CC BY
14Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология» Том 16 (55) Xs2 (2003) 171-175.
УДК: 582.594.2:581,143.6
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНИКИ IN VITRO ДЛЯ РАЗМНОЖЕНИЯ НЕКОТОРЫХ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ РАСТЕНИЙ ФЛОРЫ КРЫМА
Скляренко Д.А., Буг ар a A.M.
Актуальность
Охрана редких видов растений - одно из основных направлений сохранения биологического разнообразия природы в целом. В настоящее время численность растений в природе неуклонно сокращается главным образом из-за хозяйственной деятельности человека - распашки земель, вырубки лесов, мелиорации, промышленных и сельскохозяйственных загрязнений [2,5,8J.
В условиях нарастающего антропогенного воздействия наиболее чувствительными к нему становятся редкие эндемичные и малочисленные виды, что обусловлено их эколого-биологическими и ценотическими особенностями [3,5]. Сегодня на Крымском полуострове наблюдаются самые высокие в Украине темпы генетической эрозии. Так, за последние десятилетия флора Крыма потеряла 31, а по другим оценкам -.39 видов, причем 21 из них придется вычеркнуть и из флоры Украины [5].
Чтобы остановить надвигающуюся экологическую катастрофу, в первую очередь необходимы меры, направленные на защиту природы от загрязнения и вредных воздействий на места обитания представителей различных видов, разработка национальных программ сохранения флоры, организация флористических заказников и биосферных заповедников [8].
Однако для того, чтобы сохранить некоторые виды растений, уже недостаточно охранных мероприятий, а необходимы меры по их защите и восстановлению, такие как разведение видов под контролем человека, создание клеточных коллекций и генных банков (2,9,10].
Используя свойство тотиполетности растительных клеток — явление, когда практически любая растительная клетка способна в определенных условиях и на соответствующих питательных средах регенерировать полноценные растения, - можно создавать и длительно поддерживать коллекции растительных клеток и тканей [1,2,4].
Метод микроклонального размножения in vitro уже играет важную роль для ускоренного клонирования плодовых, ягодных, клубнеплодных, декоративных видов растений и древесных пород, но также может быть применен и к дикорастущим видам, нуждающимся в охране [1,2,4,10].
Получение культуры in vitro, а в дальнейшем растений-регенерантов редких и исчезающих видов флоры Крыма позволит сохранить имеющийся генофонд растений и решить проблему сокращения биоразнообразия, а также восполнить растительные ресурсы тиражированием редких и исчезающих видов в результате клонагтьного микроразмножения и возврата их в природу или коллекции ботанических садов [6,9,11 ]-
Целью данной работы была разработка оптимальных способов культивирования и размножения в условиях in vitro некоторых редких и исчезающих растений флоры Крыма с целью последующей репатриации полученных растений в естественные биоценозы.
Материалы и методы
Материалом для исследований служили ткани и органы растений Crataegus pojarkovae Kossych, Onobrichis pallasii (Bieb.) Willd, а также Sorbus domestica L, произрастающих в естественных фитоценозах.
Crataegus pojarkovae - исчезающий реликтовый эндемик третичного периода из семейства Rosaceae, занесенный в "Европейский Красный список животных и растений, находящихся под угрозой исчезновения" (1991) и "Красную книгу Украины" (1996). Большая научная и практическая ценность Crataegus pojarkovae обусловливается его реликтовостью и эндемичноегью, ограниченной численностью особей в популяции, целебными и пищевкусовыми качествами его плодов, большой засухоустойчивостью, кальцефильностью и большими декоративными достоинствами.
В настоящее время на Крымском полуострове несколько представителей рода Sorbus являются редкими или исчезающими [5J. В первую очередь это относится к видам Sorbus roopiana и S. Pseudolatifolia. В качестве модельного объекта в настоящей работе использовали вид Sorbus domestica.
Onobrichispallasii -эндем Крыма, реликт третичного времени. Местонахождения его часто страдают из-за хозяйственной деятельности человека, растение нуждается в охране, поэтому стоит вопрос о сохранении данног о вида и разработке различных мероприятий по его охране и размножению. Материалом для проведения исследований служили растения Onobrichis pallasii, произрастающие на меловых склонах в западной части г. Симферополя.
