CC BY
49
И ¡псе
The jounnl o(;cicntilic urtidcs
ЕЫЩ
♦ & шШеошош
Educatioij
УДК 616.152.21-08-092.9
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАИТНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИГИПОКСАНТОВ РАЗЛИЧНОГО МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ И L-НОРВАЛИНА В УСЛОВИЯХ ГЕМИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ
М.М. Ангалев, Е.В. Авдеева, H.A. Быстрова
Курский государственный медицинский университет, г. Курск Кафедра нормальной физиологии Кафедра биологической химии
Аннотация. Проведено изучение влияния L-норвалина и его комбинации с цитофлавином, кудесаном и гипок-сеном. на интенсивность ПОЛ, содержание стабильных метаболитов азота в сыворотке крови крыс, а также анти-оксидантное действие в условиях гемической гипоксии. Установлено, что введение L-норвалина и антигипоксантов с различным механизмом действия, увеличивает общую антиоксидантную активность и уменьшает содержание вторичных продуктов ПОЛ. Введение L — норвалина, достоверно увеличивает концентрацию стабильных метаболитов NO.
Ключевые слова: L-норвалин, цитофлавин, кудесан, гипоксен, антиоксидантное действие, стабильные метаболиты азота, гемическая гипоксия.
Гипоксия — типовой патологический процесс, характеризующийся уменьшением р02 в тканях и абсолютной или относительной недостаточности биологического окисления в клетке. По этиологии выделяют несколько типов гипоксии, условно объединяемых в две группы: экзогенные и эндогенные. Гемическая гипоксия относится к эндогенной гипоксии и характеризуется увеличением количества свободных радикалов, активацией ПОЛ, комплексным подавлением систем антиоксидант-ной защиты, что нарушает прооксидантно-антиок-сидантное равновесие и морфофункциональный статус эритроцитов. Установлено, что метгемо-глобинемия в два раза сильнее, по сравнению с простым падением уровня функционально активного кислорода, подавляет дыхательную функцию крови [1].
Установление цепного радикального механизма окисления гемоглобина нитритом натрия предполагает применение препаратов, обладающих антирадикальной и антиоксидантной активностью, для коррекции различных последствий
метгемоглобинемии. Оправданным путем коррекции энергодефицитных состояний, возникающих при гипоксии является использование веществ, близких к естественным редокс-переносчикам, способных участвовать в электронном обмене между отдельными компонентами дыхательной цепи митохондрий. Одним из таких препаратов является гипоксен [2].
Другим путем коррекции гипоксических состояний является использование естественных компонентов цепи переноса электронов — коэнзима 010. В условиях энергодефицита также возможно применение средств выполняющих в клетках организма универсальную энергосинтезирующую функцию и усиливающих сукцинатоксидазное окисление. К таким средствам относится препарат цитофлавин.
Процесс формирования адаптации к гипоксии вовлекает множество систем и механизмов, одним из них является метаболизм оксида азота (N0). Оксид азота оказывает мощное противовоспалительное и антитромбогенное действие, облададает
—--—
~ 159 ~
антиоксидантным действием [3]. Одним из путей увеличения выработки NO является применение ингибиторов аргиназы. Наименее изученным среди неселективных ингибиторов аргиназ остается L-норвалин.
Учитывая вышеизложенное, представлялось перспективным сочетанное применение ингибитора аргиназы L-норвалина и антигипоксантов различного механизма действия для коррекции ги-поксических состояний.
Целью настоящего исследования явилось изучение антиоксидантного действия L-норвалина и его сочетанного применения с антигипоксантами различного механизма действия в условиях геми-ческой гипоксии.
Материал и методы. Исследования проведены на 48 крысах Вистар массой 180—200 г с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (г. Страсбург, Франция, 1986) Гемическую гипоксию моделировали путем подкожного введения NaNO2 в дозе 50 мг/кг [4]. Эксперимент проводили ежедневно, в течение 5 дней. L-норвалин (WIRUD GmbH Hamburg, любезно предоставленный д.м.н.. профессором М.В. Покровским) вводили внутри-брюшинно в дозе 15 мг/кг за 30 мин до гипоксиче-ского воздействия. Цитофлавин (80 мг/кг), кудесан (10 мг/кг) вводили внутрибрюшинно, гипоксен (80 мг/кг) вводили внутрижелудочно также за 30 мин до гипоксического воздействия. Контрольным животным вводили физиологический
раствор. Животных выводили из эксперимента через 24 ч после последнего сеанса гипоксии.
В сыворотке крови определяли содержание первичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) — диеновых конъюгатов (ДК), вторичных — малонового диальдегида (МДА) и концентрацию стабильных метаболитов азота [5; 6]. Антиоксидантный статус оценивали по активности в сыворотке крови каталазы, вычисляли общую антиоксидантную активность [7].
Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления среднеарифметической (М) и ошибки средней (m). Достоверность статистических различий средних арифметических величин оценивалась с помощью одно-факторного дисперсного анализа — ANO VA, критерия Ньюмена-Кейлса в програмном комплексе «БИОСТАТИСТИКА для Windows».
