CC BY
20
Булдаков И. А.1, Полушкина Л. Б.1, Шуваев В. А.1, Самородова А. П.1, Фоминых М. С.14, Бессмельцев С. С.1, Чечеткин А. В.1, Волошин С. В12 3, Мартынкевич И. С.1
1 ФГБУ Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА, Санкт-Петербург
2 ФГБВОУ ВО Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова МО РФ, Санкт-Петербург
3 ФГБОУ ВО Северо-Западный государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова МЗ РФ, Санкт-Петербург
4 ФГБОУ ВО Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СЕКВЕНИРОВАНИЯ СЛЕДУЮЩЕГО ПОКОЛЕНИЯ (NGS) ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПАЦИЕНТОВ С МИЕЛОИДНЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ
Buldakov I. A.1, Polushkina L. B.1, Shuvaev V. A.1, Samorodova A. P.1, Fominykh M. S14, Bessmeltsev S. S.1, Chechetkin A. V.1, Voloshin S. V.1,2 3, Martinkevich I. S.1
1 Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology, Saint-Petersburg
2 Military Medical Academy named after S. M. Kirova, Saint-Petersburg
3 North-West State Medical University named after 1.1. Mechnikov, Saint-Petersburg
4 Saint-Petersburg State University, Saint-Petersburg
USE OF THE NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS) FOR THE DIAGNOSTICS OF PATIENTS WITH MYELOID NEOPLASMS
Резюме. Стремительное развитие технологии NGS существенно расширило рамки представлений о патогенезе миелоидных новообразований. Помимо стандартных цито-генетических и молекулярно-генетических исследований метод NGS все чаще входит в рутинную практику при диагностике миелоидных новообразований, при прогнозировании течения заболевания, а также при выборе таргетной терапии. В данной работе в рамках рутинной лабораторной практики были проанализированы результаты NGS исследования панели генов у 21 пациента с различными типами и фазами миелоидных новообразований. У каждого пациента было показано наличие тех или иных генетических аберраций, количество которых варьировало от 4 до 12. У 6 из 9 пациентов с обнаруженными 2 и более клинически значимыми мутациями в анамнезе наблюдалась бластная трансформация. У пациентов с драйверными мутациями бластной трансформации сопутствовали дополнительные мутации в генах, ответственных за эпигенетическую регуляцию, а у тринегативных пациентов по драйверным мутациям — в генах, ответственных за передачу сигнала. Результаты секвенирования панели генов методом NGS позволяют не только достоверно установить диагноз, определить прогностические особенности течения заболевания, но и, благодаря накоплению и систематизации данных, обнаружению новых мутаций, способствуют более глубокому пониманию патогенеза миелоидных новообразований.
Abstract. The rapid development of NGS technology has significantly expanded the understanding of the pathogenesis of myeloid neoplasms. In addition to standard cytogenetic and molecular genetic studies, the NGS method is increasingly entering into routine practice for diagnostics of myeloid neoplasms, for predicting prognosis, and also for choosing targeted therapy. In this work, we analyzed the NGS results of the gene panel study for 21 patients with various types and phases of myeloid neoplasms. The presence of certain genetic aberrations varied from 4 to 12 per patient was shown. 6 from 9 patients with detected 2 or more clinically significant mutations, had a blast transformation in the anamnesis. The patients with driver mutations had blast transformation in presence additional mutations in the genes responsible for epigenetic regulation and three negatives for driver mutations patients had blast transformation in presence additional mutations in the genes responsible for signal transduction. The results of sequencing the gene panel by the NGS method can reliably help to diagnose, to determine the prognostic features of the disease, and through the accumulation and systematization of data, the detection of new mutations, to contribute to a better understanding of the pathogenesis of myeloid neoplasms.
Key words. Мyeloproliferative neoplasms (MPN), next-generation sequencing, NGS, mutations, prognosis.
