -0,1; р = 0,34), а в растворах анатаза - статистически значимо уменьшалось с её увеличением (г = -0,21; р = 0,02) (табл. 2).
Во всех группах исследованных веществ отмечена тенденция к снижению средней суммарной плодовитости животных и интенсивности их размножения, достоверная - для анатаза в концентрациях 0,2, 0,002 и рутила - 0,2 мг/л (рис.). При экспонировании цериодафний в суспензиях ана-таза установлены статистически значимые отрицательные концентрационные зависимости для показателей суммарной плодовитости (г = -0,29 при р=0,004) и интенсивности размножения животных (г = - 0,23 при р=0,02). НЧ вещества в наименьшей из исследованных концентраций (0.002 мг/л) максимально (на 50%) подавляли плодовитость рачков, особенно во второй половине эксперимента (рис.). В суспензии анатаза с концентрацией 0,2 мг/л эта тенденция сохранялась. В суспензиях рутила кривые, характеризующие увеличение количества отрождённой молоди по неделям, фактически от контрольной не отличались.
Токсическое действие наночастиц связано с их способностью проникать в неизменном виде через клеточные барьеры, длительное время циркулировать и накапливаться в органах и тканях, вызывать в них патоморфологические нарушения и медленно выводиться из организма [8]. В водные организмы помимо желудочно-кишечного тракта НЧ могут поступать через наружные покровы и жабры, попадать в их икру и личинки,
Таблица 1
Влияние изоформ диоксида титана на выживаемость и репродуктивные показатели цериодафний
за 7 суток эксперимента
Вещество Концентрация, мг/л Выживаемость, % Среднее количество молоди за 7 суток, экз, % от контроля
48 ч 7 сут
анатаз 400 75+15 60+10* 8,7 + 2,6*
200 90+10 90+10 17,4 + 3,1*
100 90+10 60+10* 11,6 + 2,9*
50 100+0 90+10 22,7 + 2,5*
20 100+0 100+0 34,6 + 4,6*
2 100+0 95+5 23,0 + 3,8*
0,2 100+0 85+5 27,4 + 3,6*
0,02 100+0 85+5 39,8 + 7,1*
0,002 100+0 90+10 61,0 + 8,3
рутил 400 90+10 80+10 29,7 + 4,7*
200 90+10 90+10 41,3 + 5,9*
100 100+0 85+5 47,4 + 6,1*
50 100+0 90+10 45,6 + 3,4*
20 100+0 100+0 57,0 + 4,3*
2 100+0 95+5 46,2 + 6,2*
0,2 100+0 95+5 37,6 + 3,1*
0,02 100+0 100+0 72,6 + 7,0
0,002 100+0 100+0 64,6 + 7,9
контроль 100+0 95+5 100 + 7,0
Примечание: В табл. 1 и 2 даны средние значения и их ошибки (х±SE) * Достоверные различия при уровне значимости р=0,05
Таблица 2
Влияние изоформ диоксида титана на выживаемость и продолжительность жизненного цикла
рачков при хроническом воздействии
Вещество Концентрация, мг/л Выживаемость к концу недели, % Средняя продолжительность жизненного цикла, сут
1-ая неделя 2-ая 3-я 4-я
анатаз 2 95+5 80 + 5 75+10 55+10 27,7 + 2,7*
0,2 95+5 70 + 10 50+10* 50+10* 25,4 + 3,0*
0,02 85+5 85+5 80+10 75+ 10 30,7 + 3,3*
0,002 90+10 85 + 5 60+15 55+10 27,8 + 2,4*
рутил 2 95+5 85 + 10 70 + 15 50+15 24,2 + 2,3*
0,2 95+5 85 + 10 65+10 45+10 25,7 + 2,3*
0,02 100+0 70 + 0 65+5 60+10 30,7 + 3,3*
0,002 100+0 100+0 95+5 90+10 31,3 + 2,5
контроль 95+5 95+5 95+5 85+10 35,3 + 2,5
Примечание: * Достоверные различия при уровне значимости р=0,05
Токсикологический вестник №5 (134)
а также становиться более доступными для многочисленных представителей более низких трофических сетей - простейших одноклеточных организмов [9].
