ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ ПИЩЕВОГО НАЗНАЧЕНИЯ ИЗ ВТОРИЧНОГО СЫРЬЯ Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

Для корреспонденции

Костылева Елена Викторовна - кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии новых продуцентов гидролитических ферментов ВНИИПБТ -филиала ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Адрес: 111033, Российская Федерация, г. Москва, ул. Самокатная, д. 4б Телефон: (495) 362-33-71 E-mail: ekostyleva@list.ru https://orcid.org/0000-0002-4775-303X

Костылева Е.В., Середа А.С., Великорецкая И.А., Курбатова Е.И., Цурикова Н.В.

Использование протеолитических ферментов для получения белковых гидролизатов пищевого назначения из вторичного сырья

Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии - филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра питания, биотехнологии и безопасности пищи, 111033, г. Москва, Российская Федерация

All-Russian Scientific Research Institute of Food Biotechnology - a branch of the Federal Research Center of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 111033, Moscow, Russian Federation

В связи с увеличением дефицита пищевого белка в мире актуальным представляется эффективное и наиболее полное использование белоксодержа-щих субстратов. Наиболее перспективным способом утилизации вторичного белоксодержащего сырья является повышение его пищевой ценности за счет ферментативного гидролиза. Применение белковых гидролизатов, полученных на основе белоксодержащих отходов, имеет большой потенциал в различных областях пищевой промышленности, а также при производстве специализированных пищевых продуктов для диетического питания.

Цель работы - на основании анализа особенностей основных видов вторичного сырья, используемых для получения белковых гидролизатов, и с учетом специ-

Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2022-2024 гг. (тема FGMF-2022-0006).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Середа А.С., Костылева Е.В.; сбор и обработка материала - Курбатова Е.И., Великорецкая И.А.; написание текста - Костылева Е.В., Середа А.С.; оформление статьи - Великорецкая И.А., Курбатова Е.И.; редактирование статьи - Костылева Е.В., Цурикова Н.В.; утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.

Для цитирования: Костылева Е.В., Середа А.С., Великорецкая И.А., Курбатова Е.И., Цурикова Н.В. Использование протеолитических ферментов для получения белковых гидролизатов пищевого назначения из вторичного сырья // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 1. С. 116-132. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-1 -116-132 Статья поступила в редакцию 27.07.2022. Принята в печать 01.12.2022.

Funding. This research was carried out within the framework of the Program of Basic Scientific Research of the State Academies of Sciences for

2022-2024 (topic No. FGMF-2022-0006).

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Contribution. The concept and design of the study - Sereda AS., Kostyleva E.V.; collection and processing of the material - Kurbatova E.I., Ve-likoretskaya I.A.; text writing - Kostyleva E.V., Sereda A.S.; article design - Velikoretskaya I.A., Kurbatova E.I.; editing of the article - Kostyleva E.V., Tsurikova N.V.; approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors.

For citation: Kostyleva E.V., Sereda AS., Velikoretskaya I.A., Kurbatova E.I., Tsurikova N.V. Proteases for obtaining of food protein hydrolysates from proteinaceous by-products. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (1): 116-32. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-1-116-132 (in Russian)

Received 27.07.2022. Accepted 01.12.2022.

Proteases for obtaining of food protein hydrolysates from proteinaceous by-products

Kostyleva E.V., Sereda A.S., Velikoretskaya I.A., Kurbatova E.I., Tsurikova N.V.

фичности действия различных протеаз предложить оптимальные способы обработки белковых субстратов для получения гидролизатов, обладающих желаемыми характеристиками.

Материал и методы. В работе использовали материалы, содержащиеся в базах данных PubMed, WoS, Scopus и eLIBRARY.RU и удовлетворяющие требованиям научной достоверности и полноты.

Результаты. Основными видами белоксодержащих отходов, успешно используемых для получения гидролизатов пищевого и функционального назначения, являются коллагенсодержащие отходы мясо-, птице- и рыбоперерабатывающей промышленности, молочная сыворотка, соевый белок и глютен. Приведено описание молекулярной структуры, основных биологических и физико-химических свойств коллагена, белков молочной сыворотки, различных белковых фракций пшеничного глютена и соевого белка. Обоснована целесообразность ферментативной обработки основных видов вторичного белоксодержащего сырья протеазами для снижения их антигенности и устранения антипищевых свойств, улучшения функциональных, органолептических и биоактивных свойств для последующего применения в производстве пищевых продуктов, специализированных пищевых продуктов для диетического (лечебного и профилактического) питания. Представлена информация о классификации про-теолитических ферментов, об основных свойствах ферментов из разных групп, проанализирована эффективность их использования в процессах переработки различных видов белковых отходов.

Заключение. На основании анализа данных литературы предложены наиболее перспективные способы получения пищевых белковых гидролизатов из вторичного белоксодержащего сырья, включая предобработку субстратов и выбор про-теолитических ферментов с определенной специфичностью действия. Ключевые слова: коллаген; соевый белок; молочная сыворотка; глютен; про-теазы; гидролизаты

Due to the increasing shortage of food protein in the world, the most effective and complete use of proteinaceous substrates is an urgent task. The most promising way to utilize secondary protein-containing raw materials is to increase its nutritional value through enzymatic hydrolysis. The use of protein hydrolysates obtained from protein-containing by-products has great potential in various areas of the food industry, as well as in the production of foods for medical and special dietary uses.

The aim of the research was to propose optimal methods for processing protein substrates to obtain hydrolysates with desired properties, taking into account the characteristics of the main types of proteinaceous by-products and the specificity of proteases used. Material and methods. We used the data contained in PubMed, WoS, Scopus, and eLIBRARY.RU databases, which meet the requirements of scientific reliability and completeness.

Results. Collagen-containing wastes from the meat, poultry and fish processing industries, whey, soy protein and gluten are the main types of protein-containing by-products successfully used to produce food and functional hydrolysates. The molecular structure, basic biological and physico-chemical properties of collagen, whey proteins, various protein fractions of wheat gluten and soy protein are described. The expediency of enzymatic treatment of protein-containing by-products using proteases is shown to reduce antigenicity and eliminate anti-nutritional properties, improve nutritional, functional, organoleptic and bioactive properties for subsequent use in food production, including those for medical and special dietary uses. Information is presented on the classification of proteolytic enzymes, their main properties, and the effectiveness of their use in the processing of various types of proteinaceous by-products.

Conclusion. Based on the literature data analysis, the most promising methods for obtaining food protein hydrolysates from secondary protein-containing raw materials are proposed, including pretreatment of substrates and the selection of proteolytic enzymes with a certain specificity.

Keywords: collagen; soy protein; whey4 gluten4 proteases; hydrolysates

Дефицит пищевого белка - одна из основных причин несбалансированного питания населения. Эту проблему можно решить за счет рационального использования вторичных белоксодержащих продуктов, повышая их пищевую ценность в результате ферментативного гидролиза.

В России уровень промышленной переработки вторичных ресурсов пищевой промышленности составляет не более 20% от образуемой массы, что снижает экономическую эффективность технологических процессов и приводит к экологическим проблемам. В то же время применение белковых гидролизатов, полученных

на основе белоксодержащих отходов, имеет большой потенциал в различных областях пищевой промышленности [1].