^ючевые слова. Миелопролиферативные новообразования, секвенирование следующего поколения, мутации, прогноз
Введение. Миелопролиферативные новообразования (МПН) — группа гематологических заболеваний клональной природы, характеризующихся чрезмерной пролиферацией клеток миелоидного происхождения. Генетический профиль МПН зачастую очень гетерогенен и соответствующие ему системы стратификации по степени молекулярного риска постоянно дополняются. По наличию высокоспецифической для ХМЛ характерной транслокации t(9;22) (филадельфийской хромосомы Ph) принято выделять Ph+ и Ph- МПН. Для большинства случаев Ph- МПН (эссенциальная тромбоците-мия — ЭТ, истинная полицитемия — ИП и первичный миелофиброз — ПМФ) характерны драйверные соматические мутации, возникающие в гемопоэтических стволовых клетках и активирующие JAK2-STAT сигнальный путь (JAK2, CALR, MPL) [1, 6, 9]. Помимо драйверных мутаций у многих пациентов с МПН обнаруживаются генетические аберрации в генах, ответственных за метилирование ДНК (TET2, IDH1, IDH2, DNMT3A), модификацию хроматина (ASXL1, EZH2, KMT2A, SUZ12), сплайсинг (SRSF2, U2AF1, SF3B1, ZRSR2), передачу сигнала (FLT3, KIT, NF1, CSF3R, LNK, SH2B3, CBL, NRAS, KRAS, PTPN11, BRAF, GNAS, STAT3, STAT5B, PDGFRA, PDGFRB), в генах клеточного цикла (TP53, WT1, NPM1), в транскрипционных факторах (RUNX1, CEBPA, SETBP1, BCOR, ETV6, PHF6, GATA2) и в генах комплекса когезии (STAG2, SMC1A, SMC3, RAD21) [1, 5, 6, 7, 8, 9, 10]. Так, для пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) важно определение мутационного статуса генов ASXL1, CEBPA, DNMT3A, FLT3, IDH1 /2, KIT, KMT2A, NPM1, RUNX1, TET2, TP53 и WT1; для пациентов с миелодиспластическим синдромом (МДС) — ASXL1, DNMT3A, EZH2, RUNX1, SRSF2, TET2, TP53 и U2AF1; для пациентов с хроническим миеломоноцитарным лейкозом (ХММЛ) — ASXL1, CBL, EZH2, NRAS /KRAS, RUNX1, SETBP1, SRSF2 и TET2 [3, 4, 6, 7, 8]. Определение мутационного статуса генов в каждом конкретном случае МПН важно не только при постановке диагноза и прогнозировании течения заболевания, но и при выборе наиболее эффективной таргетной терапии (ингибиторы IDH1, FLT3), выборе маркера мониторинга минимальной остаточной болезни [2]. Поэтому в рекоменда-
ции ВОЗ, помимо стандартных цитологических (клинический анализ крови и исследование миелограммы) и цитогенетических методов исследования (кариотипирование, fluorescent hybridization in situ FISH), включены методы определения мутационного статуса характерных для той или иной нозологии генов [6]. Наиболее перспективным из них является метод высокопроизводительного секвенирования следующего поколения NGS (next generation sequencing), который позволяет анализировать одновременно целый ряд генов (панели генов), участвующих в патогенезе МПН.
Результаты NGS исследования помогают не только подтвердить клональность в сложных диагностических случаях, у пациентов с нормальным кариотипом, но и стратифицировать пациентов на группы риска [1, 3, 4]. Также стоит отметить, что чувствительность секвенирования по Сэнгеру ограничена 10 % аллельной нагрузкой (VAF, variant allele frequency) и не всегда позволяет обнаружить мутации [1, 9]. При этом на порядок выше разрешающая чувствительность NGS метода (до 1 % VAF) способствует обнаружению мутаций не только de novo, но и, сопутствующих основным, мутаций с низкой аллельной нагрузкой, характеризующих клональную эволюцию заболевания и влияющих тем самым на прогноз течения заболевания [13]. Таким образом, исследование таргетных панелей генов методом NGS позволяет получить наиболее полную информацию о заболевании, которая способствует не только адекватной диагностике миелоидных новообразований, но и определяет прогностические особенности течения заболевания.
