CC BY
109
УДК 543.55:579.222.2
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК КАК ОСНОВЫ ФЕРМЕНТНОГО БИОСЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ
А.С. Илюхина, А.С. Харькова, В.А. Арляпов
Разработана биосенсорная система на основе трех компонентов: глюкозоок-сидазы (фермента, обеспечивающего высокую селективность к глюкозе), поперечно сшитого бычьего сывороточного альбумина и угольно-пастовых электродов, поверхность которых модифицирована карбоксилированными углеродными нанотрубками. Разработанный ферментный биосенсор обладает линейным диапазоном определяемых концентраций глюкозы от 0,2 до 1,0 мМ и может рассматриваться как перспективная система для определения глюкозы.
Ключевые слова: биосенсор, бычий сывороточный альбумин (БСА), карбокси-лированные углеродные нанотрубки
Введение
Современные биосенсоры удовлетворяют большинству требований, предъявляемых к аналитическому оборудованию: они просты в использовании; имеют низкую погрешность измерения (до 5%), не требуют сложной пробоподготовки образцов, экспрессны. Для определения концентрации одного органического вещества или веществ, принадлежащих к одному классу, в сложной смеси используются биосенсоры на основе кислородного электрода Кларка (биосенсоры I поколения); биосенсоры медиаторного типа (II поколение биосенсоров). Однако существуют биосенсоры III поколения, превосходящие их по своим характеристикам за счет осуществления прямого переноса электронов от фермента на электрод [1].
На сегодняшний день актуальным представляется применение углеродных нанотрубок (УНТ) в качестве наноматериала для создания высокочувствительного биосенсора на основе прямого переноса электронов [2]. Кроме того, известны работы, в которых для обеспечения переноса электронов применяются УНТ, модифицированные различными функциональными группами [3]. Особый интерес представляют УНТ, модифицированные карбоксилированными группами, так как они позволяют существенно увеличить скорость гетерогенного переноса электронов [4].
Угольно-пастовые элекроды довольно часто используются для создания биосенсоров [5], а также для исследования свойств биокатализатора на основе модифицированных УНТ и иммобилизованного фермента, так как они отличаются легкостью изготовления, многофункциональностью, низкой себестоимостью.
Цель работы включает разработку и определение характеристик биосенсоров на основе угольно-пастовых электродов с использованием карбоксилированных углеродных нанотрубок (УНТ-СООН) и фермента глюкозооксидазы (ГО), иммобилизованных включением в гель бычьего сывороточного альбумина (БСА).
Материалы и методы
Электроды. Рабочий электрод формировали по методике описанной в работе [6], наполняя приготовленной пастой «графитовая пудра-минеральное масло» пластиковую трубку с внутренней площадью 6,3 мм2). Угольно-пастовые электроды формировали следующим образом: 100 мг графитовой пудры («Fluka», Германия) смешивали с 40 мкл парафинового масла («Fluka», Германия) и полученной пастой заполняли пластиковую трубку измерительного электрода. В качестве электрода сравнения применяли насыщенный хлорид серебряный электрод ЭВЛ-1М4 («Эконикс-эксперт», Россия).
Формирование модифицированного УНТ-СООН/ГО/БСА рабочего электрода. На поверхность рабочего электрода наносили 5 мкл суспензии УНТ-СООН (20 мг/мл), полученных по методике [7] из одностенных углеродных нанотрубок (НПФ «УГЛЕРОД ЧГ», Россия) и оставляли до полного высыхания. Затем наносили слой ферментного препарата. На поверхность рабочего электрода наносили 1 мкл раствора глюкозооксидазы (Sigma-Aldrich, США) с удельной активностью 25 Е/мг. Далее оставляли электрод до полного высыхания при комнатной температуре и затем покрывали гидрогелем поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина. Для его получения в микропробирку помещали 3,5 мг бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich, США), 50 мкл фосфатного буфера (рН=6,8; 33 мМ) и перемешивали с помощью центрифуги/миксера CM70M (ELMI, Латвия). К полученному раствору добавляли 7,5 мкл 25 % раствора глутарового альдегида (Panreac Química S.L.U., Испания). После повторного перемешивания 3 мкл полученной смеси быстро переносили на электрод. Время полимеризации составляло около 30 минут. Модифицированный угольно-пастовый электрод перед использованием промывали в буферном растворе.
Биосенсорные измерения. Измерения выполняли с использованием гальванопотенциостата «IPC-micro» (ООО «НТФ Вольта», Россия). Для регистрации ответов биосенсора применяли двухэлектродную схему. Рабочим электродом служил, описанный выше УНТ-СООН/ГО/БСА электрод, а электродом сравнения - насыщенный хлоридсеребряный. Электроды во время измерения погружали в ячейку с калий-натрий-фосфатным буферным раствором рН=6,8 (20 мМ Na2HPO4 и 20 мМ KH2PO4).