Несмотря на то, что многие исследованные на-номатериалы не обладают острой токсичностью, их хроническое действие до настоящего времени изучено недостаточно. В нашем исследовании отмечены достоверные отличия средней продолжительности жизни цериодафний от контрольных значений в суспензиях рутила с концентрацией 2 и 0,2 и анатаза - во всех исследованных концентрациях, В растворах анатаза значение показателя статистически значимо снижалось с увеличением концентрации вещества. Наночастицы в большей степени влияют на воспроизводство водных беспозвоночных, угнетая или стимулируя их плодовитость, замедляют рост, вызывают неспецифические поведенческие и морфофункци-ональные нарушения, снижая тем самым жизнеспособность организмов [10,11]. Репродуктивные показатели цериодафний оказались чувствитель-
нее показателя выживаемости: суммарная плодовитость рачков за жизненный цикл снижалась при экспонировании в концентрациях анатаза 0.2 и 0,02 мг/л, рутила - 0,2 мг/л. Причем, анатаз в самой меньшей концентрации подавлял плодовитость в большей степени. Для этой же концентрации интенсивность размножения достоверно была ниже контрольных значений. Таким образом, анатаз в равных концентрациях с рутилом оказывал более выраженное токсическое действие на выживаемость и плодовитость рачков, что связано с меньшими размерами его частиц.
Заключение. Острая токсичность суспензий наночастиц диоксида титана различной полиморфной модификации для цериодафний в исследованном диапазоне концентраций не зарегистрирована. Достоверное снижение выживаемости рачков за 7 суток отмечено в концентрациях 400 и 100 мг/л анатаза. Средняя продолжительность их жизни достоверно отличалась от контрольных значений в суспензиях рутила с концентрацией 2 и 0,2, анатаза
200 г
150
100 ■
1 мг л -■_ 0.2 мг/л ■*-■- 0.02 мг/л - * ■ - 0.002 мг/л чр— контроль
250 200 НО 100 50 0
А
Б
Рис. Накопленная плодовитость Ceriodaphnia affinis при экспонировании в суспензии наночасти диоксида титана ( а - анатаз, б - рутил),
по оси абсцисс - недели эксперимента, по оси ординат - количество молоди, экз
- во всех исследованных концентрациях. Значение показателя статистически значимо снижалось с увеличением концентрации вещества (г = -0,21;p < 0,02). Изоформы диоксида титана оказывали негативное влияние на репродуктивную функцию цериодафний. Зарегистрировано достоверное снижение суммарной плодовитости рачков за жизненный цикл для анатаза в концентрациях 0,2 и 0,02 мг/л и рутила - 0,2 мг/л. В
суспензиях анатаза установлена статистически значимая отрицательная концентрационная зависимость для показателей суммарной плодовитости (г = -0,29 при р=0,004) и интенсивности размножения рачков (г = -0,23 при р=0,02). Анатаз в равных с рутилом концентрациях оказывал на цериодафний более выраженное токсическое действие, что, вероятно, связано с меньшими размерами его частиц.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Robichaud K.O., Uyar A.E., Darby M.R. Estimates of upper bounds and trends
in nano-TiO2 production as a basis for exposure assessment / // Environ. Sci. Technol. 2009; 43 (12): 4227-4233.
2. Гмошинский И.В., Смирнова В.В., Хотимченко С.А. Современное состояние проблемы оценки безопасности нано-материалов // Российские нанотехно-логии. 2010; 5 (9-10): 5-20.
3. Hamilton R.F., Wu N, Porter D. Particle length-dependent titanium dioxide nanomaterials toxicity and bioactivity // Particle and Fibre Toxicology. 2009; 6 (35): 1-11.
REFERENCES:
1. Robichaud K.O., Uyar A.E., Darby M.R. Estimates of upper bounds and trends
in nano-TiO2 production as a basis for exposure assessment / // Environ. Sci. Technol. 2009; 43 (12): 4227-4233.
2. GmoshinskijI.V., Smirnova V.V., Khotimchenko S.A. State of the problem of safety evaluation of nanomaterials // Rossijskie nanotekhnologii. 2010; 5 (910): 5-20 (in Russian).
3. Hamilton R.F., Wu N., Porter D. Particle length-dependent titanium dioxide nanomaterials toxicity and bioactivity // Particle and Fibre Toxicology. 2009; 6 (35): 1-11.
4. Моргалёв Ю.Н., Хоч Н.С., Моргалёва Т.Г., ГуликЕ.С.,. Борило Г.А и др. Биотестирование наноматериалов: о возможности транслокации наночастиц в пищевые сети // Российские нанотех-нологии. 2010; 5 (11-12): 98-102.
5. Крысанов Е.Ю., ПавловД.С., Демидова Т.Б., Дгебуадзе Ю.Ю. Наноча-стицы в живой природе: что нам об этом известно? // Российские нанотехноло-гии. 2009; 4 (7- 8): 26-27.
6. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости
4. Morgalyov Yu.N., Khoch N.S., Morgalyova T.G., GulikE.S.,. Borilo G.A et al. Biotesting of nanomaterials: opportunities translocation of nanoparticles in food network // Rossijskie nanotekhnologii. 2010; 5 (11-12): 98102 (in Russian).