Основные виды вторичного белоксодержащего сырья, используемые для получения белковых гидролизатов пищевого назначения

Белоксодержащие отходы мясо-и птицеперерабатывающей отрасли

В зависимости от состава и особенностей последующей обработки белоксодержащие отходы, получаемые в процессе переработки сельскохозяйственных животных и птицы, можно разделить на мякотные, кера-тиносодержащие, коллагенсодержащие и кровь. Для получения белковых гидролизатов пищевого назначения используют в основном коллагенсодержащие отходы [2].

К коллагенсодержащим отходам относятся головы, хвосты, костные и мясокостные остатки, шкуры сельскохозяйственных животных в мясоперерабатывающей отрасли; головы, голени, мясокостные остатки от механической обвалки птицы в птицеперерабатывающей промышленности; отходы рыбопереработки - кожу, скелеты, головы, чешую [2].

Традиционно эти отходы считают непригодными для питания человека, однако они могут быть переработаны для пищевых целей. Такую условно съедобную часть можно успешно применять для создания новых пищевых ингредиентов с добавленной стоимостью, обладающих определенными функциональными свойствами, или технологических добавок с требуемыми физико-химическими свойствами: водосвязывающей, гелеобразующей, пенообразующей, эмульгирующей способностью, улучшенными органолептическими характеристиками [3].

Коллаген является основой соединительной ткани и составляет 25-35% всех белков организма млекопитающих. Он имеет уникальный аминокислотный состав, отличаясь высоким содержанием глицина (33%), про-лина и оксипролина (суммарно 22%). Пептиды коллагена содержат 2 аминокислоты, не встречающиеся в других белках - гидроксипролин и гидроксилизин [4, 5].

Типичная молекула коллагена (тропоколлаген) состоит из 3 скрученных в виде тройной спирали полипептидных а-цепей, каждая из которых содержит примерно 1000 аминокислот и имеет молекулярную массу (ММ) около 100 кДа. Зрелый коллаген состоит из молекул тро-поколлагена, объединенных в фибриллы, стабилизирован ковалентными связями и практически нерастворим. Формирование фибриллярной структуры обеспечивается высоким содержанием глицина в молекуле тропо-коллагена. В нормальных условиях коллаген является очень стабильным белком, но в результате нагревания выше 40 °С теряет структуру тройной спирали и превращается в растворимый в воде желатин, представляющий собой гетерогенную смесь полипептидов [4, 5]. Счита-

ется, что фракция со средней ММ <3 кДа представляет собой гидролизат коллагена, с ММ >50 кДа - желатин, а с ММ >300 кДа - коллаген [6].

У позвоночных идентифицировано около 28 различных типов коллагена, которые состоят как минимум из 46 различных полипептидных цепей и различаются по структуре и функциональным свойствам. В разных тканях присутствуют различные типы коллагенов. Наиболее распространены коллагены типа I, II и III, причем 90% всех коллагеновых белков составляют коллагены I и III типов - компоненты кожи, сухожилий, стенок сосудов, отличающиеся низким содержанием гидрокси-лизина. Коллаген II типа содержится главным образом в хрящевых тканях и отличается высокой концентрацией гидроксилизина [4, 5, 7].

Коллагенсодержащее сырье широко используется для получения пищевых белковых добавок, в производстве функциональных и специализированных пищевых продуктов. Ферментативные гидролизаты коллагена проявляют антиоксидантную и антимикробную активность [4, 8, 9], способны присоединять ионы кальция, повышая его биодоступность [4, 10, 11], поэтому их применяют в составе гериатрических продуктов, а также в диетотерапии [4, 12, 13]. Биологически активные добавки (БАД), содержащие гидролизат коллагена, успешно используют в спортивном питании при проблемах с сухожилиями и при болях в суставах, а также в косметологии для улучшения состояния кожи [4, 5, 14].

В пищевой промышленности гидролизаты коллагена используют при изготовлении мясных продуктов, напитков, супов, что позволяет улучшить их органолептиче-ские и физико-химические характеристики. Благодаря антикоагуляционным свойствам гидролизаты коллагена используют в качестве криопротекторов в пищевых продуктах, требующих хранения при низких или отрицательных температурах [4, 5].

Вторичное белоксодержащее сырье рыбной промышленности

На рыбоперерабатывающих предприятиях отходы (головы, чешуя, кожа, плавники, позвоночные хребты, внутренности) составляют 50-70% массы исходного сырья. Традиционно их используют для получения продуктов с пониженной ценностью, таких как рыбная мука или удобрения. В то же время белоксодержащие вторичные рыбные ресурсы характеризуются высоким потенциалом, т.е. содержат большое количество жирных кислот, ферментов, незаменимых аминокислот и различных белков, в том числе коллагена [15-17].

Коллаген гидробионтов на 96% идентичен человеческому, отличается слабой антигенностью, легче усваивается организмом человека по сравнению с коллагеном наземных животных и служит источником пептидов, обладающих биологической активностью. Коллаген кожи, плавников и чешуи рыб относится к I типу, его отличительной особенностью является повторяющаяся последовательность аминокислот глицин-аланин-гли-цин. Ферментативные гидролизаты белоксодержащих

отходов рыбопереработки перспективны для использования в производстве продуктов специализированного и функционального назначения, а также БАД. Низкомолекулярные пептиды (с ММ <10 кДа), содержащиеся в белковых гидролизатах из вторичного рыбного сырья, проявляют антиоксидантную [15, 16, 18, 19], антимикробную [16-18], иммуномодулирующую [15-17], гипотензивную (АПФ-ингибиторную) [15, 17-19] и нейро-протекторную активность [18], способность связывать минеральные вещества [15], антитромботический [20] и фотозащитный эффекты [18]. Гидролизаты рыбного белка могут использоваться в различных рецептурах специализированных пищевых продуктов для диетического, профилактического и лечебного питания для предотвращения сердечно-сосудистых заболеваний и гипертонии [15-17].

Гидролизаты рыбного белка обладают рядом функциональных свойств, таких как водоудерживающая, эмульгирующая, геле- и пенообразующая способность, растворимость, что позволяет использовать их в различных технологических процессах пищевой промышленности: в составе колбасных и паштетных изделий, как компонент соусов и заливок, в качестве обогащающей добавки в хлебобулочных, кондитерских и кисломолочных изделиях [17].

Белоксодержащие отходы молочного производства

Основным отходом производства молочных продуктов является молочная сыворотка - фильтрат, полученный при выделении из молока белково-жировых концентратов (сыр, творог, технический казеин). В сыворотку переходит около 50% сухих веществ молока [21]. Сывороточные белки представляют собой глобулины и альбумины, растворимые в широком диапазоне рН, и составляют около 20% всех белков молока. Они легко усваиваются, обладают высокой пищевой ценностью, содержат большое количество незаменимых аминокислот и являются источником биоактивных пептидов, обладающих анти-оксидантными, антимикробными, иммуномодулятор-ными и другими свойствами [22, 23]. Следует отметить высокое содержание лизина в молочной сыворотке [24].

