CC BY
147
УДК544.72;579.63
ИССЛЕДОВАНИЕ АДГЕЗИИ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ПОВЕРХНОСТЯХ ЖИЛЫХ ПОМЕЩЕНИЙ И ИЗМЕРЕНИЕ АДГЕЗИОННОЙ СИЛЫ
А.Г. Варехов1
Санкт-Петербургский государственный университет сервиса и экономики (СПб ГУСЭ),
191015, Санкт-Петербург, ул. Кавалергардская, 7
На основе обобщения имеющихся физических представлений о механизмах адгезионного взаимодействия микроорганизмов с твердыми поверхностями предложены экспериментальные методы прямого измерения адгезионной силы с использованием электрического поля. В статье представлены результаты прямых измерений силы адгезии микроорганизмов к металлу (нержавеющая сталь) и к полимерной пленке (политетрафторэтилен). Методы могут найти применение в технике отбора микробиологических проб для оценки биологического загрязнения (контаминации) жилых помещений.
Ключевые слова: адгезия, биологическое загрязнение, электрическое поле, сила адгезии, измерение, отбор проб.
RESEARCH OF ADHESION OF MICROORGANISMS ON SURFACES OF HOUSING ROOMS AND MEASUREMENT OF ADHESIVE FORCE
A.G.Varekhov
St.-Petersburg state university of service and economy (SPbSUSE), 191015, St.-Petersburg, streetKavalergardsky, 7 A.
On the basis of synthesis of available physical ideas of mechanisms of adhesive interaction of microorganisms with solid surfaces experimental methods of direct measurement of adhesive force with use of electric field are offered. Results of direct measurements of adhesive force of microorganisms to metal (steinless steel) and to a polymeric film (teflon) are presented in this article. The methods can be used in sampling equipment for assessment of biological contamination of housing rooms.
Keywords: adhesion, biological contamination, electric field, adhesive force, measurement, sampling
Электрофизические свойства клеточной поверхности, то есть заряд и потенциал, проявляются не только при взаимодействии клеток между собой, но также и при взаимодействии с различными абиогенными поверхностями, в частности, с поверхностями жилых помещений. Таким образом, эти свойства оказываются чрезвычайно важными с практической точки зрения.
Прилипание клеток к твердым поверхностям или адгезия понимается как контактное взаимодействие их с каким - либо твердым субстратом, поверхность которого не идентична клеточной. Межклеточные (когезионные) контакты давно и систематически изучаются в биологии в связи с проблемами морфогенеза, клеточной дифференцировки, пролиферативной активности и другими. Проблема адгезии становится главной в биотехнологии, когда возникает задача конструирования клеточных монослоев. Наконец, адгезия имеет прямое отношение к таким прикладным проблемам, как микробная контаминация, рост и размножение микроорганизмов на поверхности различных материалов, включая поверхности жилых помещений, биокоррозия или биодеструкция этих материалов и, в целом, анализ микробиологи-
ческого статуса жилых помещений. В частности, характер и сила взаимодействия микроорганизмов с поверхностью существенны для устройств вентиляции, фильтрации и стерилизации воздуха. Ясно, что адгезивное взаимодействие должно быть наиболее сильным в тех областях и на тех материалах, где осадки микробных частиц, уловленных из воздуха, подвергаются стерилизующим воздействиям. С другой стороны, именно климатические установки благодаря постоянству условий (прежде всего, температуры) часто являются наиболее подходящим местом (термостатом) для роста и развития микроорганизмов [1]-
Адгезию клеток и микроорганизмов необходимо разделить на активную и пассивную. При активной адгезии имеет место взаимодействие биологически активной частицы с субстратом, требующее клеточного метаболизма и. в большинстве случаев, специфического узнавания. Пассивная адгезия обусловлена физическими силами различной природы, в том числе электростатическими (зарядовыми и ди-польными), гидрофобным взаимодействием и водородными связями. В различных ситуациях, связанных с внутренней средой обитания (жилые помещения, системы жизнеобеспечения,
клиники, больницы и другие), обычно имеет место взаимодействие клеток или микроорганизмов с биологически индифферентным субстратом, не содержащим высокомолекулярных веществ (белков, полисахаридов), придающих адгезии специфический характер. Поэтому в большинстве таких ситуаций адгезионное взаимодействие можно свести к физическому взаимодействию контактирующих поверхностей.