Рабочий потенциал составлял -0,15 В [1]. Температура измерения составляла 20 °C, объем ячейки - 5 см3. После установления стабильного уровня тока в ячейку микропипеткой вводили необходимое для получения заданной концентрации количество глюкозы. После каждого измерения производили промывку ячейки буферным раствором.
Результаты и их обсуждения
Для формирования биорецепторной системы при разработке биосенсора для определения глюкозы были использованы следующие элементы: фермент глюкозооксидаза - фермент, обеспечивающий селективность электрода по отношению к глюкозе; гель поперечно сшитого БСА, который предотвращает вымывание биоматериала, тем самым увеличивают срок эксплуатации рабочих электродов. Важным элементом системы, благодаря которому стал возможен прямой перенос электронов - это углеродные нанотрубки [1]. В данной работе были использованы модифицированные УНТ, наличие карбоксильных групп позволяет повышать скорости передачи электронов на электрод [3].
После формирования рабочего электрода методом циклической вольтамперометрии были исследованы электрохимические свойства кофермента глюкозооксидазы (ФАД) в присутствие УНТ-СООН. На рис. 1 представленна вольтамперограмма исследуемого электрода.
I ии
140
120
100
ВО
60
40
% 20 Е
о »
I—
-20 -40
-во
-S0 -100 -120 -140
-
-ВОО -750 -70G -650 -Б00 -550 -500 -450 -400 -350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 О 50
Потенциал. мЕ
Рис. 1. Вольтамперограмма модифицированного угольно-пастового электрода УНТ-СООН/ГО/БСА. Скорость развертки 100 мВ/с
На данной вольтаперограмме имеется два пика, отвечающих за окислительно-восстановительную реакцию ФАД/ФАДН2 (схема 1).
о о
+2Н +2е
В соответствии с вольтамперограммой, представленной на рис. 1 в качестве рабочего потенциала был выбран потенциал, соответствующий анодному пику -0,37 В. Для определения диапазона определяемых концентраций глюкозы были построены градуировочные зависимости ответа биосенсора на основе модифицированного электрода от концентрации стандартного раствора глюкозы. График зависимости представлен на рис. 2.
<
8 -
cd &
О о
я 4
<D 4 о
н
(U
[3 о
6 -
2 -
Концентрация глюкозы, ммоль/дм3
Рис. 2. Градуировочные зависимости ответов биосенсора от содержания глюкозы в измерительной кювете. Вставка - линейный участок градуировочных зависимостей
Представленная на рис. 2 зависимость ответа сенсора от концентрации глюкозы имеет гиперболический вид и была апроксимированна по уравнению Михаэлиса-Ментен (2).
R max [ S ]
R =
Km + [ S ]
(2),
где Rmax - максимальная скорость ферментативной реакции, достигаемая при Км - эффективная константа Михаэлиса, т.е. концентрация
субстрата, при которой R=Rmax/2.
о
о
2
4
6
8
Из уравнения 2 следует, что при низких концентрациях субстрата аналитический сигнал будет пропорционален концентрации глюкозы, что позволяет выделить линейный участок градуировочной кривой, ограниченный сверху значением Км. Нижнюю границу линейного участка рассчитывали статистическим методом, исходя из критерия относительного стандартного отклонения результатов измерения ^г(С)) < 0,33. Полученный диапазон определяемых концентраций глюкозы, а также диапазоны определяемых концентраций других систем представлены в таблице.
Линейный диапазон ферментных биосенсоров для определения глюкозы
Матрицы для иммобилизации Глюкозоокисдазы Диапазон, мМ Ссылка
Углеродные карбоксилированные нанотрубки/поперечно сшитый бычий сывороточный альбумин 0,2-1,0 Данная работа
Ферроцен/ поперечно сшитый бычий сывороточный альбумин 0,5-2,5 [8]
Гидрогель модифицированного ферроценкарбоксальдегидом хитазана 2-16 [9]
Ферроцен, хитазан, золь-гель на основе метилтриметоксисилана 2-21 [10]
УНТ/ гидрогель модифицированного пентацианоферратом (III) калия хитозана 0,8-4,0 [11]
Как следует из таблицы, нижняя граница определяемых концентраций глюкозы составляет 0,2 мМ, что в два раза ниже, чем у биосенсора, несодержащего наноматериал. Кроме того по значению нижней границы определяемых концентраций разработанная система превосходит известные аналоги, например, на основе ковалентно связанного ферроцена (нижняя граница 2 мМ) [9] и биосенсора на основе модифицированного ферроценом композита на основе полисилоксана и хитозана (1,0-6,0 мМ) [10]. Высокие характеристики были достигнуты за счет введения в систему карбоксилированных углеродных нанотрубок. Например, в работе [11] значения нижней границы определяемых концентрации отличаются в 2 раза по сравнению с системами немодифицированными наноматреиалом.