Среди сывороточных белков доминирует р-лакто-глобулин (р-ЛГ) с ММ 18,3 кДа, составляющий 50-55% сывороточных белков. Молекула р-ЛГ состоит из 162 аминокислот и содержит 2 дисульфидные и 1 сульфги-дрильную группу. р-ЛГ - основной аллерген молочной сыворотки, так как он отсутствует в женском молоке и устойчив к действию желудочного пепсина. Четвертичная структура р-ЛГ в зависимости от рН и температуры может представлять собой димер с ММ 36 кДа, мономеры или октамер с ММ около 140 кДа [23].

Вторым основным белком молочной сыворотки является а-лактальбумин (а-ЛА), составляющий около 20-25% общего количества сывороточного белка. а-ЛА - глобулярный белок с ММ 14,2 кДа, который относится к кальций-зависимым металлопротеинам - для правильной конформации молекулы ему необходимы

ионы кальция. Молекула а-ЛА состоит из 123 аминокислот, из которых 63,2% незаменимые, и содержит 4 дисульфидные связи. а-ЛА - самый термостабильный белок молока [23].

Около 8% общего количества белка молочной сыворотки составляет сывороточный альбумин, физиологически и иммунологически идентичный сывороточному альбумину крови. Сывороточный альбумин коровьего молока характеризуется ММ 66,5 кДа, содержит 583 аминокислоты, 17 дисульфидных связей и 1 сульф-гидрильную группу [23].

Остальное количество сывороточных белков приходится на иммуноглобулины и многочисленные минорные белки, включая лактоферрин, лактопероксидазу и другие ферменты. Также в сыворотке содержатся протеозопептоны, которые составляют 0,8-1,2 г/л молока и образуются в результате протеолиза р-казеинов [21, 23].

На основе молочной сыворотки получают концентраты и изоляты сывороточного белка с содержанием белка 25-80 и 90-95% соответственно [25]. Однако высокая аллергенность р-ЛГ и частые случаи аллергических реакций на а-ЛА и сывороточный альбумин препятствуют их эффективному использованию в пищевой отрасли [26]. Наиболее перспективным способом снижения аллергенности молочных белков является их направленный ферментативный гидролиз с получением гидролизатов с заданным молекулярно-массовым распределением с последующим отделением непрогидро-лизованных белков с помощью мембранной ультрафильтрации и/или нанофильтрации [22, 27].

Ферментативные гидролизаты белков молочной сыворотки с определенной степенью гидролиза считаются идеальными ингредиентами в рецептурах заменителей женского молока, в создании продуктов спортивного питания, специализированных продуктов профилактического и терапевтического назначения [28]. Добавление гидролизатов молочных белков положительно влияет на жизнеспособность пробиотиков в йогуртах, улучшает их текстуру и органолептические свойства [29].

Основные виды вторичного растительного белоксодержащего сырья

В качестве растительных источников пищевого белка наиболее широко используют такие вторичные ресурсы, как белковые изоляты и концентраты, полученные из соевого шрота - побочного продукта производства соевого масла, и пшеничный глютен, образующийся при производстве крахмала [30, 31].

Соевый белок

Белок сои по пищевой ценности близок к белкам мяса и молока и богат незаменимыми аминокислотами, особенно лизином - лимитирующей аминокислотой в растительных белках, по которой обычно рассчитывают их биологическую ценность [32]. Около 70% белков сои представлены запасными белками глицинином и р-конглицинином. Глицинин состоит из основного по-

липептида В с ММ около 20 кДа и кислого полипептида А с ММ около 38 кДа, соединенных дисульфидной связью и образующих индивидуальную субъединицу АВ. Четвертичная структура глицинина зависит от рН и ионной силы растворов. При умеренных температурах и нейтральных рН глицинин образует гексамерные комплексы с ММ от 320 до 375 кДа, состоящие из гетерогенных субъединиц. Каждый гексамер содержит около 2 БН-групп и 18-20 дисульфидных связей. р-Конглицинин с ММ 150-180 кДа является тримерным гликопротеи-ном, состоящим из 3 типов субъединиц: а (72-76 кДа), а' (68-72 кДа) и р (52-53 кДа), которые взаимодействуют, образуя 7 изомеров. Субъединицы связаны преимущественно за счет гидрофобных взаимодействий или водородными связями, не содержат свободных БН-групп, на тримерную молекулу приходится не более 2 дисульфидных связей. Глицинин и р-конглицинин определяют функциональные свойства соевого белка, такие как гелеобразование и эмульгирующую способность, и проявляют антигенные свойства, оказывая негативное действие на иммунную систему [31, 33].

К минорным белкам сои относятся лектины, трипси-новые ингибиторы, ферменты (уреаза, липоксигеназа). Лектины (гемагглютенины) - гликопротеины, состоящие из субъединиц с ММ 25-30 кДа в виде димеров или те-трамеров, содержат 3-5% углеводов. Лектины связываются с мембранами клеток слизистой оболочки кишки, повышая ее проницаемость для бактериальных токсинов, способны агглютинировать эритроциты, что приводит к нарушениям пищеварения в тонкой кишке [33, 34]. До 10% соевого белка составляют трипсиновые ингибиторы: ингибитор Кунитца с ММ 21,5 кДа и ингибитор Бау-мана-Бирка с ММ 7,8 кДа, которые блокируют действие пищеварительных протеаз [33]. Около 2% общего содержания белка в сое составляет фермент липоксигеназа. Фермент образует реактивные соединения (окисленные полиненасыщенные жирные кислоты), участвующие в каскадных реакциях, которые снижают пищевую ценность и органолептические свойства соевых продуктов. Уровень уреазы, катализирующей гидролиз мочевины с образованием аммония и диоксида углерода, в соевых бобах составляет 0,2-0,4% от экстрагируемых белков сои. Ферменты, лектины и трипсиновые ингибиторы сои термолабильны, и их антипитательное действие устраняется в результате термообработки сои [35].

Типичный пептидный профиль соевого белка, полученный в результате электрофоретического анализа, включает полосу липоксигеназы с ММ >100 кДа, 3 субъединицы р-конглицинина с ММ от 50 до 80 кДа, кислую и основную субъединицы глицинина с ММ соответственно около 38 и 20 кДа [36].

Соевые белки широко используются в качестве функциональных добавок и пищевых белоксодержа-щих ингредиентов. Селективный гидролиз протеазами с определенной специфичностью позволяет получать требуемые функциональные свойства - эмульгирую-

щие, геле- и пенообразующие, растворимость, взби-ваемость, необходимые при замене некоторых белков животного происхождения (мясных, яичных и др.) [37].

Соевые белки служат источником биоактивных пептидов, обладающих антиоксидантными свойствами, снижающих уровень холестерина, оказывающих гипотоническое действие и препятствующих тромбообразованию [38, 39]. Соевые гидролизаты используют в качестве усилителей вкуса в составе приправ, соусов, концентрированных супов. Гипоаллергенные гидролизаты соевого белка с высоким содержанием низкомолекулярной фракции используют в детских смесях, в лечебном питании, гериатрических продуктах [37, 40].

