CC BY
952012
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Химия
Вып. 2(6)
УДК 631.114
ИССЛЕДОВАНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ
Е.А. Вялых, С.А. Иларионов, А.В. Жданова
Пермский государственный национальный исследовательский университет 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15 E-mail: [email protected]
В работе представлены результаты изучения аминокислотного состава двух фракций гуминовых кислот, выделенных из торфа, за счет повторной экстракции пробы щелочным раствором. Изучено влияние условий проведения гидролиза на количественное содержание свободных форм аминокислот в гидролизате.
Ключевые слова: гуминовые кислоты; аминокислотный состав; условия гидролиза
Введение
Основой органического вещества почвы являются гумусовые соединения. Они широко применяются в сельском хозяйстве для повышения плодородия земель, в кормовых добавках, в природоохранных технологиях. Все более масштабными становится исследования их применения в медицине, в качестве лекарственных компонентов. Уникальностью этих веществ является полиморфизм молекул. До настоящего времени не предложено полного и адекватного определения гуминовых кислот, так как нет четкого представления о их структуре. Одно из определений, предложенное Д.С. Орловым «гуминовые кислоты - это более менее темноокрашенные азотсодержащие высокомолекулярные соединения преимущественно кислотной природы» [1]. На рис. 1 представлена гипотетическая формула гуми-новой кислоты, предложенная К1етЬетре1 [2]. В связи с вышесказанным, для идентификации этих веществ используют несколько физико-химических методов анализа. Основными являются элементный анализ, ИК- и ЯМР-спектроскопия. Перечисленные методы позволяют изучать состав и содержание эле-
ментов и функциональных групп. Для анализа структурных фрагментов, которые в гумино-вых кислотах представлены в основном окисленными ароматическими структурами, такими как производные фенола, замещенные бен-золкарбоновые кислоты, процент содержания которых 20-45 %; углеводными фрагментами (20-35 %); аминокислотными остатками
(5-15 %), используют другие физико-
химические методы анализа. Термостабильные фрагменты анализируют пиролитической газовой хромато-масс-спектрометрией. Основные молекулярные структуры, идентифицируемые с помощью этого метода - жирные кислоты (С10-25), ароматические молекулы типа бензола и его производных; моно-, ди-, три- и пентакарбоновые бензойные кислоты; метокси- и гидроксизамещенные циклические фрагменты; углеводы (фуран, и его замещенные аналоги), пяти- и шестичленные гетероциклы и их производные, а также структурные компоненты лигнина [3-16]. Однако эти данные сильно варьируются в зависимости от условий проведения пиролиза, выбора реагентов и происхождения самих гумусовых веществ. При исследовании термолабильных компонентов - углеводов, аминокислот при-
© Вялых Е.А., Иларионов С. А., Жданова А. В., 2012
66
меняют высокоэффективную жидкостную хроматографию [17]; жидкостную хроматографию, совмещенную с хромато-масс-спектрометрией, электрофорез в полиакриламидном геле [18,19].
Для осмысления процессов образования гумусовых веществ неоднократно предпринимались попытки моделирования подобных реакций. Так, в работе [20] моделировали процесс образования гумусовых веществ на основе реакции Майяра за счет взаимодействия белковых молекул с углеводами и образования керогеноподобных структур. В работе [21] синтезировали гумусоподобные соединения при окислительном процессе взаимодействия катехина с аминокислотой или дипептидом. Я. IsЫwatari с соавторами [22] изучали механизм формирования искусственных гу-миновых веществ в процессе синтеза из аминокислот и глюкозы или галактозы при протекании реакции перманганатного окисления. Как правило, исследования, связанные с изучением аминокислотных фрагментов в гумусовых веществах, сводятся к определению общего и белкового азота [1], а также аминокислотного состава гумусовых кислот, выде-01?*
;оон_|
ленных из различных видов почв. Авторы в работе [23] исследовали белки, выделенные из трех фракций гумусовых веществ, полученных методами электрофореза в полиакриламидном геле и тонкослойной хроматографией, а также гидролизат белков на качественное и количественное содержание аминокилсот. В
[24] представлен сравнительный анализ молекулярных фрагментов: углеводов, липидов и аминокислот, в гумусовых соединениях, выделенных из различных источников.