Цель исследования. Оценить возможности использования NGS технологии в диагностике и определении прогноза течения заболевания у пациентов с различными вариантами миелоидных новообразований в рамках рутинной лабораторной практики.
Материалы и методы. Проведено исследование у 21 пациента (9 мужчин и 12 женщин) в возрасте от 36 до 79 лет (медиана Me = 55 лет). Диагноз миелопролиферативных новообразований, не ассоциированных с филадельфийской хромосомой (Ph- МПН), был установлен у 18 больных (в том числе у 5 — в фазе бласт-
ной трансформации), миелодиспластических синдромов (МДС) — у 2, первичный острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) — у 1 пациента. Исследование проводилось с целью установления клональной природы заболевания у 12 больных без драйверных мутаций в генах JAK2, CALR, MPL, у остальных — для выявления дополнительных прогностически значимых генетических аберраций. У всех пациентов сек-венирование выполнялось с использованием миелоидной панели из 55 генов со средней глубиной прочтения 200х или 1000х на приборе MiSeq (Illumina). При анализе полученных данных применялся 2 % порог частоты встречаемости аллеля (VAF). Клиническая значимость мутаций устанавливалась по базам данных COSMIC и ClinVar.
Результаты и обсуждение. По результатам NGS исследования у 21 пациента было выявлено 144 мутации (таблица 1), из которых
76, в соответствии с базами данных COSMIC и ClinVar, были отмечены как однонуклеотид-ные полиморфизмы (SNP) и исключены из последующего анализа. 68 мутаций носили соматический характер, 26 из которых с доказанной клинической значимостью и 42 мутации — с неясным клиническим значением.
Генетические аберрации выявлены у всех исследуемых пациентов, в среднем определялись 7 мутаций (от 4 до 12 у одного больного). При этом мутации соматической природы выявлены в 95 % случаев (20 /21) в количестве от 1 до 8 (в среднем 3 мутации на одного пациента). В 71 % исследуемых проб (15 / 21) обнаруживались от 1 до 3 мутаций с известной клинической значимостью. При контрольном секвенировании по Сэнгеру клинически значимых мутаций наблюдалась 100 % конкордант-ность с результатами NGS.
Таблица 1
Результаты NGS исследования у пациентов смиелопролиферативными новообразованиями
Пациент Пол Возраст Диагноз Гены с клинически значимыми мутациями Гены с клинически неизвестными мутациями
1 ж — ПМФ / БТ JAK2, ASXL1 CBL, SF3B1, JAK2, SMC3, NF1
2 м 65 ПМФ JAK2, ASXL1 GNAS
3 ж 56 ХМПН JAK2 TET2, PDGFRA
4 ж 55 ПМФ / БТ CALR, ASXL1, IDH1 —
5 ж 47 ЭТ IDH1 KIT, SF3B1, SETBP1
6 ж 60 ОМЛ CALR, ASXL1, EZH2 GNAS, PDGFRA
7 ж 79 МДС / ХМ МЛ CALR, KRAS EZH2
8 м — МПН — NOTCH1, ETV6, GATA2, RUNX1
9 м 46 ХМЛ — DNMT3A
10 м — МПН JAK2 NOTCH1, SH2B3
11 ж 78 МДС NRAS NOTCH1
12 м 38 МПН-н / МДС / БТ KRAS, TET2 ETV6
13 м 55 ХМПН U2AF1, CBL GATA2, SETBP1
14 ж 39 ОМЛ PTPN11, WT1 DNMT3A, NF1, CUX1
15 м 69 МПН — TP53
16 ж — — — NOTCH1, EZH2
17 ж 72 ХММЛ/ОМЛ KRAS, TET2 CBL, SH2B3, NF1, SETBP1
18 ж 52 ХМПН — —
19 м 36 ХМПН JAK2 JAK2, NF1, ASXL1
20 м 55 ХМПН — NOTCH1, ASXL1
21 ж 55 ХМПН JAK2 GATA2
Дополнительные соматические мутации были обнаружены у всех больных с драйвер-ной мутацией и у 92 % пациентов с РИ-МПН (11 / 12) — с тройным негативным мутационным статусом, что позволило подтвердить
клональность и верифицировать диагноз заболевания. Важно отметить, что у 6 из 8 (75 %) больных с обнаруженными 2-мя и более клинически значимыми мутациями наблюдалась бластная трансформация. В группе пациентов
с драйверными мутациями бластной трансформации сопутствовали дополнительные клинически значимые мутации в генах ASXL1 (3 / 6), EZH2 (1 / 6), ЮШ (1 / 6), ответственные за эпигенетическую регуляцию (пациенты 1, 4, 6). В то время как у тринегативных по драй-верным мутациям пациентов — клинически значимые мутации в генах KRAS (2/6) и PTPN11 (1 / 6), ответственные за передачу сигнала (пациенты 12, 14, 17) (рисунок 1). Наиболее частыми из мутаций с неопределенной клинической значимостью были мутации в генах NF1 (4 / 21), SETBP1 (3 /21) и GATA2(3 /21), а при бластных фазах — мутации в генах NF1 (3/6) и CBL (2 / 6).