Пшеничный глютен

При переработке злаковых культур на крахмал в виде отходов образуются большие количества дешевого белка. Белки зерновых классифицируют главным образом по их растворимости. В пшенице около 20% растворимых белков (альбумины, глобулины), 30-40% проламинов (глиадины), 40-50% глютелинов (глютенины). Глютелины и глиадины, благодаря специфическим физико-химическим свойствам, объединяют в группу глютенов (клейковина) - белков, характеризующихся высокой эластичностью и упругостью образуемых ими гелей. Аминокислотный состав глютена отличается высоким содержанием пролина и глутаминовой кислоты [30, 41, 42].

Глютелины представляют собой спиртонераствори-мые полимерные молекулы с ММ от 500 тыс. до более 10 млн г/моль, состоящие из 2 типов субъединиц - низкомолекулярных LMW-GS (от 30 до 60 кДа) и высокомолекулярных НМ^^Б (от 65 до 90 кДа), соединенных дисульфидными связями. Соотношение содержания высоко- и низкомолекулярных субъединиц составляет приблизительно 1:4 [30, 42, 43].

Глиадины - спирторастворимые мономерные белки, включающие 4 электрофоретические фракции: а-, р-, у- и ю-глиадины. а-, р-, у-Глиадины характеризуются ММ 30-45 кДа и содержат цистеин, что способствует образованию дисульфидных связей, ММ ю-глиадинов составляет 46-75 кДа [30, 41].

Основная сфера применения клейковины - хлебопекарная промышленность, где данный продукт используют для улучшения качества муки [30, 42]. Помимо этого, пшеничный глютен является незаменимым сырьем для мясоперерабатывающих предприятий, при производстве кормов для животноводства и рыбоводства, сухих завтраков, молочных продуктов, текстуратов, аналогов морепродуктов и пищевых пен [30]. Ферментативный гидролиз дает возможность расширить область применения глютена. Контролируемая модификация функциональных свойств глютена (пенообразующая и эмульгирующая способность, растворимость и др.) позволяет использовать его в качестве функциональных ингредиентов и усилителей вкуса в кондитерских изделиях, супах, соусах, подливках, закусках, мясных продуктах, а также для обогащения безалкогольных

напитков и соков. Ферментативные гидролизаты пшеничного глютена используют для придания пикантного вкуса (умами) широкому спектру кулинарных изделий [30].

Используя протеазы с широкой специфичностью действия или комплексы эндо- и экзопротеаз, можно проводить глубокий гидролиз глютена с получением аминокислот и коротких пептидов, проявляющих биоактивные свойства. Из пшеничного глютена получают низкомолекулярные пептиды, проявляющие АПФ-ингибирующие (гипотензивные), гепатопротекторные, иммуномодули-рующие и антиоксидантные свойства [30, 44].

У некоторых людей белки и пептиды, богатые про-лином, глутаминовой кислотой и глутамином, вызывают целиакию - заболевание, приводящее к тяжелым нарушениям пищеварительной системы. Кроме того, в глютене обнаружено более 60 иммуногенных пептидов. Глубокий гидролиз специфическими протеа-зами, способными расщеплять пептидные связи рядом с остатками пролина и глутамина, способствует снижению цитотоксических свойств и аллергенности глютена [30, 43].

Отрицательным свойством белковых гидролиза-тов, препятствующим их использованию в качестве компонентов пищевых продуктов, является горечь, обусловленная присутствием пептидов, содержащих концевые гидрофобные аминокислоты, такие как Trp, Phe, Iso, Try, Val и Leu. У интактных белков остатки гидрофобных аминокислот обычно находятся внутри макромолекулы. В результате действия эндопептидаз они становятся доступны для связывания с вкусовыми рецепторами. Формированию горечи пептидов также способствуют остатки пролина, находящиеся в предпоследней позиции. Интенсивность горечи определяется гидрофобностью, длиной и структурой пептидов и зависит от вида белкового субстрата, специфичности эндопротеаз и степени гидролиза. Как правило, она повышается с увеличением длины пептида. Для удаления горечи из белковых гидролизатов применяют такие методы, как селективная экстракция растворителем, адсорбция макропористой смолой и активированным углем, маскировка вкуса добавлением цикло- и мальтодекстринов, полифосфатов, подсластителей, проведение реакции Майяра, инкапсуляция, пластеиновая реакция. Наиболее успешно проблему горечи белковых гидролизатов решают внесением препаратов экзопептидаз, избирательно отщепляющих аминокислотные остатки от конца пептидных молекул, что позволяет избежать потерь пептидов и аминокислот, а также изменения аминокислотного состава гидролизатов [45-47].

Таким образом, ферментативная обработка основных видов вторичного белоксодержащего сырья протеазами позволяет получать гидролизаты со сниженной антиген-ностью и улучшенными пищевыми, функциональными, органолептическими и биоактивными свойствами для применения в производстве специализированных пищевых продуктов для диетического питания.

Протеолитические ферменты, используемые для получения белковых гидролизатов

Классификация протеаз

Протеазы, или пептидгидролазы, катализируют гидролиз белков и пептидов за счет расщепления пептидных связей. По типу катализируемых реакций протеазы объединены в 2 большие группы: экзопептидазы, расщепляющие пептидную связь только в концевых областях полипептида, и эндопептидазы, действующие на связи внутри полипептидной цепи [48, 49].

Экзопептидазы

Экзопептидазы делят на карбокси-, амино- и ди-пептидазы. Карбоксипептидазы действуют на С-конец полипептидной цепи с высвобождением отдельных аминокислот или дипептидов. Аминопепти-дазы действуют на свободный N-конец полипептидной цепи, высвобождая свободные аминокислоты, ди- и трипептиды. Специфичность аминопептидаз определяется способностью гидролизовать кислые, основные или нейтральные N-концевые остатки. Ди-пептидазы специфично расщепляют пептидные связи на свободные аминокислоты только в дипептидах [45, 48].

Одной из наиболее известных и широко применяемых экзопептидаз является лейцинаминопептидаза (LAP), которая предпочтительно катализирует гидролиз остатков лейцина с аминоконца белковых или пептидных субстратов. LAP являются цинк-зависимыми металло-пептидазами. Поскольку интенсивность горечи пептида пропорциональна количеству гидрофобных аминокислот на его N-конце, LAP используют для удаления единичных или пары гидрофобных аминокислот с N-конца полипептидной цепи при устранении горечи белковых гидролизатов. LAP также усиливают вкус за счет высвобождения аминокислот, придают характерный вкус тесту, мясу и сыру [45].

Эндопептидазы

По структуре каталитического центра эндопептидазы делят на сериновые, цистеиновые (или тиоловые), аспар-татные, треониновые и металлопротеазы [48].

Для сериновых эндопептидаз (КФ 3.4.21) характерно наличие в каталитическом центре триады аминокислот: серин, аспарагиновая кислота и гистидин. К этому подподклассу относятся многие протеазы животного происхождения (химотрипсин, трипсин, эластаза и др.) и ряд промышленно значимых микробных протеаз (суб-тилизин BPN' из Bacillus amyloliquefaciens, субтилизин Карлсберг, синтезируемый B. licheniformis, оризин грибов рода Aspergillus). Сериновые протеазы, как правило, активны в нейтральной и щелочной зоне рН, проявляют широкую субстратную специфичность. Их ММ варьируют от 18 до 35 кДа. Некоторые сериновые протеазы обладают способностью к гидролизу жестких, фибриллярных молекул нерастворимых структурообразующих белков, таких как кератин и коллаген. Серин активного

центра большинства сериновых протеаз ингибируется диизопропилфторфосфатом и фенилметансульфонил-фторидом [48-50].