Показано, что, как правило, варьирование качественного и количественного содержания аминокислот в составе гумусовых веществ происходит в узком диапазоне [1]. Можно предположить, что определение аминокислотного состава, является еще одним методом идентификации этого класса соединений.
Для определения аминокислотного состава образцов вначале проводят гидролиз пробы. Существуют различные варианты химического гидролиза белка, наиболее часто применяемый - гидролиз с добавлением 6 М HCl, при 105-110 0С в течение 12-16 ч. [25].
о
JI соон
.у-«»С£
СООН
NHipCH2-CH2-NH2
, CH,QH .
он
Рис. 1. Структура молекулы ГК почвы по Kleinhempel [2].
Однако при этой схеме анализа происходит полное разрушение триптофана [26]. Для определения последней аминокислоты выполняют щелочной гидролиз. Подготовленный гидролизат можно анализировать разными методами. Широко применяется ионообменная хроматография, метод реализован на приборе, называемом автоматическим анализатором аминокислот. Сущность метода состоит в том, что белковый гидролизат разделяется на компоненты в колонке с ионообменником, затем при взаимодействии с нингидриновым реактивом происходит окрашивание вещества, количественная регистрация которого выполняется фотометрически. Полный анализ гидролизата продолжается примерно 24 ч.
[25].
Для анализа белкового гидролизата применяют бумажную хроматографию, электрофорез и газожидкостную хроматографию, как правило, для дополнения и уточнения результатов аминокислотного анализа, полученного при помощи автоматического анализатора. Газожидкостную хроматографию можно применять и как самостоятельный метод анализа белковых гидролизатов. Время, требуемое для проведения анализа газожидкостной хроматографии, сокращается и составляет не более 1 ч. [25].
Метод капиллярного электрофореза позволяет выполнять анализ свободных форм аминокислот в растворе. Как правило, методика определения включает предварительную процедуру получения фенилизотиокарбамильных производных. При этом время выполнения анализа занимает не более 30 мин., что значительно быстрее, чем для других методов.
Целью данной работы являлось исследование аминокислотного состава почвенных гумусовых веществ методом капиллярного электрофореза при проведении гидролиза в различных условиях.
Экспериментальная часть
Гуминовые кислоты выделяли из торфа по стандартной методике: добавляли 0,1 N раствор №ОИ и оставляли раствор на 24 ч. Далее
смесь фильтровали от не растворившегося остатка. В фильтрат добавляли 10 % HCl для осаждения гуминовых кислот, а не растворившийся осадок вновь обрабатывали щелочным раствором гидроксида натрия, а через 24
ч. повторяли процедуру получения коллоидного раствора гуминовых кислот. Полученные осадки центрифугировали при 8000 об/мин., в течение 10 мин., отделяли от супернатанта, промывали порцией дистиллированной воды и высушивали при 50 0С. Высушенные препараты использовали для дальнейших анализов.
Гидролиз препарата проводили несколькими способами:
1. Навеску массой 0,05 г смешивали с 10 мл 6 М HCl, помещали в виалу для гидролиза и оставляли при температуре 115 0С на 14 или 20 ч.
2. Гидролиз той же по количественному составу смеси проводили при 150 0С в течение 30, 45 или 60 мин. в микроволновой системе «MARS».
3. Для анализа цистина, глутаминовой и аспарагиновой кислот навеску предварительно обрабатывали смесью 30 % Н2О2 и НСООН (конц.) в соотношении 1:9, высушивали и смешивали с 10 мл 6 М НС1, после чего проводили гидролиз одним из выше перечисленных способов.
Полученные гидролизаты фильтровали через фильтр «синяя лента», и использовали для получения фенилтиокарбамильных производных аминокислот, которые далее анализировали методом капиллярного электрофореза («Капель-105 М», Россия) по методике, предложенной в работе [26].
Результаты и обсуждение
Поскольку гидролиз проводили 6 М HCl, а известно, что гуминовые кислоты не растворимы в кислых растворах, было изучено влияние времени проведения процесса и температуры на степень выхода аминокислот при гидролизе препарата, так как повышение температуры и времени воздействия ведет к увеличению степени разложения проб, но при
определенной температуре и давлении начинается разрушение самих аминокислот.