Пациенты с 2 и более клинически значимыми мутациями в анамнезе ассоциировались с высоким риском развития ОМЛ, и наиболее патогенными для такого сценария являлись комбинации с мутациями гена ASXL1. Особый интерес вызывали мутации с неопределенной
на данный момент клиническом значимостью и их возможный вклад в патогенез и клональ-ную эволюцию МПН. В частности, в нашем исследовании была обнаружена частая встречаемость у пациентов с бластной трансформацией мутаций в гене NF1. Этот ген кодирует активирующий ГТФазу белок (GAP, GTPase activating protein), который участвует в ингибировании RAS / MAPK пути передачи сигнала в клетку, и является супрессором опухолей. Мутации в данном гене часто ассоциированы с развитием ХММЛ и ЮММЛ, устойчивостью к терапии и снижением общей выживаемости [14, 15]. В нашем исследовании только у одного пациента с мутацией NF1 был диагностирован ХММЛ (пациент 17), а у двух других ПМФ (пациент 1) и ОМЛ (пациент 15), но для всех них был отмечен быстрый переход в фазу бластной трансформации.
Рисунок 1. Встречаемость мутаций в генах у пациентов с бластной трансформацией в анамнезе.
Это позволило нам предположить прогностическую ценность мутаций в гене N¥1 для пациентов с комплексным мутационным статусом.
Заключение. Таким образом, данные, полученные при применении ЫОБ технологии, позволяют подтвердить клональную природу заболевания в сложных диагностических
случаях, что может послужить основой для разработки наиболее точных прогностических систем стратификации рисков у больных ми-елопролиферативными новообразованиями и делает возможным персонализированное лечение.
ЛИТЕРАТУРА
1. Bacher U., Shumilov E., Flach J., Porret N., Joncourt R., Wiedemann G., Fiedler M., Novak U., Amstutz U., Pabst T. Challenges in the introduction of next-generation sequencing (NGS) for diagnostics of myeloid malignancies into clinical routine use. // Blood Cancer J. 2018.— Vol. 8.— № 8.— P. 113.
2. Maes B., Willemse J., Broekmans A. et al. Targeted next-generation sequencing using a multigene panel in myeloid neoplasms: Implementation in clinical diagnostics.//Int J Lab Hem. 2017. — Vol. 39.— № 39.— P. 604-612.
3. Tefferi A., Lasho T. L., Patnaik M. M. et al. Targeted next-generation sequencing in myelodysplastic syndromes and prognostic interaction between mutations and IPSS-R. //Am J Hematology.— 2017.—Vol. 92.— № 92.— P. 1311-1317.
4. Tefferi A., Gangat N., Mudireddy M. et al. Mayo Alliance Prognostic Model for Myelodysplastic Syndromes: Integration of Genetic and Clinical Information. // Mayo Clin Proc.— 2018.—Vol. 93.— №1.— Р. 1363-1374.
5. Marneth A. E., Mullally A. The molecular genetics of myeloproliferative neoplasms. // Cold Spring Harb Perspect Med.— 2020.— Vol. 10.— № 10.— Р. 183-197.