Физический механизм адгезии показан экспериментально на примере прикрепления штамма Mycoplasma pneumoniae к стеклу [2]. Связывание микоплазм возрастало при нейтрализации отрицательно заряженных карбоксильных групп поверхности. Слияние (когезия) протопластов Aureobasidium pullulans [3] определялась величиной электрокинетического потенциала (g — потенциала) поверхности этих частиц. При изучении коллоидно-химических закономерностей адгезии Methylobacterium organophylum к твердым поверхностям было показано [4], что в этом случае взаимодействие может быть описано как дисперсионное, то есть взаимодействие индуцированных диполей. Внешняя оболочка бактерий рассматривалась при этом как аналог полисахаридного геля. Еще один пример - исследование характера связывания эритроцитов [5] при удалении поверхностных сиаловых кислот (то есть отрицательно заряженных карбоксилов клеточной поверхности). Эти и многочисленные другие примеры позволяют связывать адгезию с электростатическим взаимодействием. Из этого не следует, что адгезию всегда следует сводить к электростатическому взаимодействию контактирующих поверхностей, хотя целесообразность таких представлений очевидна. Точно так же прямое приложение к механизмам адгезии микроорганизмов классической теории ДЛВО (Дерягина-Ландау-Вервея-Овербека), разработанной первоначально для описания взаимодействия небиологических лиофобных (гидрофобных) коллоидов как правило, не приводит к успеху [6]. Например, Марудас [7] отмечает, что модель ДЛВО далеко не полно описывает адгезию микроорганизмов при увеличении отрицательного заряда поверхности (путем введения на поверхность полистирена отрицательно заряженных сульфогрупп). Сульфонирова-ние поверхности и как следствие увеличение ее смачиваемости с точки зрения увеличения адгезии было более существенным фактором, чем увеличение отрицательного заряда поверхности, препятствующее адгезии. Известное правило Дебройна [8] утверждает, что чем больше разница в смачивающей способности контактирующих поверхностей, тем слабее выражена адгезия. То же правило в несколько иной форме означает, что неполярные материалы имеют наименьшую адгезию к полярным материалам. В то же время ясно, что присутствие воды в месте контакта и уменьшение электростатиче-
ских сил отталкивания, в конечном итоге сводится к чисто физическому механизму, доступному количественному анализу. При контакте в воздухе кулоновское отталкивание значительно больше, чем при жидкостном контакте, в результате чего равновесное расстояние между контактирующими поверхностями относительно велико и близкодействующие (лондонов-ские) силы притяжения, пропорциональные 1/г6, не проявляются. Известно, например [9], что увеличение константы коагуляции частиц аэрозоля, то есть неводной дисперсной системы, благодаря молекулярным силам составляет не более 1-2-х процентов. Это позволяет предполагать, что, по крайней мере, в первичном пассивном контакте близкодействующие силы не имеют решающего значения.
Вопрос о соотношении различных сил и механизмов при взаимодействии микроорганизмов с поверхностью является наиболее сложным и одновременно одним из наиболее часто обсуждаемых. В конечном счете, при экспериментальном изучении адгезионных взаимодействий измеряемым параметром является сила или энергия. В этой статье даются экспериментальные результаты измерения адгезионных сил для двух практически важных случаев:
а) клетки на поверхности в общем случае, например, на поверхности жилых помещений;
б) клетки на осадительных поверхностях элек-тропреципитаторов или других устройств того же назначения в системах кондиционирования воздуха.
Адгезия клеток Escherichia Coli изучалась в наших экспериментах при их преципитации в электростатическом поле. Осаждение (преципитация) незаряженных частиц на электродах происходит под действием силы F = (pV)£
где: р — индуцированный дипольный момент; Е — напряженность поля; V — оператор векторного дифференцирования, и определяется действующей напряженностью электрического поля.