Исходя из литературных данных, были выбраны следующие условия проведения процесса: температура 115 0С, время проведения гидролиза 14 и 20 ч.; температура 150 0С, время - 30, 45 и 60 мин. Данные по аминокис-
Содержание аминокисл<
лотному составу гидролизатов, полученных в разных условиях, представлены в табл.1.
В литературе часто встречаются сведения о том, что гумусовые вещества при однократной обработке почвы щелочным раствором извлекаются не полностью [27, 28].
Таблица 1
в гидролизатах (% мас.)
Название аминокислоты Условия проведения процесса гидролиза
г= 1150С 1= 150°С
14 ч. 20 ч. 30 мин. 45 мин. 60 мин.
Проба №1* Проба № 1 Проба № 2 Проба № 1 Проба № 2 Проба № 1 Проба № 1
Аргинин 0,24 0,25 0,04 0,25 0,04 0,23 0
Лизин 0,17 0,18 0,26 0,18 0,18 0,16 0,01
Тирозин 0,12 0,09 0,08 0,09 0,04 0,12 0
Фенилаланин 0,23 0,26 0,26 0,26 0,21 0,22 0
Гистидин 0,10 0,30 0,12 0,30 0,10 0,10 0
Лейцин+Изолейцин 0,55 0,60 1,04 0,60 1,31 0,52 0,10
Метионин 0,16 0,42 0,50 0,42 0,33 0,06 0
Валин 0,28 0,17 0,11 0,17 0,09 0,27 0,04
Пролин 0,27 0,29 0,43 0,29 0,36 0,27 0,32
Треонин 0,33 0,32 0,40 0,32 0,30 0,31 0,07
Серин 0,29 0,29 0,27 0,29 0,23 0,28 0,25
Аланин 0,38 0,42 0,61 0,42 0,51 0,36 0
глицин 0,41 0,45 0,66 0,45 0,57 0,39 0,02
Аспарагиновая кислота 0,22 0,29 0,28 0,36 0,40 0,35 0,01
Глутаминовая кислота 0,42 0,46 0,58 0,31 0,45 0,48 0
Цистеиновая кислота 0,10 0,06 0,04 0,15 0,13 0,12 0
Суммарное содержание 4,27 4,85 5,68 4,86 5,25 4,24 0,82
* проба 1, 2 - гуминовые кислоты, выделенные в результате обработки почвы раствором щелочи первый и второй раз, соответственно.
Повторная обработка не растворившегося осадка ведет к дальнейшему экстрагированию органического вещества из образца. В данной работе было изучено изменение содержания аминокислот в гуминовых кислотах при повторной обработке образца раствором щелочи.
Из полученных данных (табл. 1) видно, что максимальный гидролиз пептидов в таких веществах, как гуминовые кислоты, происхо-
дит при следующих параметрах: t=1150С, время проведения процесса - 20 ч., или t=1500С и время - 30 мин., в последнем случае увеличение времени ведет к снижению количественного содержания свободных форм аминокислот в растворе, что можно объяснить их разрушением.
При повторной обработке почвы щелочью были выделены гуминовые кислоты, содержание аминокислот в которых выше, чем в
пробе №1. Это может быть следствием двух причин: во-первых, более длительное воздействие щелочного раствора ведет к диссоациа-ции кластеров органического вещества на меньшие по размеру фрагменты и, как следствие, более полному гидролизу; во-вторых, достигается более высокий процент растворения органического вещества за счет разрушения большего количества органоминеральных комплексов почвы.
Обращает на себя тот факт, что во второй пробе более низкое содержание аргинина 0,04%, в то время как в первом образце -
0,25%, при этом возрастает суммарное содержание лейцина, изолейцина (с 0,60 % до 1,04-1,31 %), и глицина (С 0,45 % до 0,66 %). Уменьшение аргинина можно объяснить гидролизом связи С—N
NH О
nh2
Повышение содержания лейцина, изолейцина и глицина может быть обусловлено разрушением молекулярных кластеров гумусовых веществ на более простые фрагменты за счет разрыва водородных, сложноэфирных и других легкогидролизуемых в щелочной среде связей. Например, глицин может образовываться в результате гидролиза С—N связи в дикетопиперазине:
ХЬ
:о,н
или других окисленных азотсодержащих циклов.