6. Arber D.A., Orazi A., Hasserjian R., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia.//Blood.— 2016.— Vol. 127.— № 127.— Р. 2391-2405.
7. Vannucchi A., Guglielmelli P., Rotunno G., et al. Mutation-enhanced international prognostic scoring system (MIPSS) for primary myelofibrosis: an AGIMM&IWG-MRT project.//Blood.— 2014.— Vol. 124.— № 124.— Р. 405.
8. Boddu P. C., Kadia T. M., Garcia-Manero G., Cortes J., Alfayez M., Borthakur G., Konopleva M., Jabbour E. J., Daver N. G., DiNardo C. D., Naqvi K., Yilmaz M., Short N. J., Pierce S., Kantarjian H. M., Ravandi F. C. Validation of the 2017 European LeukemiaNet classification for acute myeloid leukemia with NPM1 and FLT3-internal tandem duplication genotypes. //Cancer.— 2019.— Vol. 125.— № 125.— Р. 1091-1100.
9. Palumbo G. A., Stella S., Pennisi M. S., Pirosa C., Fermo E., Fabris S., Cattaneo D., Iurlo A. The Role of New Technologies in Myeloproliferative Neoplasms.//Front Oncol.— 2019.— Vol. 9.— № 9.— Р. 321.
10. Carbonell D., Suárez- González J., Chicano M., Andrés- Zayas C., Triviño J. C., Rodríguez-Macías G., Bastos-Oreiro M., Font P., Ballesteros M., Muñiz P., Balsalobre P., Kwon M., Anguita J., Díez-Martín J. L., Buño I., Martínez-Laperche C. Next-Generation Sequencing Improves Diagnosis, Prognosis and Clinical Management of Myeloid Neoplasms //Cancers (Basel).— 2019.— Vol. 11.— № 11.— Р. 1364.
11. Venton G., Courtier F., Charbonnier A., D'incan E., Saillard C., Mohty B., Mozziconacci M. J., Birnbaum D., Murati A., Vey N., Rey J. Impact of gene mutations on treatment response and prognosis of acute myeloid leukemia secondary to myeloproliferative neoplasms. // Am J Hematol.— 2018.— Vol. 93.— №93.— Р. 330-338.
12. Aguilera-Diaz A., Vazquez I., Ariceta B., Mañú A., Blasco-Iturri Z., Palomino- Echeverría S., Larrayoz M. J., García-Sanz R., Prieto-Conde M. I., Del Carmen Chillón M., Alfonso- Pierola A., Prosper F., Fernandez-Mercado M., Calasanz M. J. Assessment of the clinical utility of four NGS panels in myeloid malignancies. Suggestions for NGS panel choice or design. // PLoS One.— 2020.— Vol. 15.— № 15.
13. Lundberg P., Karow A., Nienhold R., Looser R., Hao-Shen H., Nissen I., Girsberger S., Lehmann T., Passweg J., Stern M., Beisel C., Kralovics R., Skoda R. C. Clonal evolution and clinical correlates of somatic mutations in myeloproliferative neoplasms.//Blood.— 2014.— Vol. 123.— № 123.— Р. 2220-2228.
14. Jon Akutagawa, Tannie Q. Huang, Inbal Epstein, Tiffany Chang, Maricel Quirindongo-Crespo, Charisa L. Cottonham, Monique Dail, Barbara S. Slusher, Lori S. Friedman, Deepak Sampath, and Benjamin S. Braun. Targeting the PI3K / Akt pathway in murine MDS / MPN driven by hyperactive Ras. // Leukemia.— 2016.— Vol. 30.— № 30.— Р. 1335-1343.
15. Tiffany Chang, Kimberly Krisman, Emily Harding Theobald, Jin Xu, Jon Akutagawa, Jennifer O. Lauchle, Scott Kogan, Benjamin S. Braun, and Kevin Shannon. Sustained MEK inhibition abrogates myeloproliferative disease in Nf1 mutant mice.//J Clin Invest.— 2013. — Vol. 123.— № 123.— Р. 335-339.
