CC BY
273
Использование цитохимических методов для определения фагоцитарной активности клеток крови и гемолимфы разных видов гидробионтов для оценки состояния их здоровья
Г.И. Пронина, к.в.н., ГНУ ВНИИР Россельхозакадемии
Развитие АПК невозможно без сохранения здоровья маточных стад. Первой задачей на этом пути является оценка состояния животных.
Цель исследования: выделить оптимальные показатели, позволяющие оценивать состояние здоровья гидробионтов. Это необходимо как для культивирования, так и для разведения рыб и речных раков, являющихся ценными объектами аквакультуры.
Цитохимические исследования проводят в мазках крови, лейкоконцентрата; они основаны на использовании специфических химических реакций для определения в клетках различных веществ. Эти исследования позволяют изучать локализацию и ориентировочно оценивать количество определяемых веществ в различных клеточных элементах. Цитохимические исследования относительно несложны, дают возможность исследовать различные виды лейкоцитов.
При цитохимическом исследовании чаще пользуются полуколичественной оценкой результатов, применяя принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски. В зависимости от нее исследуемые элементы делят на 4 группы: с отрицательной реакцией (—), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по указанному принципу, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумма этих произведений составляет условные единицы. Например, при исследовании активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток в 60 клетках активность фермента не выявлена (—), в 35 — специфическая окраска была слабой (+) и в 5 — более интенсивной (++). Результат определения активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах в таком случае составит (60 ■ 0)+(35 ■ 1)+(5 ■ 2) = 0+35+10 = 45 ед. Можно выразить результат в виде среднего цитохимического показателя по L. Kaplow (1955) или среднего цитохимического коэффициента (СЦК). С этой целью также дифференцируют 100 исследуемых клеток по указанной выше системе. Полученный процент клеток в каждой группе умножают на соответствующее данной группе число
плюсов. Сумма этих величин, деленная на 100, представляет собой СЦК для одной клетки. В указанном примере СЦК щелочной фосфата-зы нейтрофилов равен 0,45. В тех случаях, когда изучаемые вещества локализуются в клетках в виде единичных гранул (например, активность неспецифической эстеразы в лимфоцитах и др.), результат цитохимической реакции целесообразно выражать в процентах клеток, дающих положительную реакцию.
Метод полуколичественной оценки является ориентировочным, но позволяет сравнивать распределение исследуемых веществ в разных клеточных элементах или в одних и тех же клетках при различных патологических состояниях организма, а также в зависимости от течения заболевания, степени его тяжести и в связи с проводимой терапией [1, 2].
Е.А. Заботкина [3] отмечает различия фагоцитарной активности лейкоцитов разных видов рыб (использовался НСТ-тест с нитросиним тетразо-лием).
Неферментный катионный белок положительно заряжен, локализуется в лизосомах грануло-цитов и играет важную роль в реализации фагоцитарной функции клеток. При цитохимическом исследовании катионных белков используют методы, основанные на применении диахромных анионных красителей.
Стандартная относительная ошибка для группы здоровых людей составляет 5,2%. В норме в нейтрофилах 123±1,5 ед. или СЦК 1,23+0,015, при этом не наблюдается различий у мужчин и женщин [4].
Снижение катионного белка в нейтрофилах характерно для острого воспалительного процесса; наблюдается в разгаре различных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии. Период выздоровления сопровождается нормализацией показателя. Изменения содержания лизосомального катионного белка коррелируют со степенью тяжести заболевания [5, 6].
Объектами нашего изучения являлись речные раки Astacus astacus старше 3-лет, близкие по размерно-весовым характеристикам (табл.) и рыбы (годовики линейного карпа Cyprinus carpió L). Как показали исследования гемолимфы речных раков (Astacus astacus), фагоцитарной активностью обладают полугранулоциты и агранулоциты, в которых наблюдается выпадение гранул катионно-
Рис. 1, 2, 3 - В клетках видны окрашенные гранулы катионного белка: 1 - агранулоцит, 2 - полугранулоцит
Рис. 4 - Пятна РПЗ на дорсальной стороне абдомена у самца Astacus astacus
¿X* ' •
Рис. 5, 6 и 7 - Гифы и зооспорангии Saprolegnia parasitica, выделенные из пораженной ткани речного рака
го лизосомального белка (рис. 1, 2, 3). В предыдущих экспериментах по изучению поглощения клетками гемолимфы речных раков Pontastacus Leptodactylus частиц китайской черной туши in vitro также отмечалось, что полугранулоциты способны к фагоцитозу [7]. Данному исследованию подвергались особи здоровые и пораженные грибком ржавопятнистой болезни (РПЗ) (рис. 4).