Клетки на электродах приобретают заряд того же знака, что и заряд электрода, и, следовательно, притягиваются к противоположному электроду. В принципе, в такой системе возможны автоколебательные движения частиц: при отрыве от одного из электродов частица достигает другого электрода и перезаряжается; далее процесс периодически повторяется. Возможность таких колебаний определяется величиной адгезионной силы. При этом омический контакт частицы с электродом может отсутствовать, а зарядка и перезарядка частиц могут происходить путем туннельного пробоя в месте контакта. Нетрудно произвести следующий простой расчет. Пусть напряженность поля между плоскими электродами пре-ципитатора составляет умеренное значение, равное 2,5кВ ■ см-1, и размер частицы на элек-
троде (длинная ось палочки E.Coli), составляет 2 мкм (микрона). Если считать поверхность клетки эквипотенциальной, что вполне соответствует действительности, то при этом так называемый дефицит потенциала (падение напряжения на клетке) 2,5-105х2-10_6 =
0,5 В равен как раз той разности потенциалов, которая действует в малом промежутке между частицей и электродом (аналог контактной разности потенциалов в твердом теле). Этой величине контактной разности потенциалов соответствует напряженность поля, типичная для плотной части двойного электрического слоя и равная приблизительно 109В-м_1. Предположим, что механизмом перезарядки частицы является сопутствующая туннелированию холодная автоэлектронная эмиссия Фаулера-Нордгейма [10] с пороговой напряженностью поля, равной 107В ■ м-1. Отсюда, расстояние между обеими контактирующими поверхностями клетки и электрода оказывается равным 500А=0,05мкм, что соответствует неплотному контакту. На основании этих расчетов можно предполагать, что уже на стадии такого не очень плотного контакта (0,05мкм) частицы с поверхностью автоэлектронная эмиссия разряжает двойной электрический слой. При этом частица заряжается одноименным с электродом зарядом, устанавливается равновесное расстояние между контактирующими поверхностями, а сила притяжения (адгезии) определяется, в основном, зеркальной электростатической силой. Если использовать приведенные ниже данные прямого измерения адгезионной силы (в ньютонах) = (1 ^ 7) ■ 10-10 и далее определить константу молекулярного взаимодействия (константу Гамакера) из известного [8] соотношения (формула Лондона)
= А/б^к3, где сила молекулярного взаимодействия; А — константа Гамакера; к — расстояние (зазор) между контактирующими поверхностями, то при и к = 0,5 ■ 10_7м получа-
ем А = 8 ■ 10_31Дж ■ м2, что значительно меньше значения, соответствующего типовому случаю (10_28Дж- м2) [8]. Из этого сопоставления, по-видимому, следует, что молекулярные силы не имеют существенного значения.
Для прямого измерения адгезионной силы были выполнены две серии экспериментов. Приведем сначала краткое описание каждого из них.
1.Модельный биоаэрозоль E.Coli в наших экспериментах продувался через плоские сетчатые электроды, расположенные перпендикулярно воздушному потоку. Между электродами поддерживалась разность потенциалов, так что напряженность электрического поля находилась в пределах от 0 до 2 ■ 106В ■ м-1. Клетки, осажденные на электродах при пропускании через устройство известного объема воздуха,
отмывались дистилированной водой и после ресуспендирования в физиологическом растворе высевались на селективную питательную среду. Неосажденные в электростатическом поле клетки улавливались из того же объема на мембранном фильтре и после аналогичных процедур также высевались. Эффективность электропреципитации определялась как отношение числа клеток, осажденных на электродах, к общему числу клеток, в расчете на единицу объема продуваемого воздуха. Такие измерения были произведены для нескольких значений скорости воздуха в зависимости от напряженности электрического поля. При возрастании напряженности происходил отрыв частиц от электродов ранее осажденных частиц, что отмечалось в изменении эффективности преципитации и было исходным для расчета адгезионной силы.
2. В другой серии экспериментов микроорганизмы из воздуха осаждались путем седиментации на нескольких (10) одинаковых подложках из одного и того же материала. В качестве таких материалов использовались тонкие пленки из политетрафторэтилена (тефлона) на металле, которые почти не поляризуются и почти не смачиваются, и полированная нержавеющая сталь, которая идеально поляризуется и хорошо смачивается. Образцы подложек устанавливались далее в специальный адаптер, представляющий собой конденсатор, одна обкладка которого представляла собой подложку (тефлоновая пленка на металле или металл) с микроорганизмами, а другая была образована натянутым на металл мембранным фильтром марки МПНроге, пропитанным питательной средой. Отрыв спор от гладкой исследуемой поверхности и их адгезия на поверхности мембранного фильтра с последующим выращиванием колоний микроорганизмов позволяла непосредственно вычислять адгезионные силы. Напряженность поля в конденсаторе для ряда из 10-ти образцов линейно возрастала равными ступенями от образца к образцу до значения, близкого к предельному (пробивному для воздуха). В этих экспериментах использовались клетки культурных дрожжей Saccharomyces carlsbergensis и споры дикого штамма грибов PemciПmm, выделенных из воздуха. Известно, что дрожжи Sac.carlsbergensis обладают повышенной способностью к агрегации. Известна также их способность к флокуляции и образованию очень плотных осадков.
Грибы после отбора спор из воздуха выращивались на дрожжевом агаре, а затем с помощью специального устройства готовился аэрозоль, содержащий зрелые споры.