Заключение
Аминокислоты, входящие в состав гумусовых веществ, наряду с ароматическими фрагментами являются основными молекулярны-
ми структурами этих соединений, и играют значительную роль в их формировании.
На основе полученных результатов можно сделать вывод, что в процессе щелочного гидролиза почвенных образцов происходит разрыв легкогидролизуемых связей в органическом веществе, и, как следствие, формирование меньших по размеру молекулярных кластеров гуминовых кислот. Кислотный гидролиз последних приводит к разрушению гетероциклов и повышению содержания простых молекулярных фрагментов, в том числе аминокислот.
Библиографический список
1. Орлов Д. С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М.: МГУ, 1990. С. 325.
2. Kleinhempel D. Ein beitrag zur theorie des huminstoffzusstandes // Albrecht-Thaer-Archiv. 1970. 14, P. 3-14.
3. Amir S., Hafidi M., Lemee L., Bailly J.-R., Merlina G., Kaemmerer M., et al. Structural characterization of fulvic acids, extracted from sewage sludge during composting, by thermochemolysis-gas chromatography-mass spectrometry // J. Anal. Appl. Pyrolysis. 2006. 77, Р.149-158.
4. Amir S., Hafidi M., Lemmee L., Merlina G., Guiresse M., Pinelli E., et al. Structural characterization of humic acids, extracted from sewage sludge during composting, by ther-mochemolysis-gas chromatography-mass spectrometry // Process Biochemistry. 2006. 41. Р.410-422.
5. Buurman P., Nierop K., Kaal J., Senesi N. Analytical pyrolysis and thermally assisted hydrolysis and methylation of Eurosoil hu-mic acid samples — а key to their source // Geoderma. 2009. 150, Р.10-22.
6. Fabbri D., Vassura I., Snape C. E. Simple off-line flash pyrolysis procedure with in situ silylation for the analysis of hydroxyben-zenes in humic acids and coals // Journal of Chromatography. 2002. 967, P. 235-242.
7. Faure P., Jeanneau L., Lannuzel F. Analysis
of organic matter by flash pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry in the presence of Na-smectite: When clay minerals lead to identical molecular signature // Organic Geochemistry. 2006. 37, P.
1900-1912.
8. Fukushima M., Yamamoto M., Komai T.,
Yamamoto K. Studies of structural alterations of humic acids from conifer bark residue during composting by pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry using tetramethylammonium hydroxide (TMAH-py-GC/MS) // J. Anal. Appl. Pyrolysis. 2009. 86,
P.200-206.
9. Gonza'lez-Pe'rez J. A., Arbelo C. D.,
Gonza'lez-Vila F. J., Rodri'guez A., Almendros G., Armas C. M., et al. Molecular features of organic matter in diagnostic horizons from andosols as seen by analytical pyrolysis // J. Anal. Appl. Pyrolysis. 2007. 80, P.369-382.
10. Guignard C., Lemeve L., Amble A. Lipid constituents of peat humic acids and humin. Distinction from directly extractable bitumen components using TMAH and TEAAc ther-mochemolysis // Organic Geochemistry. 2005. 36, P. 287-297.
11. Ikeya K., Ishida Y., Ohtani H., Watanabe A. Effect of off-line methylation using carbanion and methyl iodide on pyrolysis-gas chromatographic analysis of humic and fulvic acids // J. Anal. Appl. Pyrolysis. 2006. 75, P.174-180.
12. Li L., Jia W., Sheng G., Fu J., Huang W. Compositional and source characterization of base progressively extracted humic acids using pyrolytic gas chromatography mass spectrometry // Applied Geochemistry. 2006. 21, P.1455-1468.
