CC BY
49
«Теория и практика борьбы с гельминтозами животных». М., -2006.- вып.7 - С. 68-70. 7. Плетнев Н.М. //Там же. -С. 71.
Epizootology peculiarities of Fasciola hepatica infection in buffaloes at plain zone of Kabardino-Balkaria. Usupova Z.H., Bittirova M.I., Shipshev B.M., Bittirov A.M. Kabardino-Balkarian V.M. Kokov State Agricultural Academy.
Summary. F. hepatica infection rates in buffalo youngsters pastured at boggy grasslands were the following: 20,0; 28,6; 40,0 and 58,3% in buffaloes aged 1; 1-2; 2-5 years and elder 5 years respectively at infection intensity values 17; 31,0±9,9; 86,3±9,5 and 114,2±10,6 specimens/animal. Adult buffaloes had the high infection values (infection extensity and infection intensity were 58,3% and 114,2±10,6 specimens/animal respectively).
ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИММУНОБЛОТТИНГА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АНТИГЕННОГО СОСТАВА FASCIOLA HEPATICA L.,1758
Якубовский М.В., Трус И.А., Степанова Е.А.
РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского»,
Республика Беларусь, г. Минск
Введение. Исследования по применению различных иммунологических методов (РИД, ИЭФ, РНГА, РИФ, ВАП, РЛА, РИФ, ИФА и др.) для диагностики фасциолеза сельскохозяйственных животных проводилось в ряде стран [1].
Иммуноблоттинг является высокочувствительным методом диагностики, позволяющим обнаруживать ответ на различные фракции применяемого антигена, делая диагностику более достоверной. Принцип метода состоит в сочетании электрофореза и ИФА [2].
Первое сообщение об использовании иммуноблоттинга в диагностических целях при фасциолезе сделано S. Noemi и G.V. Hillyer. Которые в 1988 году при использовании иммуноблоттинга и ИФА обнаружили наибольшую эффективность диагностики фасциолеза при использовании 30-38 кДа фракции антигенов Fasciola hepatica [5].
Последующие исследования позволили выявить другие белковые фракции, имеющие диагностическое значение при фасциолезе.
По мнению А.С. Бессонова (1967), в связи с тем, что иммунологические реакции при паразитарных болезнях имеют невысокую эффективность, следует применять серию иммунодиагностических методов, отличающихся по своим характеристическим показателям.
Иммуноблоттинг является высокоэффективным методом, что позволяет при его использовании исключить кроссреакции.
Впервые снижение уровня кроссреакций при фасциолезе при использовании иммуноблоттинга установил N. Altinta (1995) [3].
583
K. Kim, H. J. Yang и Y. Chung выделили и очистили белок F.hepatica с молекулярной массой 8 кДа. Полученный белок (фасциолин) не показал кроссреакций с другими трематодозами при диагностике фасциолеза человека [4].
Однако примеры использования иммуноблоттинга в качестве метода, способного эффективно диагностировать фасциолез крупного рогатого скота, в доступной нам литературе, опубликованной в странах СНГ, мы не нашли.
Целью наших исследований являлось использование иммуноблоттинга для определения антигенности различных фракций белков трематоды F. hepatica с сыворотками спонтанно инвазированного крупного рогатого скота.
Материалы и методы. Для постановки иммуноблоттинга первоначально проводили электрофоретическое разделение белков.
Для вертикального электрофореза (SDS-PAGE с диапазоном до 100 кДа) было использовано оборудование BIORAD SE 600 и TrisHCl-полиакриламидный гель с добавлением 12,5% SDS. Сверху над разделяющим был нанесен TrisHQ-полиакриламидный фокусирующий гель. Буферная система была представлена TrisHCl (нижний) и TrisGly (верхний).
-5
Антиген с концентрацией 1,4 мг/см внесли в количестве 10 цл в лунку, сделанную в застывшем фокусирующем геле.
Перед внесением раствор антигена подвергали центрифугированию в течение 5 минут при 21 000g. Далее антиген смешивали с кумасси-Ц250, SDS и подвергали денатурации на водяной бане в течение 15 минут при 100 °C.
После переноса фракций белков на нитроцеллюлозную мембрану инкубировали ее в течение ночи в 3% BSA. Далее подвергли отмыванию TBST и TBS в течение 10 минут каждым.
После этого мембрана была разрезана на полоски и каждая из них была подвергнута инкубированию в сыворотке. В качестве контроля была использована фетальная сыворотка крупного рогатого скота. Полоски отмыли и подвергли полоски инкубированию в пероксидазном антибовисном конъюгате Sigma (1:50 000) в течение 60 минут. После отмывания провели окраску стандартов и осуществили ферментативную реакцию.
Результаты исследований. Выделенные фракции белков, входящие в состав полного антигена, характеризуются молекулярными массами 8, 14,7, 17, 24-29 кДа (рис. 1).
При определении антигенности различных фракций соматического антигена трематоды F. hepatica методом иммуноблоттинга установлен наибольший ответ со стороны спонтанно инвазированного животного на белки с молекулярной массой 8 и 24-29 кДа. Полученные данные свидетельствуют о возможности применения иммуноблоттинга для диагностики фасциолеза.
584
kDa
92
67
43
30
20,1
14,4
1 2
1 - белковые стандарты; 2 -соматический антиген F. hepatica Рис. - Результаты проведения вертикального разрешающего SDS-PAGE электрофореза (инвертированное изображение)
Для проведения иммуноблоттинга требуется не более 10 цл исследуемой сыворотки. Но использование иммуноблоттинга затруднено длительностью постановки реакции, высокой стоимостью расходуемых компонентов, необходимостью в сложном лабораторном оборудовании (оборудование для вертикального электрофореза, оборудование для переноса белков на мембрану и т.д.). Имеющиеся ограничения, присущие иммуноблоттингу, не позволяют рекомендовать этот метод для массовых диагностических исследований.
Заключение. 1.Методом иммуноблоттинга установлен наибольший иммунный ответ со стороны спонтанно инвазированного животного на белки F. hepatica с молекулярной массой 8 и 24-29 кДа. 2.При диагностике фасциолеза с использованием иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа возможно применение полученных белковых фракций F. hepatica.
Литература: 1.Бекиш О.-Я.Л., Бекиш Я.Л. , Бекиш В.Я. Основы
медицинской паразитологии. - Минск.: Университетское, 2001. - 224с. 2.Клименко В.В., Лукеш Ш. //Труды Всес. ин-та гельминтол. - М., 2004. - Т. 40. - С. 125-138. 3.Altinta N. // T. Parazitol. Derg. - 1991. - Vol. 2. - P. 119-129.
4.Kim K., Yang H. J., Chung Y. // Kor. J. Parasitol. - 2003. - Vol. 41, №. 2. - P. 121-123. 5.Noemi S., Hillyer G.V. // J. Parasitol. - 1988. - Vol. 74, № 5. - P. 810818.
Application of immunoblotting for investigation of antigenic composition of F. hepatica L., 1758. Yakubovsky M.V., Trus I.A., Stepanova E.A. S.N. Vishelessky Institute of Experimental Veterinary Medicine, Republic of Byeloruss.
Summary. Using immunoblotting one revealed the highest immune response of an animal with spontaneous infection on F. hepatica proteins with molecular weight of 8 and 24-29 kDa. The obtained protein fractions can be used for diagnosis of F. hepatica infection using immunoblotting and ELISA.
585