Выводы
Разработана безреагентная биосенсорная система для определения глюкозы, основанная на интеграции фермента глюкозооксидазы, обеспечивающего селективность биосенсора к глюкозе, поперечно сшитого бычьего сывороточного альбумина (матрица, позволяющая
удержать биоматериал на поверхности электрода) и угольно-пастовых электродов, поверхность которых модифицирована карбоксилированными углеродными нанотрубками. Нижняя граница определяемых концентраций разработанного биосенсора 0,2 мМ, что превосходит нижние границы известных аналогов. Введение карбокислированных нанотрубок в состав биораспознающей системы позволило увеличить чувствительность определения глюкозы за счет снижения нижней границы определяемых концентраций.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ и Правительства Тульской области № 16-48-710959 р_а (договор ДС/44).
Список литературы
1. Rafighi P., Tavahodi M., Haghighi B. Fabrication of a third-generation glucose biosensor using graphene-polyethyleneimine-gold nanoparticles hybrid //Sensors and Actuators B: Chemical. 2016. V. 232. P. 454461.
2. Enzymatic Electrochemical Biosensor Based on Multiwall Carbon Nanotubes and Cerium Dioxide Nanoparticles for Rutin Detection / S. R. Benjamin, R.S. Vilela, H.S. Camargo et al. //Int. J. Electrochem. Sci. 2018. V. 13. P. 563-586.
3. Carboxylated multiwalled carbon nanotubes based biosensor for aflatoxin detection / C. Singh, S. Srivastava, M. Ali et al //Sensors and Actuators B: Chemical. 2013. V. 185. P. 258-264.
4. Pumera M., Sasaki T., Iwai H. Relationship between carbon nanotube structure and electrochemical behavior: heterogeneous electron transfer at electrochemically activated carbon nanotubes //Chemistry-An Asian Journal. 2008. V. 3. № 12. P. 2046-2055.
5. Carbon paste electrode based on functional GOx/silica-lignin system to prepare an amperometric glucose biosensor / A. J^drzak, T. R^bis, L. Klapiszewski et al //Sensors and Actuators B: Chemical. 2018. V. 256. P. 176185.
6. Зайцева А. С., Арляпов В. А., Решетилов А. Н. Медиаторный биосенсор на основе микроорганизмов активного ила для экспресс-определения низких значений БПК5 // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2017. Т. 13. №. 1. С. 50-57.
7. Preparation and modification of carbon nanotubes /D. Zhang, L. Shi, J. Fang et al. //Materials Letters. 2005. V. 59. №. 29-30. P. 4044-4047.
8. Латунина Л. С., Каманин С. С., Арляпов В. А. Ферментные биосенсоры для определения глюкозы, молочной кислоты и крахмала на основе модифицированных печатных электродов // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2017. №. 1. C. 67-75.
9. Chitosan-ferrocene film as a platform for flow injection analysis applications of glucose oxidase and Gluconobacter oxydans biosensors / O. Yilmaz, D. Demirkol, S. Gulcemal et al. // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2012. V. 100. P. 62-68.
10. Chen X., Jia J., Dong S. Organically Modified Sol-Gel/Chitosan Composite Based Glucose Biosensor //Electroanalysis. 2003. V. 15. № 7. P. 608-612.
11. Carbon nanotubes/pentacyaneferrate-modified chitosan nanocomposites platforms for reagentless glucose biosensing/ A. Parra-Alfambra, E. Casero, M. Ruiz et al. //Analytical and bioanalytical chemistry. -2011. V. 401. № 3. P. 883-889.
Илюхина Анастасия Сергеевна, магистрант, ilyuhina.nastyaaimail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Харькова Анна Сергеевна, аспирант, Anyuta Zaytsevaamail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Арляпов Вячеслав Алексеевич, канд. хим. наук, доцент кафедры химии, v.a. arlyapovaigmaiL com, Россия, Тула, Тульский государственный университет
USING OF CARBON NANOTUBES AS A BASIS OF ENZYME BIOSENSOR
FOR GLUCOSE DETERMINATION
A.S. Ilyukhina, A.S. Kharkova, V.A. Arlyapov
A biosensor system based on three components: glucose oxidase (enzyme providing high selectivity to glucose), cross-linked bovine serum albumin and carbon-paste electrodes, modified by carboxylated carbon nanotubes, was developed. The enzyme biosensor has a linear range of detectable glucose concentrations from 0.2 to 1.0 mM and can be considered as a promising system for determining glucose.
Key words: mediator biosensor, "ping-pong" mechanism, yeast Debaryamyces han-
senii
Ilyukhina Anastasia Sergeevna, student, ilyuhina. nastyaaimail. ru, Russia, Tula, Tula State University,
Kharkova Anna Sergeevna, post-graduate student, Anyuta ZaytsevaaimaiLru, Russia, Tula, Tula State University,
Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, candidate of chemical sciences, associate professor, v. a. arlyapov'gmail. com, Russia, Tula, Tula State University