Для проведения исследований по микроразмножению in vitro Crataegus pojarkovae и Sorbus domestica, а также эмбриокультуре Onobrichis pallasii использовали методы, общепринятые в исследованиях по культуре тканей растений [4]. В качестве инициальных зкеплантов Crataegus pojarkovae и Sorbus domestica использовали вегетативные почки и апикальные меристемы. С целью получения асептической культуры клеток почки поверхностно стерилизовали в 100% растворе препарата "Брадофен" с последующей промывкой в стерильной дистиллированной воде. Апикальные меристемы извлекали с помощью препаравальных игл и скальпеля под микроскопом МБС-10 и эксплантировали на поверхность агаризованной
172
Скляренко Д.А., Бугара A.M.
питательной среды Мурасиге — Скуга, дополненной фитогормонами. Асептическая культура семен Onobrichispallasii была получена путем поверхностной стерилизации в 70% растворе спирта и последующим промыванием в стерильной дистиллированной воде. Культивирование проводили в химических пробирках с 10 мл питательной среды. Культуральные сосуды помещали в условия термостатированного помещения (+26 = +28°€), с относительной влажностью воздуха 60 - 70% и освещенностью 3000 - 4000 люкс.
Результаты и обсуждение
Установлено, что для пролиферации эксплантов Crataegus pojarkovae оптимальными являлись модифицированные питательные среды Мурасиге-Скуга, дополненные различными концентрациями фитогормонов. Наилучшие результаты были получены на среде, содержащей кинетин - 0,5 мг/л, 6-бензиламинопурин (6-БАП) -0,5 мг/л и нафтилуксусную кислоту (НУК) - 0,1 мг/л. На средах, содержащих только и идол илу ксу сную кислоту (ИУК) в концентрации от 0,5 до 1 мг/л и 6-БАП в концентрации от 1,0 до 1,5 мг/л были также получены положительные результаты, однако с более низким процентом активно развивающихся почек (табл. 1).
В большинстве случаев пролиферация вегетативных почек и меристем наблюдалась через 14-36 дней после посадки на питательную среду.
Таблица I
Влияние ратшчиых фитогормонов и их концентраций на пролиферацию почек Crataegus
pojarkovae в условиях in vitro
№ Содержание фитогормонов, мг/л Количество
варианта Кинетин 1 НУК ИУК i ' 6-БАП пролиферирующих почек на 14-16 дни культив иро ван ия,(%)
i. 0,5 1 0,1 ¡ - 0,5 100,0%
" 2" - - 1 1,0 64,7%
3 - i - 1,0 1,5 42,5%
Внесение более высоких концентраций фитогормонов приводило к изменению направленности процесса развития экспланта и образованию каллуса.
В результате проведенных исследований были получены микропобеги Crataegus pojarkovae.
В процессе культивирования изолированных меристем Sorbus domestica было обнаружено, что пролиферация почек быстрее всего (на 12 - 14 дни культивирования) происходила на жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей ИУК в концентрации I мг/л и 6-БАП- в концентрации 2 мг/л. После 20 дней культивирования произвели пересадку почек, имеющих 2-3 пары хорошо развитых листьев, на
питательную среду, содержащую ИМК (2 мг/л) и 6-БАП (1 мг/л). При этом на местах раневых срезов начинал формироваться каллус и происходило образование новых микропобегов.
В результате проведенных исследований по клональному микроразмножению в условиях in vitro получены микропобеги Sorbus domestica, а также редкого эндемичного растения Crataegus pojar ka г ас, В настоящее время проводятся исследования по подбору оптимального соотношения фитогормонов для дальнейшего субкультивирования и укоренения полученных микропобегов.
Изолированные зародыши Onobrichis pallasii эксплантировали на поверхность агаризованной питательной среды Уайта, не содержащей фитогормоны и дополненной 6-БАП (1,0 мг/л) и ИУК (0,5 мг/л).
При эксплантации зародышей на питательную среду первые признаки развития обнаруживались уже через один день культивирования. Зародыши набухали, увеличивались в размерах, наблюдался активный рост главного корня. На третьи сутки были окончательно сформированы и раскрыть! семядольные листья. Появление первой пары настоящих листьев отмечалось на пятый день культивирования. На 7 - 10 день проростки имели развитый стебель с двумя парами настоящих листьев и хорошо ветвящийся главный корень (табл.2).