Все образцы получались путем распыления микроорганизмов в камере объемом около 0,1м3 с последующей седиментацией на 10 одинаковых подложек площадью приблизительно 12см2 каждая в течение 1 минуты. Воз-
действие электрического поля в адаптере производилось однократно в течение 10 секунд. Далее с помощью обычных средств производилось выращивание колоний на фильтрах с питательной средой. Как уже было отмечено, в ряду из 10-ти подложек напряженность поля возрастала по линейному закону; соответственно, в том же ряду число оторванных от подложек клеток и, следовательно, число выросших на мембранных фильтрах колоний, также росло по линейному закону. Расчет сводился к определению пороговой напряженности поля, при которой начинался отрыв клеток. Для проведения расчетов, а также и для постановки этих экспериментов требовалось знать некоторые опорные данные по адгезионной способности различных материалов. В частности, было известно, что энергия когезионного взаимодействия для политетрафторэтилена составляет [8] около 9 ■ 1 0 5м Д ж ■ м _ 2, что в 2 раза меньше, чем для полиэтилена, и в 300 раз меньше, чем для металла (медь). Таким образом, можно было предполагать, что адгезия клеток к большинству материалов будет располагаться в пределах между двумя рассмотренными выше случаями. Результаты экспериментов в кратком изложении сводятся к следующему.
пенсирует убыль частиц вследствие отрыва их от поверхности электродов, то есть преодоления адгезионной силы. Таким образом, эффективность преципитации начинает падать с увеличением скорости, проходя через максимум. Для биологических частиц (клеток) это означает известный эффект реинфицирования воздуха. Положение максимума кривой соответствует равенству электрической силы и силы адгезии. Для вычисления электрической силы, действующей на проводящую частицу на плоской электродной поверхности электропреципитато-ра, использовалось соотношение [11]
Ре = 5,487Г£0а2 Я2 , где: а — радиус сферической частицы;
напряженность поля у электрода;
электрическая постоянная. Для клетки Е.еоН, аппроксимированной эллипсоидом или вытянутым сфероидом использовалось аналогичное по форме соотношение , в котором малые
полуоси эллипсоида, в то время как большая ось эллипсоида 2а ориентирована вдоль линий напряженности поля. Клетки Е.еоН имеют длину около 2 микрон и диаметр около 1 микрона; соответственно, Ь = с = 0 , 5 м к м . Величина адгезионной силы, найденная при напряженности поля , соответствующей
максимуму преципитации (осаждения), равна Ре = Рач = 2 , 1 ■ 1 0 _ 1 2Н. Квадратичная парабола (4) на рис.1 показывает зависимость электрической (отрывающей) силы от напряженности поля в условиях эксперимента.
2. Во второй серия экспериментов непосредственно фиксировался отрыв спор грибов от подложек из политетрафторэтилена и нержавеющей стали в электрическом поле.
Рисунок 1. Эффективность преципитации клеток Escherichia Coli в зависимости от напряженности поля в преципитаторе для трех значений скорости течения: ( 1 - 0,01; (2 - 0,03; (3 - 0,05 метра в секунду; кривая (4 - показывает зависимость силы адгезии частиц от напряженности поля
1. Первая серия экспериментов состояла в исследовании зависимости коэффициента преципитации клеток на осадительных поверхностях электропреципитатора от напряженности электрического поля.
Графически эффективность преципитации биоаэрозоля E.Coli показана на рис.1 в функции напряженности поля для трех значений скорости течения 0 , 0 1 ; 0, 0 3 ; 0, 0 5 м-с _ 1 Эти зависимости показывают, что при достаточно больших скоростях (более 0 , 0 1 м-с _ 1 ) и напряженности поля более осаждение частиц под действием гидродинамических и электрических сил не полностью ком-
Рисунок 2. Зависимость силы адгезии спор P.еhrysogenum на подложках из нержавеющей стали (1) и политетрафторэтилена (2) от напряженности поля, вычисляемой на основе статистических данных по нормированному числу колоний грибов из спор, оторванных от подложки полем
Результаты измерений для спор грибов РетеИНит еhrysogenum, выделенных из возду-
ха лабораторного помещения, показаны на рис.2. По оси ординат отложены нормированные, то есть отнесенные к максимальному значению, числа колоний из спор, оторванных от подложки полем, в зависимости от напряженности поля. Из рисунка следует, что для обеих зависимостей 1 (нержавеющая сталь) и 2 (политетрафторэтилен) отрывающая или адгезионная сила изменяется в достаточно узком интервале значений напряженности поля.