13. Olivella M. A., Ri o del J. C., Palacios J., Vairavamurthy M. A., Heras F.-X. C. Characterization of humic acid from leonardite coal: an integrated study of PY-GC-MS, XPS and XANES techniques // Journal of Analytical and Applied Pyrolysis. 2002. 63, P. 59-68.
14. Page D. W., Leeuwen J. A., Spark K. M., Mulcahy D. E. Application of pyrolysis-gas
chromatography/mass spectrometry for characterisation of dissolved organic matter before and after alum treatment // Journal of Analytical and Applied Pyrolysis. 2003. 67. P. 247-262.
15. Poerschmann J., Trommler U., Fabbri D., Govrecki T. Combined application of nondiscriminated conventional pyrolysis and tetramethylammonium hydroxide-induced thermochemolysis for the characterization of the molecular structure of humic acid isolated from polluted sediments from the Ravenna Lagoon // Chemosphere. 2007. 70, P. 196-205.
16. Zhao J., Peng P., Song J., Ma S., Sheng G., Fu J. Characterization of organic matter in total suspended particles by thermodesorption and pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry // Journal of Environmental Sciences. 2009. 21, P. 1658-1666.
17. Andersson P., Berggren D. Amino acids, total organic and inorganic nitrogen in forest floor soil solution at low and high nitrogen input // Water, air, and soil pollution. 2005 162, P.369-384.
18. Nunn B.L., Keil R.G, Size distribution and amino acid chemistry of base-extractable proteins from Washington coast sediments // Biogeochemistry. 2005. 75, P. 177-200.
19. Chiavari G., Torsi G., Fabbri D., Galletti G.C. Comparative Study of humic substances in soil using pyrolytic techniques and other conventional chromatographic methods // Analyst. 1994. 199, P. 1141-1150.
20. Yamamoto S., Ishiwatari R. A study of the formation mechanism of sedimen-taryhumic substances—II. Protein-based m elanoidin model // Organic Geochemistry. 1989. 14, P. 479-489.
21. Junga A.-V., Frochotb C., Parantc S., Lar-tigesa B.S., Selvec C., Viriotb M.-L., Ber-sillona J.-L. Synthesis of amino-phenolic humic-like substances and comparison with natural aquatic humic acids: A multi-analytical techniques approach // Organic Geochemistry. 2005. 36. P. 1252-1271.
22. Ishiwatari 1 R., Morinaga S., Yamamoto 1 S.,
Machihara T., Rubinsztain Y., Ioselis P., Ai-zenshtat Z., Ikan R. A study of formation mechanism of sedimentary humic sub-stances-I. Characterization of synthetic humic substances (melanoidins) by alkaline potassium permanganate oxidation // Organic Geochemistry. 1986. 9. P. 11-23.
23. Ramunni R., Scialdone D., Felleca. Analytical problems in determining peptide nitrogen in thehumic fractions of three Italian soils // Organic Geochemistry. 1985, P. 87-93.
24. Allard B. A comparative study on the chem-
ical composition of humic acids from forest soil, agricultural soil and lignite deposit: Bound lipid, carbohydrate and amino acid distributions // Geoderma. 2006. 130,
P. 77-96.
25. Цыганов А.Р., Минов В.М., Каль В.И.и др. Белки и пептиды: методические указания. Белорус. гос. с-х. академия: «Горки», 2003. 28 с.
26. Комарова Н. В., Каменцев Я. С. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ». СПб.: «Веда», 2006. С. 213
27. Милановский Е.Ю., Шеин Е.В. Структура почв // Природа. 2003. № 3. с. 28 - 32.
28. Humic Substances: Structures, Models and Functions. - The Royal Society of Chemistry. 2001 editer by Ghabbour E.A.
ANALYSIS OF AMINO ACID COMPOSITION FOR HUMIC ACIDS E.A. Vialykh, S.I. Ilarionov, A.V. Zhdanova
Perm State University. 15, Bykirev st., Perm, 614990 E-mail: [email protected]
The paper contains the results of a study of amino acid composition of two fractions of humic acids isolated from peat, due to re-extract the sample with an alkaline solution. The effect of hydrolysis conditions on the quantitative content of free-form amino acids in the hydrolyzed.
Key words: humic acid; amino acid composition; the conditions of hydrolysis