Таблица 2
Влияние фитогормонов па основные показатепи роста Onobrichis pallasii после трех недель
культивирования в условиях in vitro
№ варианта Содержание Длина корня фитогормонов, мг/л сеянцев, см 6-БАП ИУК Высота микропобега с тремя парами листьев, см
1 ! - 1 7,0-11.5 5,0-6,8
2 1,0 Í 0,5 5,0-6,5 4,5-5,6
В зависимости от варианта опыта наблюдались некоторые различия в длине корня, его разветвленности, высоте микропобега. На среде, содержащей 6-БАП и ИУК, формировались короткие и утолщенные корни, значительно замедлялось образование боковых корней. На среде без фитогормонов рост корня и формирование боковых корешков происходило быстрее, однако они становились более тонкими и хрупкими.
Через три недели культивирования зародышей были получены проростки с двумя -тремя парами настоящих листьев и хорошо развитой корневой системой. Полученные сеянцы были успешно пересажены в субстрат, и в настоящее время проводятся работы по подготовке полученных in vitro растений для репатриации в естественные фитоценозы, что позволит создать искусственные популяции Onobrichis pallasii и изучить особенности адаптации растений к естественным условиям обитания.
174
Скляренко Д.А., Бугара A.M.
Изложенные результаты дают возможность говорить о целесообразности разработки биотехнологических, методов для размножения редких и эндемичных растений флоры Крыма, Биотехнологические методы культуры тканей in vitro открывают большие перспективы рационального ресурсопользования редких, исчезающих и хозяйственно-ценных видов растений, а также интродукции их в естественные фитоценозы. Дальнейшая перспектива таких исследований видится в создании генетического банка клеточных культур с целью сохранения генофонда исчезающих видов. По мере разработки методов восстановления природных экосистем эти банки будут использованы для реинтродукции типичных растений в природные местообитания.
Список литературы
1. Атанасов А.И. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск, 1993. - 242с.
2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе: Учеб. пособие. - М: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.
3. Ема А.В. Эндемики во флоре Крыма //Вопросы развития Крыма: Научно-практический дискуссионно-аналитический сборник. Выпуск I: Биологическое и ландшафтное разнообразие Крыма: проблемы и перспективы. Ред. А.А. Прусаков. - Симферополь: "Сонат", 1999. -С. 65 - 68.
4. Калинин Ф,Л.„ Сарнацкая В.В., Полищук В.Ё. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - Киев: Наукова думка, 1980, - 488с.
5. Вопросы развития Крыма: Научно-практический дискуссионно-аналитический сборник. Выпуск 13. Материалы к Красной книге Крыма. Симферополь: "Таврия-плюс", 1999.-С.8
9. '
6. Попкова J1JL, Тешпшкая Л.М. Перспективы сохранения редких растений флоры Крыма// Мат.Х! съезда Укр. ботан. общества. - Харьков, 2001. - С.302 -- 303.
7. Попкова Л.Л. Сохранение редкого крымского эндемика Crataegus pojarkovae Kossych методом размножения в условиях in vitro // Заповедники Крыма. Материалы II научной конф.-Симферополь, 2002.-С. 191 -193.
8. Редкие и исчезающие растения и животные Украины: Справ, -Чопик В.И., Щербак Н,Н„ Ардамаикая Т.Е. и др. - Киев: Наук, думка, 3 988. - 256 с.
9 Скляренко Д.А. Пути сохранения и зашиты исчезающих видов растений флоры Крыма // В!сник Харювського аграрного ушверситету im, В.В.Докучаева.-2002.-№4. - С. 154 - 115,
10. Kotkas К., Vasar V,, Vaasa A, The application of biotechnological methods on preservation of plant biological diversity in Estonia//Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources. - Yalta, 2002. - P, 58 - 59.
11. Teplitskaya L.M. Cloning methods development for rare and vanishing plants of Crimean flora / / Euro conference "Modem Analytical Methods for Food and Beverage Authentification" Lednice, Czech republic, 2002.-P.31
Поступила в редакцию 7.03.2003 г.