Эти зависимости аналогичны статистическим функциям распределения, дифференциальная форма которых представляет собой, как это непосредственно следует из рис.2, симметричные (гауссовские) или почти симметричные функции плотности вероятности. Следовательно, отложенные по вертикали значения можно понимать как вероятности сепарации или отрыва частиц при условии, что отрывающая сила, пропорциональная квадрату напряженности поля, не превышает некоторого фиксированного значения. Тогда следует считать, что сила адгезии определяется напряженностью поля, соответствующей сепарации или отрыву 50% частиц. Таким образом, получаем значения
(нержавеющая сталь) и (политетрафторэтилен). Соответственно, адгезионные силы равны (нержавеющая сталь) и (политетрафторэтилен). Эти значения получены при значении среднего диаметра спор, равного примерно 2,6 микрона.
Полученные результаты, помимо того, что они дают непосредственно измеренную силу адгезии, позволяют также определить предельную напряженность поля в электроприци-питаторе. В частности, как уже отмечалось выше, отрыв частиц от электродов и, следовательно, эффект, известный как реинфекция (преципитатор становится инфекционным источником), начинает возрастать, когда напряженность поля превышает значение 2,5-105В-м"
1. Кроме того, можно предположить, что это значение должно существенно зависеть как от свойств поверхности осажденных частиц, так и от свойств осадительных поверхностей.
Другим важным аспектом использования полученных результатов является их связь с проблемой отбора проб микроорганизмов с поверхностей. Применение известных методов, в частности контактного метода, основанного на непосредственном соприкосновении питательной среды с поверхностью, использования влажных тампонов или метода репликации с помощью липких пластин или лент можно использовать далеко не всегда. Например, отде-
ление (десорбция) микроорганизмов от стекла требует использования таких специфичных средств, как органические растворители, щелочи или поверхностно-активные вещества [12]. Кроме того, основным недостатком таких операций обычно является неполнота отбора. Электростатические пробоотборники, которые могут быть применены для этой цели, могут быть выполнены как очень простые и высокоэффективные устройства, в особенности, если исследуемые поверхности являются проводящими. В случаях же непроводящих поверхностей для получения представительных проб целесообразно использовать хорошо поляризующиеся (электретные) полимерные пленки.
Литература
I.Schicht H.H. Die Klimaanlage als Streuquelle von Mikroorganismen. Technische Rundschau Sulzer, 1971 , B.53, №3, ss. 201-207;
2.Feldner J., Bredt W., Kahane J. Influence of cell shape and surface charge on attachment of Mycoplasma pneumoniae to glass surfaces. J. Bacteriol., 1983, v.153, №1, pp.1-5;
3.Gerson D.F., Meadows M.G., Finkelman M., Walden D.B. The biophysics of protoplast fusion. Advances protoplast research. Proc. 5th Int. Protoplast Symp., Szeged, 1979. Budapest,1980, pp. 447-456;
4. Коган - Ясный В.В. Коллоидно-химические закономерности адгезии бактерий Methylobacterium or-ganophylum к твердым поверхностям различной природы. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук.
Москва, 1986;
5. Trommler A., Wolf H. Quantitative estimation of adhesion force of human erythrocytes on glass surfaces. Stud. Biophys., 1979, vol.3, №3, pp.233-234;
6.Poortinga A.T., Bos R., Norde W., Busscher H.J. Electric double layer interactions in bacterial adhesion to surfaces. Surface Science Reports 47, 2002, pp.1-32;
7.Maroudas N.J. Adhesion and spreading of cells on the charged surfaces. J. theor. Biol., 1975, v.49, pp. 417424;
8.Зимон А.Д. Адгезия пленок и покрытий. М.: Изд. Химия, 1977, с.4;
9. Фукс Н.А. Механика аэрозолей. М.: Изд. АН СССР, 1955, с.216;
10. Елинсон М.И., Васильев Г.Ф. Автоэлектронная эмиссия. М.: Гос. Изд. Физ.- мат. литературы, 1958;
II.Лебедев Н.Н., Скальская И.П. Сила, действующая на проводящий шарик в поле плоского конденсатора. Ж. Техн. Физики. 1962, т.32, №3. сс.375-378;
12.Звягинцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. М.: Изд. Московского Университета,1973, с.175.
1 Варехов Алексей Григорьевич - кандидат технических наук, доцент кафедры "Экономика природопользования и сервис экосистем" СПбГУСЭ, моб. +7 911 276 5500, e-mail: [email protected]