Цистеиновые протеазы (КФ 3.4.22) содержат в активном центре остатки цистеина и гистидина, обусловливающие их каталитическую активность, и, как правило, имеют слабокислый или нейтральный рН-оптимум, чувствительны к сульфгидрильным ингибиторам. К цисте-иновым относится ряд важных протеаз растительного происхождения, таких как папаин, фицин, бромелаин, химопапаин. ММ цистеиновых протеаз составляет 21-30 кДа. Они катализируют гидролиз пептидных, амидных и ряда сложноэфирных связей, характеризуются высокой протеолитической активностью по отношению к широкому спектру белковых субстратов [48, 50].

Треониновые протеазы (КФ 3.4.25) гидролизуют пептидную связь с участием Ы-концевого остатка треонина и на данный момент не имеют промышленного применения [48].

В подподкласс кислых аспартатных протеаз (КФ 3.4.23) входят эндопептидазы, каталитическая активность которых обусловлена присутствием карбоксильных групп аспарагина в активном центре. К аспар-татным протеазам относят ряд гомологичных протеаз: пепсин, химозин, ренин, катепсин D и родственные ферменты. За исключением ренина, оптимум их активности находится в зоне кислых рН, ММ варьируют от 30 до 45 кДа. Аспартатные протеазы обратимо ингибиру-ются пепстатином. Наиболее известная аспартатная протеаза - пепсин - характеризуется широкой субстратной специфичностью, расщепляет пептидные связи между гидрофобными аминокислотными остатками, в первую очередь ароматическими - тирозином, триптофаном и фенилаланином [48, 50].

Металлоэндопептидазы, или металлопротеазы, (КФ 3.4.24) содержат в активном центре катионы двухвалентных металлов, чаще всего ионы Zn2+, но в ряде случаев Мд2+, Мп2+, Со2+, Са2+, некоторые содержат Ы12+ или Си2+. Встречаются как нейтральные металлопротеазы с оптимумом активности при рН 7,0-8,0, проявляющие специфичность к гидрофобным аминокислотам, так и щелочные с рН-оптимумом 9,0 и более широкой субстратной специфичностью. ММ металлопротеаз находится в пределах 35 кДа. Металлопротеазы ингибиру-ются хелатирующими агентами (ЭДТА), но не реагируют на сульфгидрильные агенты или ингибиторы сериновых протеаз фенилметансульфонилфторид и диизопропил-фторфосфат. Наиболее широко используют металло-протеазами являются термолизин, бациллолизин и кол-лагеназа [48, 51].

Особое значение при получении гидролизатов из кол-лагенсодержащего сырья имеют некоторые сериновые и металлопротеазы, обладающие коллагеназной активностью [7].

Известны пролилспецифичные пептидазы, способные гидролизовать пептидные связи вблизи пролина и расщеплять глютен. Их синтезируют грибные (A. niger,

A. oryzae, A. usamii, F. graminearum) или бактериальные продуценты (Pseudomonas aeruginosa, Bacillus sp., Bifidobacterium sp., Lactobacillus sp. и др.). Пептидазы на основе A. niger, A. oryzae, A. usamii и F. graminearum допущены к применению в пищевой промышленности. Большинство пролилспецифичных пептидаз являются экзопептидазами, которые эффективны при гидролизе глютена только в сочетании с эндопротеазами, например субтилизин-подобными или цистеиновыми [49].

Ферментные препараты, используемые для гидролиза белоксодержащего сырья

Протеазы животного происхождения

Наиболее известные протеолитические препараты животного происхождения, широко используемые в технологических процессах и ряде научных исследований, - пепсин, трипсин, химотрипсин, панкреатин.

В состав панкреатина, получаемого из поджелудочной железы свиней, входят трипсин, химотрипсин в форме проферментов и карбоксипептидаза, ферменты липо-литического и амилолитического действия. Также из поджелудочной железы отдельно выделяют сериновые протеазы трипсин и химотрипсин. Трипсин избирательно гидролизует связи, образованные карбоксильными группами основных аминокислот аргинина и лизина, но не обладает коллагеназной активностью. Он чувствителен к действию ингибиторов сериновых протеаз, вырабатываемых поджелудочной железой и содержащихся в соевых бобах. Химотрипсин имеет более широкую специфичность, чем трипсин, гидролизует пептидные, амидные и сложноэфирные связи. При воздействии химотрипсина на субстрат образуются относительно низкомолекулярные пептиды. Он не способен гидроли-зовать коллаген [50, 52].

Из сычуга жвачных животных выделяют аспартатную протеазу пепсин (в форме пепсиногена), способную расщеплять широкий спектр нативных белков. Пепсин действует на субстраты медленнее, чем другие протеазы. Не расщепляет кератин и продукты гидролиза белков с низкой ММ [50, 53].

Из поджелудочной железы сельскохозяйственных животных выделяют коллагеназу (КФ 3.4.24.7), способную расщеплять связи, образованные остатками пролина. Коллагеназа животных обеспечивает расщепление коллагена на 75-85%, но не действует на альбумин, казеин и желатин, что говорит о высокой субстратной специфичности этого фермента. Коллагеназа устойчива только при 4 °С и рН 6,5-7,8. При повышении температуры до 18-20 °С через 1 сут полностью теряет активность. Коллагеназы также получают из внутренностей рыб [7].

В настоящее время основным животным сырьем для производства протеолитических ферментных препаратов, содержащих коллагеназу, являются железы желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных, внутренние органы рыбы, камчатского краба. Так, известен препарат «Коллагеназа пищевая»

(ТУ 9281-004-11734126-00, ЗАО «Биопрогресс», Щелково Московской обл., Россия), получаемый из гепатопан-креаса камчатского краба Paralithodes camtschatica [54]. Из мышечного желудка кур производят ферментный препарат (ФП) «Протепсин» (ЗАО «Завод эндокринных ферментов», пос. Ржавки, Москва, Россия), который включает комплекс кислых аспартатных протеаз (катеп-сины), обладает коллагеназной активностью и рекомендуется для обработки мясного сырья и продуктов его переработки [54, 55].

Протеазы растительного происхождения

Из протеаз растительного происхождения наиболее широко применяют папаин, фицин и бромелаин. Растительные протеазы имеют широкую субстратную специфичность, обеспечивают глубокое расщепление большинства белков как растительного, так и животного происхождения.

Так, цистеиновая протеаза папаин, получаемый из латекса (млечного сока) плодов папайи, гидролизует казеин, желатин, коллаген, эластин, глобулин, фибрин и другие растительные и животные белки. Папаин предпочтительно расщепляет связи рядом с остатками фе-нилаланина, валина и лейцина. Бромелаин и фицин более интенсивно гидролизуют актомиозин (мышечный белок) по сравнению с трипсином и химотрипсином, расщепляют денатурированный коллаген и нативный эластин [50, 55].