Методы исследования. Наличие гифов и зооспорангий возбудителя (Saprolegnia parasitica)
(рис. 5, 6, 7) определяли путем микроскопирова-ния препаратов из пораженной ткани [8], предварительно выдержанных в течение 5 минут в 5%-ном растворе соляной кислоты [9]. Катионный белок определяли по М.Г. Шубичу. Принцип метода: избирательная окраска катионного белка бромфеноловым синим [6].
Результаты исследования. У раков, пораженных ржавопятнистой болезнью, показатель содержания катионного белка фагоцитов (СЦК) был
Физиолого-иммунологические показатели речных раков
Показатели Здоровые особи Пораженные РПЗ Достоверность Р
Вес раков 21,2±0,2 20,3±1,1 >0,05
Длина тела 87,5±0,71 88,0±1,41 >0,05
РН гемолимфы 4,8±0,35 5,5±0,1 >0,05
Время свертывания гемолимфы 3,0±0,1 2,5±0,7 >0,05
Общее число гемоцитов 363±302 453±238 >0,05
СЦК 0,87±0,123 1,62±0,120 <0,05
Гемоцитарная формула
Агранулоциты 31±1,2 27±8,5 >0,05
Полугранулоциты 31±19,8 34±8,1 >0,05
Г ранулоциты 30±11,3 37±5,7 >0,05
Прозрачная клетка 9±8,5 3±1,4 >0,05
Рис. 8, 9 - Окрашенные гранулы катионного белка в клетках крови годовиков карпа (Cyprínus carpió L)
достоверно выше, чем у здоровых особей (табл.). Можно предположить, что иммунная система раков при воздействии чужеродных агентов (в данном случае возбудителя РПЗ) включается вся и сразу. Большая часть клеток: агранулоциты и полугранулоциты, составляющие вместе более 60% всех циркулирующих в гемолимфе клеток, фагоцитируют. Другими словами, у речных раков фагоцитарная система, как эволюционно наиболее древняя, быстро активируется и работает в большинстве клеток гемолимфы при вторжении патогена. Общее число гемоцитов (ОЧГ), гемоци-тарная формула, РН и время свертывания гемолимфы у пораженных и здоровых особей достоверно не различались. Более информативным в данном случае оказался цитохимический показатель, характеризующий фагоцитарную активность клеток.
У самки Astacus astacus СЦК был несколько выше, чем у самцов, но данное отличие нельзя считать достоверным из-за малой выборки. В данном направлении работы продолжаются.
На препаратах, приготовленных из периферической крови годовиков линейного карпа (Cyprinus carpió L.), также наблюдались окрашенные гранулы катионного белка в нейтрофилах, макрофагах крови и, в единичных случаях, в эритроцитах (рис. 8, 9). Следовательно, эти клетки обладают способностью к фагоцитозу. СЦК содержания катионного белка годовиков карпа в нашем эксперименте составлял: 1,14± 0,078 (Су — 9,74).
Таким образом, показатель содержания лизо-сомального катионного белка в фагоцитах целесообразно использовать для оценки состояния здоровья гидробионтов (речных раков и рыб). Проблема определения физиологической нормы по данному показателю (средний цитохимический коэффициент) для разных видов гидробионтов требует дальнейшего изучения.
Литература
1. Мазинг, Ю.А. Лаб. дело / Ю.А. Мазинг, И.Я. Старосельская // 1981. № 10. С. 582-584.
2. Astaldi G., Verga L. Acta haematol., 1957, vol. 17, p. 129-136; Kaplow L. Blood, 1955, vol. 10, № 10, p. 1023-1029.
3. Заботкина, Е.А. Особенности функциональной активности лейкоцитов периферической крови костистых рыб // Расширенные материалы Международной научно-практической конференции: «Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов». Борок, 2007. С. 23-26.
4. Нагоев, Б.С. Катионный белок лейкоцитов и его значение: методические указания. Нальчик, 1982. 67 с.
5. Пигаревский, В.Е. Лаб. дело / В.Е. Пигаревский, Ю.А. Ма-зинг. 1981. № 10. С. 579-582.
6. Шубич, М.Г. Цитология, 1974. № 10. С. 1321-1322.
7. Пронина, Г.И. Повышение иммунофизиологического статуса ракообразных - основа эффективности раководства. // Рациональное использование пресноводных экосистем - перспективное направление реализации национального проекта «Развитие АПК»: межд. науч.-практ. конф. М., 2007. С. 418-421.
8. Конопаткин, А.А. Эпизоотология и инфекционные болезни сельскохозяйственных животных / А.А. Конопаткин, И.А. Конопаткина. М.: Колос, 1984. С. 534.
9. Александрова, Е.Н. Микологическое исследование поражений внешних покровов речных раков ГНУ ВНИИ ирригационного рыбоводства, пос. им. Воровского, Ногинский район, Московская область. Россия / Е.Н. Александрова, Г.И. Пронина, Н.Ю. Корягина // Мат. межд. науч.-практ. конф. 23-27 августа 2004 г., Мн., 2004.