Результаты. Исследовано изменение окси-дантных и антиоксидантных показателей, уровня стабильных метаболитов азота у контрольных животных и на фоне применения L-норвалина и антиоксидантов в условиях гемической гипоксии. Установлено, что при гемической гипоксии происходит увеличение промежуточных и конечных продуктов ПОЛ. Концентрация МДА увеличилась с 2,3 ± 0,11 мкмоль/л в контроле до 3,54 ± ± 0,11 мкмоль/л в группе животных, подвергшихся гипоксии. Показатель концентрации ацилгидропе-рекисей (Ai И) увеличился в 4,5 раза по сравнению с данными контрольной группы животных (табл. 1).
Таблица 1
Влияние Ь-норвалина и антигипоксантов на антиоксидантный статус и перекисное окисление липидов сыворотки крови крыс в условиях гемической гипоксии
№ п/п Условия опыта МДА, мкмоль/мл АГП (ДК), усл. ед. ОАА, % Каталаза, мккат/мл
1. Контроль 2,3 ± 0,11 0,22 ± 0,05 42,45 ± 0,41 23,8 ± 0,72
2. Моделирование ГГ 3,54 ± 0,11*' 1,0 ± 0,01* 30,5 ± 1,16* 12,2 ± 0,8*1
3. ГГ + L-норвалин 2,81 ± 0,15*2 0,52 ± 0,07*1,2 37,75 ± 1,34*1,2 15,38 ± 1,31*1
4. ГГ + L-норвалин + цитофлавин 2,99 ± 0,12*1,2 0,47 ± 0,06*1,2 36,17 ± 1,41*1,2 15,88 ± 1,24 *1,2
5. ГГ + L-норвалин + цитофлавин + гипоксен 2,57 ± 0,11*2 0,40 ± 0,05*1,2 37,6 ± 2,59*2 17,72 ± 1,4*1,2
6. ГГ + L-норвалин + цитофлавин + кудесан 2,62 ± 0,11*2 0,43 ± 0,08*1,2 38,17 ± 1,69*1,2 15,43 ± 1,18*1,2
Примечание: здесь и на рис. 1: ГГ — гемическая гипоксия; * — достоверность различий средних арифметических величин, р < 0,05; цифры рядом со звездочкой обозначают, по отношению к показателю какой группы эти различия достоверны.
—--—
~ 160 ~
Введение L-нopвaлинa и антигипоксантов достоверно (р < 0,05) уменьшало концентрацию МДА и диеновых коньюгатов во всех группах экспериментальных животных. Применение комбинации L-нopвaлинa, цитофлавина и гипоксена проявляло наибольшую антиоксидантную активность по всем изучаемым параметрам. Общая антиокси-дантная активность достоверно увеличивалась во всех экспериментальных группах животных (табл. 1).
Оксид азота является регулятором множества процессов в организме [3]. Однако следует еще раз указать на полифункциональность его действия, которое нельзя сводить только к «положительным» или только к «отрицательным» эффектам. Биологический ответ на N0 в значительной степени определяется условиями его генерации —
где, когда и в каком количестве продуцируется это соединение. Поэтому представляло интерес изучение уровня стабильных метаболитов N0 сыворотки крови в условиях гемической гипоксии, а также при коррекции антигипоксантами и применении ингибитора аргиназы — L-нopвaлинa, который усиливает выработку N0.
При гипоксии происходит активация ферментативных и неферментативных систем, участвующих в образовании N0 из ионов N02 , имеет место активация цикла оксида азота: L-apгинин ^ N0 ^ N02 /^03 ^ N0. Поэтому, гемическая гипоксия сопровождается повышением концентрации стабильных метаболитов N0 в сыворотке крови в 1,6 раза по сравнению с данными группы контрольных животных (рис. 1).
метаболиты NO мкмоль/л
*1,2
"t
*1,3
*1,3
*1,3
1 2 3 4 5 6
Рис. 1. Влияние L-нopвaлинa и антигипоксантов на уровень стабильных
метаболитов N0 в условиях гемической гипоксии:
1 — контроль; 2 — гемическая гипоксия; 3 — L-нopвaлин + ГГ; 4 — L-нopвaлин.
цитофлавин + ГГ; 5 — L-нopвaлин, цитофлавин, гипоксен + ГГ;
6 — L-нopвaлин, цитофлавин, кудесан + ГГ
Введение L-нopвaлинa еще более увеличивает концентрацию метаболитов N0 (в 1,9 раза к контролю). Возможно, это приводит к более выраженным компенсаторно-приспособительным изменениям, таким как индукция перераспределения
белков из растворимого в мембранно-связанное состояние, активацию ферментативных систем, участвующих в синтезе АТФ. Введение антиокси-дантов в комбинации с L — норвалином демонстрирует инверсный вариант действия. Концент-
8
7
6
2
1
0
—--—
~ 161 ~
рация метаболитов N0 снижается при сочетанном применении Ь-норвалина с антиоксидантами до показателей группы животных подвергшихся ГГ. Применение антиоксидантов различного механизма действия, корректирует метаболические нарушения, возникающие при гипоксии, что приводит к меньшей выработке метаболитов N0 и частично нивелирует эффект применения Ь-норвалина (рис. 1).