Протеазы микробного происхождения

Предпочтительными источниками для получения ферментных препаратов являются микробные продуценты благодаря их высокой продуктивности, относительно небольшим затратам на культивирование и получение готовых форм препаратов, а также возможности получать ферменты, обладающие необходимыми свойствами для конкретных технологических процессов [49].

В пищевой промышленности для получения белковых гидролизатов широко используют препараты, производимые компанией Novozymes A/S (Дания). Алкалаза - препарат щелочной сериновой протеазы субтилизин Карлсберг, получаемый при глубинной ферментации штамма B. licheniformis. Нейтраза - препарат цинк-зависимой металлопротеазы бациллолизин, полученный путем глубинной ферментации штамма B. amyloliquefacience. Протамекс - комплекс нейтральных и щелочных протеаз B. amyloliquefacience и B. licheniformis [56-58]. К наиболее известным препаратам бактериальных протеаз для пищевой промышленности относится также Corolase 7089 (AB Enzymes GmbH, Германия) - ФП нейтральной и сериновой протеазы B. subtilis [57].

В России выпускают ФП Протосубтилин (ОАО «Сиббио-фарм», Россия) - препарат субтилизина BPN' и металло-протеазы на основе штамма B. subtilis, предназначенный для применения в кормопроизводстве [59].

В ряде исследований по получению белковых гидро-лизатов успешно использовали термолизин - термоста-

бильную цинк-зависимую протеазу B. thermoproteolyticus [60]. Выпускается ФП Corolase 2TS (AB Enzymes GmbH, Германия) - термостабильная, нейтральная эндопепти-даза (термолизин) B. stearothermophilus [58, 61].

Флавозим - комплексный препарат грибных протеаз на основе штамма A. oryzae ATCC 42149/RIB 40. В состав флавозима входят щелочная сериновая эндопептидаза, 2 нейтральные эндопептидазы, 2 дипептидилпептидазы и 2 лейцинаминопептидазы. Ключевым компонентом флавозима считают лейцинаминопептидазу, по активности которой оценивают и дозируют ФП. В большинстве случаев флавозим применяют в сочетании с препаратами бактериальных эндопротеаз для получения глубоких гидролизатов с удовлетворительными органо-лептическими свойствами, которые можно использовать в качестве вкусовых добавок. Применение флавозима также позволяет получить биоактивные пептиды, обладающие антиоксидантными и АПФ-ингибирующими свойствами [60, 62]. В качестве источников лейцина-минопептидазы также применяют препараты Corolase LAP (AB Enzymes GmbH, Германия) и Kojizyme 500 MG (Novozymes A/S, Дания), получаемые на основе мицели-альных грибов рода Aspergillus [63, 64].

Эффективность применения ферментных препаратов протеолитического действия при обработке различных видов белоксодержащих отходов

Выбор протеолитических ферментов для получения белковых гидролизатов зависит от вида целевого продукта, в частности, требуемой степени гидролиза (СГ) субстрата и условий гидролиза. Гидролизаты обычно классифицируют по СГ на частичные и глубокие. Частичный (ограниченный) гидролиз белков применяют для улучшения функциональных свойств белков в пищевой промышленности, в то время как глубокие гидро-лизаты в основном используются в специализированном и лечебном питании [29]. Также выбор фермента определяется структурой белкового субстрата. Например, если белок характеризуется высоким содержанием гидрофобных аминокислот, то для его гидролиза следует выбирать протеазу, которая предпочтительно расщепляет пептидные связи между гидрофобными аминокислотами [65]. При выборе штамма-продуцента протеолитических ферментов необходимо учитывать требования ТР ТС 029/2012 (приложение 26), в котором перечислены все микроорганизмы-продуценты, допущенные для использования при производстве пищевой продукции.

Гидролиз коллагенсодержащего вторичного сырья

Вторичное сырье мясной отрасли

В исследованиях по гидролизу коллагенсодержащего сырья успешно применяют такие препараты, как ал-

калаза, папаин, а-химотрипсин, нейтраза, протамекс, пепсин, флавозим, трипсин, Pronase E, коллагеназа, бромелаин и др. [6, 66].

При гидролизе коллагена шкур наиболее эффективны оказались препараты сериновых протеаз - ал-калаза, трипсин, при этом максимальную СГ обеспечила алкалаза. Гидролизаты, полученные с помощью сериновых протеаз, обладали оптимальными физико-химическими характеристиками, проявляли высокую антиоксидантную и АПФ-ингибиторную активность [6, 67-69]. Протамекс, нейтраза и цистеиновые про-теазы (папаин, бромелаин) гидролизовали коллаген шкур менее интенсивно. Наименьшей способностью к гидролизу коллагена характеризовался пепсин. Применение флавозима при гидролизе свиных шкур позволило получить высокий выход свободных аминокислот, однако даже после длительного гидролиза не обеспечило расщепления основных белков. Таким образом, препараты щелочной сериновой протеазы, прежде всего бактериальный ФП алкалаза, проявляли более высокую гидролитическую активность по отношению к коллагену шкур по сравнению с другими видами протеаз [6, 67]. Сравнение эффективности различных ФП бактериальных эндопептидаз (алка-лаза, нейтраза, протамекс, опытные препараты нейтральной и сериновой протеазы на основе штаммов B. subtilis и B. licheniformis) при гидролизе говяжьего коллагена также показало, что сериновые протеазы более интенсивно гидролизуют субстрат нежели нейтральные [70].

Сравнение способности коллагеназы из гепатопан-креаса камчатского краба, ФП Мегатерин Г10х (металло-протеаза для мясной отрасли на основе B. megaterium), протосубтилина и протеиназы B. pumilus к гидролизу говяжьих жил после замораживания показало, что наиболее интенсивное накопление продуктов гидролиза происходит при использовании ФП Мегатерин Г10х и коллагеназы [71].

Пролилспецифичная эндопептидаза Aspergillus niger -ФП ClarexTM (DSM, США), предназначенная для пивоварения, успешно гидролизовала желатин свиных шкур с образованием большого количества пептидов, содержащих С-концевой пролин, обладающих высокой АПФ-ингибиторной активностью [72].

Алкалаза и коллагеназа эффективно гидролизовали различные виды нативного коллагена в отличие от других видов протеаз, которым для интенсивного гидролиза требовалась предобработка субстратов микроволновым излучением, ультразвуком, высоким давлением, кипячением, раствором фосфорной кислоты [73, 74].

При гидролизе побочных продуктов птицепереработки (трахеи цыпленка, куриный коллаген, продукты обвалки птицы) максимальные значения СГ, растворимости и выхода белка обеспечивала алкалаза, на 2-м месте по эффективности оказался протамекс [61, 75, 76]. Применение термолизина (ФП Corolase 2TS) также было достаточно эффективно и обеспечило максимальный выход АПФ-ингибирующих пептидов [61].

Оптимальным способом получения из побочных продуктов птицепереработки гидролизатов, обладающих биоактивными свойствами, оказалось совместное или последовательное применение сериновых протеаз с флавозимом [76, 77].