5. Krysanov E.Yu., Pavlov D.S., Demidova T.B., Dgebuadze Yu.Yu. Nanoparticles
in nature: what we know about this? // Rossijskie nanotekhnologii. 2009; 4 (78): 26-27 (in Russian).
6. Test method for measuring the toxicity of water and aqueous extracts of soil, sewage sludge, waste on mortality and
цериодафний. Федеральный реестр (ФР). ФР.1.39.2007.032М., «АКВАРОС». 2007; 56 с.
7. Sokal R. R, Rohlf F. J. Biometry. The principals and practice of statistics in biological research. NY.W.H. Freeman and Co. 1995; 887 p.
8. Baun A., Hartmann N.B., Grieger K., KuskK.O. Ecotoxicity of engineered nanoparticles to aquatic invertebrates: a brief review and recommendations for future toxicity testing // Ecotoxicology. 2008; 17: 387-395.
9. Крысанов Е.Ю., Павлов Д.С., Демидова Т.Б., Дгебуадзе Ю.Ю. Наноча-
fertility change ceriodaphnia. Federal'nyj reestr (FR). FR.1.39.2007.032M., «AKVAROS». 2007; 56 s (in Russian).
7. Sokal R. R., Rohlf F. J. Biometry. The principals and practice of statistics in biological research. NY.W.H. Freeman and Co. 1995; 887 p.
8. Baun A., Hartmann N.B., Grieger K., Kusk K.O. Ecotoxicity of engineered nanoparticles to aquatic invertebrates: a brief review and recommendations for future toxicity testing // Ecotoxicology. 2008; 17: 387-395.
9. Krysanov E.Yu., Pavlov D.S., Demidova T.B., Dgebuadze Yu.Yu. Nanoparticles
стицы в окружающей среде и их влияние на гидробионтов // Известия РАН. Серия Биологическая. 2010; 4: 1-8.
10. Hall S, Bradley T., Moore J. Acute and chronic toxicity of nano-scale TiO2 particles to freshwater fish, cladocerans, and green algae, and effects of organic and inorganic substrate on TiO2 toxicity / // // Nanotoxicology. 2009; 3 (2): 91-97.
11. Zhu X., Zhu L., Chen Y., Tian S. Acute toxicities of six manufactured nanomaterial suspensions to Daphnia magna // Journal of Nanoparticle Research.. 2008; 11:
67 - 75.
in the environment and their impact on hydrobionts // Izvestiya RAN. Seriya Biologicheskaya. 2010; 4: 1-8 (in Russian).
10. HallS., Bradley T., Moore J. Acute and chronic toxicity of nano-scale TiO2 particles to freshwater fish, cladocerans, and green algae, and effects of organic and inorganic substrate on TiO2 toxicity / // // Nanotoxicology. 2009; 3 (2): 91-97.
11. Zhu X., Zhu L., Chen Y., Tian S. Acute toxicities of six manufactured nanomaterial suspensions to Daphnia magna // Journal of Nanoparticle Research.. 2008; 11:
67 - 75.
V.A. Gremyachikh, I.I. Tomilina
THE STUDY OF BIOLOGICAL EFFECTS OF TITANIUM DIOXIDE NANOPARTICLES ISOFORMS ON PLANKTONIC CRUSTACEANS CERIODAPHNIA AFFINIS LILLJEBORG
I.D. Papanin Institute for Biology of Inland Waters, Russian Academy of Sciences, 152742 Borok, Yaroslavl region, Russian Federation
The influence of different concentrations of TiO2 nano-particles water suspensions (anatase and rutile isoforms) on survival and fertility of cladocerans Ceriodaphnia affinis was investigated. A statistically significant decrease of crustaceans survival in 400 mg/l and 100 mg/l anatase water suspensions over 7 days was observed. Median life span of animals authentically differed from control values in rutile 2.00 mg/l and 0.2 mg/l suspensions and anatase in all studied concentrations. The indicator value decreased with an increasing substance concentration (r=-0.21; p < 0.02). TiO2 isoforms produced negative effect on the Ceriodaphnia reproduction function. An authentic reduction of cr2ustaceans total fertility over life span was recorded for anatase in concentrations of 0.2 mg/l and 0.02 mg/l and rutile in concentration of 0.2 mg/l. Anatase having equal concentrations with rutile posed a more expressed toxic effect on Ceriodaphnia which is linked to its lesser particles size.
Keywords: titanium dioxide, nanoparticles, toxicity, ceriodaphnia.
Материал поступил в редакцию 04.09.2013 г.