Выводы
1. Введение Ь-норвалина и антигипоксантов с различным механизмом действия в условиях гемической гипоксии увеличивает общую антиок-сидантную активность и уменьшает содержание вторичных продуктов ПОЛ в сыворотке крови экспериментальных животных.
2. Наибольший эффект проявляли комбинации Ь-норвалина с гипоксеном и цитофлавином.
3. Введение Ь-норвалина, на фоне гемической гипоксии, достоверно увеличивает концентрацию стабильных метаболитов N0.
4. Введение антиоксидантов в комбинации с Ь-норвалином демонстрирует инверсный вариант действия.
ЛИТЕРАТУРА
1. Фаткуллин К.В., Гильманов А.Ж., Костюков Д.В. Клиническое значение и современные методологические
аспекты определения уровня карбокси- и метгемогло-бина в крови // Практическая медицина. 2014. № 3. С. 17—21.
2. Николаев С.Б., Быстрова H.A., Конопля А.И. Иммуномодулирующие и антиоксидантные эффекты гипоксена в условиях экспериментального инфаркта миокарда // Аллергология и иммунология. 2009. Т. 10. № 2. С. 286.
3. Кульманова М.У., Касимова Г.З., Сабирова P.A. Оксид азота и его роль в развитии патологических состояний. Ташкент: Ташкентская медицинская академия, 2014.
4. Лукьянова Л. Д. Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предназначенных для клинического изучения в качестве ан-тигипоксических средств. М., 1990.
5. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарби-туровой кислоты //Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. М.: Медицина, 1977. С. 66—68.
6. Метельская В.А., Туманова Н.Г. Оксид азота: роль в регуляции биологических функций, методы определения в крови человека // Лабораторная медицина. 2005. № 7. С. 19—24.
7. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. 1988. № 1. С. 16—19.
INVESTIGATION OF ANTIOXIDANT ACTIVITY IN ANTIHYPOXANTS WITH DIFFERENT ACTION MECHANISM AND L-NORVALINE UNDER HEMIC HYPOXIA CONDITIONS
M.M. Angalev, E. V. Avdeyeva, N.A. Bystrova
Kursk State Medical University
Department of normal physiology, department of biochemistry Kursk, Russia,
Annotation. The influence of L-norvaline and its combination with cytoflavin, kudesan, hypoxenum on the intensity of lipid peroxidation, concentration of stable nitrogen metabolites in rat blood serum and antioxidant activity under hemic hypoxia has been studied. The investigation has shown that the administration of L-norvaline and antihypoxants with different action mechanisms increases the total antioxidant activity and reduces the contents of lipid peroxidation secondary products. The introduction of L — norvaline certainly increases the concentration of stable NO metabolites.
Key words: L-norvaline, cytoflavin, kudesan, hypoxen, antioxidant effects, stable nitrogen metabolites, hemic hypoxia.
—--—
~ 162 ~
REFERENCES
1. Fatkullin K.V., Gil'manov A.Zh., Kostjukov D.V. Klinicheskoe znachenie i sovremennye metodologicheskie aspekty opredelenija urovnja karboksi- i metgemoglobina v krovi. Nauchno-prakticheskij medicinskij zhurnal «Prakticheskaja medicina», 2014, no. 3, pp. 17—21.
2. Nikolaev S.B., Bystrova N.A., Konoplja A.I. Im-munomodulirujushhie i antioksidantnye jeffekty gipoksena v uslovijah jeksperimental'nogo infarkta miokarda. Aller-gologija i immunologija, 2009, vol. 10, no. 2, pp. 286.
3. Kul'manova M.U., Kasimova G.Z., Sabirova R.A. Oksid azota i ego rol' v razvitii patologicheskih sostojanij. Tashkent: Tashkentskaja medicinskaja akademija, 2014.
4. Luk'janova L.D. Metodicheskie rekomendacii po jeksperimental'nomu izucheniju preparatov, prednaznachen-nyh dlja klinicheskogo izuchenija v kachestve antigipok-sicheskih sredstv. Moscow, 1990.
5. Stal'naja I.D., Garishvili T.G. Metod opredelenija malonovogo dial'degida s pomoshh'ju tiobarbiturovoj kisloty. Sovremennye metody v biohimii. Ed. V.N. Oreho-vicha. Moscow, Medicina, 1977. P. 66—68.
6. Metel'skaja V.A., Gumanova N.G. Oksid azota: rol' v reguljacii biologicheskih funkcij, metody opredelenija v krovi cheloveka. Laboratornaja medicina, 2005, no. 7, pp. 19—24.
7. Koroljuk M.A., Ivanova L.I., Majorova I.G Metod opredelenija aktivnosti katalazy. Lab. delo, 1988, no. 1, pp. 16—19.
w UHMFtM
Ы\ШШ tu
¡NFO0ASC ind€k wmx®G0PERNKUS OAJJ JСЖ Qülríchsweb
iHTiiHiTiesii nc 1 ,---
G9^Slev^CiteFactor © ШШ— Ш