Вторичное сырье переработки рыбы

Для получения гидролизатов из отходов переработки рыбы используют широкий ассортимент протеаз из различных источников. Так, флавозим, алкалазу, нейтразу, бромелаин, папаин и трипсин успешно применяли для получения биоактивных пептидов из желатина кожи тилапии. Все исследуемые протеазы обеспечили высокую АПФ-ингибирующую активность гидролизатов. Максимальная антиоксидантная активность отмечена в вариантах с флавозимом, трипсином и алкалазой. Гидролиз бромелаином позволил получить пептиды с наибольшей способностью хелатировать ионы двухвалентного железа [78, 79]. Гидролизаты кожи брюшины желтоперого тунца, полученные с помощью ал-калазы, обладали более сильными антиоксидантными свойствами, чем варианты с протамексом, нейтразой и флавозимом [78, 80]. Высокой антимикробной активностью обладали пептиды, полученные с помощью протамекса из внутренностей атлантической скумбрии, а также из голов, скелетов и внутренностей тилапии. Флавозим использовали для получения из кожи атлантического лосося и тилапии пептидов, обладающих антидиабетической активностью. Пептиды, обладающие иммуномодуляторной и противовоспалительной активностью, получали с помощью алкалазы из желатина кожи азиатского морского окуня и грудного плавника лосося [16, 81]. При гидролизе обезжиренных хребтов лосося различными коммерческими ФП все полученные гидролизаты обладали антиоксидантной и АПФ-ингибиторной активностью. В вариантах обработки трипсином, протамексом и комбинацией бромелаин + папаин наблюдалась максимальная АПФ-ингибиторная, антиоксидантная и антидиабетическая активность соответственно [78].

При гидролизе побочных продуктов переработки атлантического лосося СГ в вариантах с ФП, содержащими сериновые протеазы (алкалаза, Рго1ех 7L, Рготос1 67^), была выше, чем при использовании ФП нейтральных протеаз (нейтраза, Сого!аэе 7089) [82]. Алкалаза была наиболее эффективна по сравнению с другими протеазами при получении низкомолекулярных пептидов, в том числе обладающих антиоксидантными свойствами, из желатина кожи амурского осетра, гигантского сома, морского окуня, минтая, тилапии, карпа, скелетов и кожи лосося, голов и кожи тунца и др. [16, 83]. Применение алкалазы при гидролизе кожи нильского окуня, белого амура и нильской тилапии обеспечило получение всех необходимых функциональных свойств гидролиза-тов (растворимость, эмульгирующая и пенообразующая способность) для применения в пищевой промышленности [84].

При гидролизе белков рыбы часто образуются горькие пептиды, что требует применения препаратов, обладающих одновременно эндо- и экзопептидазной активностью, таких как флавозим [47].

Гидролиз белков молочной сыворотки

Основные белки молочной сыворотки характеризуются компактной глобулярной структурой, которая определяет их относительную устойчивость к протеолизу и требует тщательного подбора высокоактивных ферментов и условий предварительной обработки субстрата для повышения СГ, выхода низкомолекулярных и биоактивных пептидов и снижения антигенности [29, 85].

Согласно исследованиям Т.Н. Головач и В.П. Курченко, основные сывороточные белки (а-ЛА и ß-ЛГ) наиболее интенсивно гидролизуют препараты, содержащие се-риновые протеазы, - трипсин, алкалазу и, в меньшей степени, протосубтилин. Также высокую эффективность при гидролизе концентрата сывороточных белков (КСБ) демонстрирует ФП термостабильной металлопротеазы -термолизин. Несколько менее эффективно действуют нейтраза, флавозим и папаин. Пепсин полностью расщеплял а-ЛА, но не действовал на ß-ЛГ Гидролиз БСА, наоборот, наблюдался только при использовании пепсина. СГ белков молочной сыворотки исследуемыми препаратами убывала в последовательности: термолизин > трипсин > алкалаза > нейтраза > протосубтилин > папаин > пепсин. Максимальное снижение остаточной антигенности в гидролизатах обеспечивало совместное использование трипсина и алкалазы. Термоденатурация субстрата приводила к значительному увеличению количества прогидролизованного алкалазой белка. После тепловой обработки при 80-90-97 °С а-ЛА и БСА гидро-лизовались практически полностью [85]. Гидролиз ß-ЛГ нейтральной протеазой S (Amano Enzyme Inc., Япония) и трипсином способствовал образованию большого количества пептидов, обладающих гипотензивными и антиоксидантными свойствами, в то время как пепсин проявлял наименьшую активность в отношении КСБ [86]. Применение алкалазы обеспечило максимальные СГ, растворимость и накопление низкомолекулярных пептидов при гидролизе концентрата молочных белков в сравнении с протамексом и флавозимом [87]. Гидроли-заты сывороточных белков, полученные с помощью суб-тилизина, проявляли более высокую антиоксидантную активность, чем при использовании нейтразы или про-тамекса. Субтилизин также обеспечил более высокую железовосстанавливающую способность гидролизатов КСБ в сравнении с трипсином, пепсином или флавозимом [88]. Для гидролиза молочных белков успешно использовался ФП Debitrase HYW20 (Biocatalysts Ltd, Великобритания), полученный из A. oryzae и Bacillus spp. и содержащий, помимо бактериальных протеаз, лейцин-аминопептидазу и дипептидиламинопептидазу, расщепляющие связи около остатков пролина [89].

Алкалаза, флавозим и трипсин обеспечивали полное расщепление всех основных белков КСБ после предварительной термообработки в течение 10 мин

при 100 °C. В гидролизатах, полученных с помощью па-паина, наблюдались остаточные количества р-ЛГ и а-ЛА. Максимальные СГ и содержание пептидов, обладающих железосвязывающими свойствами, наблюдались в варианте с алкалазой [90]. Гидролиз КСБ, предобработан-ного микроволновым излучением, с помощью алкалазы, нейтразы, проназы (металлоэндопептидаза миколизин Streptomyces griseus), химотрипсина, папаина, Corolase 7089 и Corolase PN-L 100 (грибная сериновая про-теаза оризин) обеспечил эффективное расщепление всех сывороточных белков [91]. Микроволновая или ультразвуковая предобработка повышала эффективность гидролиза КСБ алкалазой, трипсином, нейтразой, щелочной протеазой оризин и флавозимом. Все виды предобработки приводили к повышению степени горечи в гидролизатах, за исключением гидролизатов, полученных с помощью флавозима и оризина. Образцы, обработанные микроволновым излучением, имели более высокие показатели горечи, чем при использовании ультразвука [92].

Существенному снижению антигенности белков молочной сыворотки способствовало комбинирование различных ФП. Так, последовательная обработка сывороточных белков алкалазой и папаином значительно снижала их иммунную реактивность и улучшала ор-ганолептические свойства гидролизатов. Смеси трип-син-папаин и трипсин-нейтраза оказались наиболее эффективными для удаления из гидролизатов р-ЛГ [29]. Следует отметить, что для устранения антигенных свойств молочных белков требуется сочетание ферментативного гидролиза с технологией мембранной ультрафильтрации и/или нанофильтрации [27].

Ферментативная обработка растительного белоксодержащего сырья

Соевый белок

Для снижения антигенности соевого белка используют ферментативный гидролиз в сочетании с различными физико-химическими способами предобработки, позволяющими увеличить доступность молекул глицинина и р-конглицинина для действия протеаз [33, 93].

Изучение процесса гидролиза белков соевой муки препаратами бактериальных протеаз - Multifect® Neutral, Multifect® P-3000 и Protex™ 6L (Genencor, США) и ФП с доминирующей активностью экзопептидаз на основе штаммов A. oryzae (опытные образцы) показало, что за 3 ч гидролиза бактериальные и грибные ФП примерно в одинаковой степени повышали растворимость соевых белков [36]. Все исследуемые препараты эффективно гидролизовали белок липоксигеназы и р-конглицинина, что подтверждалось данными электрофореза белковых гидролизатов в полиакриламидном геле с додецилсуль-фатом натрия (SDS-PAGE). Наиболее устойчивыми к протеолизу были субъединицы глицинина. Также наблюдалось образование промежуточных продуктов гидролиза и пептидов с ММ <6,5 кДа. Наиболее эффективным оказался препарат сериновой протеазы Protex 6L, который

обеспечил полное исчезновение кислой субъединицы глицинина и значительное снижение интенсивности полосы (на электрофореграмме) основного полипептида глицинина [36]. Как правило, бактериальные протеазы более эффективно, чем грибные, гидролизуют соевые белки. При гидролизе изолята соевого белка нейтраза способствовала более глубокому гидролизу соевых белков по сравнению с Бирзимом П7 - эндопептидазой B. subtilis (ERBSLOH, Германия) и флавозимом [31].

При ферментативной обработке соевых бобов алка-лаза, пепсин и папаин наиболее эффективно расщепляли белки до низкомолекулярных пептидов. В вариантах с алкалазой и пепсином наблюдалась максимальная СГ субстрата. При использовании Сого!аэе 2ТБ (термолизин из B. stearothermophilus) и флавозима белковые полосы при-электрофорезе белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия изменялись незначительно, интенсивность полос, соответствующих субъединицам глицинина, не снижалась. В то же время СГ в данных вариантах, определяемая по количеству расщепленных пептидных связей, была достаточно высока - 8,5%. Наибольшей горечью характеризовались гидролизаты, полученные с помощью алкалазы, умеренная горечь наблюдалась при использовании Сого!аэе 2ТБ, Сого!аэе 7089 и нейтразы. Гидролизаты с наименьшей интенсивностью горечи были получены в вариантах с флавозимом и папаином. Использование пепсина позволило получить гидролизаты с 35-кратным увеличением пенообразующей способности и приятным вкусом [58].

Алкалаза обеспечивает наиболее полный гидролиз основных белков сои, но при этом существенно увеличивает горечь гидролизатов. Для получения продуктов со сниженной горечью успешно используют папаин и флавозим [58].

Предварительная обработка соевых белков высоким давлением, теплом, кислотой, ультразвуком и экструзией приводила к ослаблению структуры соевых белков, что повышало эффективность ферментативного гидролиза [35, 94]. Сравнение процесса ферментативного гидролиза соевого шрота без предобработки и термооб-работанного при низкой и высокой влажности показало, что термообработка при высокой влажности обеспечивает наиболее эффективный гидролиз соевых белков смесью алкалазы с флавозимом [33].

Устойчивость пептидных связей основных соевых белков (р-конглицинина и глицинина) к протеолизу зависит от степени их денатурации: нативные (высокая устойчивость, интактная структура) > тестированные (средняя устойчивость, разрушенные нековалентные связи) > экструдированные (низкая устойчивость, разрушенные нековалентные и дисульфидные связи) [31]. Наиболее сильное денатурирующее воздействие на белки соевого шрота оказывает экструзия. При экструзии разрушаются как нековалентные взаимодействия, так и дисульфид-ные связи, поэтому при обработке экструдированной сои сериновыми протеазами полностью гидролизуется и р-конглицинин, и все субъединицы глицинина [95].

Пшеничный глютен

Из-за высокого содержания пролина, глутамина и метио-нина, образующих целые кластеры в структуре глютена, большинство известных пептидаз не способно эффективно гидролизовать пшеничный глютен, так как он не соответствует их специфичности. Интенсивный гидролиз пшеничных проламинов может осуществляться только ограниченной группой пептидаз, способных гидролизо-вать пептидные связи между остатками пролина, либо за счет комплексного действия экзо- и эндопептидаз [41].

Большинство исследований с использованием таких протеаз, как пепсин, трипсин, папаин, бромелаин, суб-тилизин и др., касалось модификации глютена с сохранением больших фрагментов белковых молекул, но некоторые работы были посвящены получению низкомолекулярных пептидов со сниженной аллергенно-стью [96].

При гидролизе глютена препаратами алкалаза, трипсин (PTN 6.0S), пепсин, панкреатин, нейтраза и про-тамекс максимальная СГ и выход растворимого белка были получены при использовании алкалазы. ММ белков и пептидов в гидролизатах была ниже 40 кДа. Во всех вариантах, кроме пепсина, наблюдалась полоса нерасщепленного белка с ММ около 36,5 кДа. В варианте с пепсином осталось большое количество нерасщепленных пептидов с ММ <30 кДа. Алкалаза обеспечивала наиболее полный гидролиз пшеничного глютена до пептидов с ММ <10 кДа [96]. Термолизин из B. thermoproteolyticus и субтилизин из B. licheniformis интенсивно расщепляли пшеничный глиадин с образованием пептидов с ММ <15 кДа [43].

При обработке пшеничного глютена флавозим обеспечивал более эффективный гидролиз по сравнению с алкалазой и протамексом благодаря совместному действию экзо- и эндопротеаз. Конечная СГ через 24 ч гидролиза алкалазой, флавозимом и протамексом составила соответственно 26, 54 и 36% [97]. Максимальная СГ пшеничного глютена при использовании флавозима и смесей флавозим + алкалаза, флавозим + алкалаза + Marugoto E (протеаза B. licheniformis), флавозим + алкалаза + протамекс + Marugoto наблюдалась в вариантах с наибольшим количеством компонентов. Обработка субстрата избыточным давлением 300 МПа позволила увеличить СГ. Мультиферментная обработка глютена способствовала образованию низкомолекулярных пептидов с ММ <5 кДа [98].

В гидролизатах пшеничного глютена, полученных с помощью нейтразы, папаина, алкалазы, трипсина и Proteax (комплекс экзо- и эндопептидаз на A. ory-zae, Amano Enzyme Inc, Япония), наблюдался различный уровень горечи, которая проявлялась в вариантах с эндопептидазами при СГ более 9% и увеличивалась с повышением СГ. Наиболее интенсивной горечью характеризовались короткоцепочечные пептиды, полученные в результате действия алкалазы и нейтразы, и, в несколько меньшей степени, длинноцепочечные пептиды, полученные с помощью папаина и трипсина. Снижению горечи ги-дролизатов и повышению СГ способствовала 2-часовая

обработка флавозимом гидролизатов, полученных с помощью трипсина, алкалазы и нейтразы. Наилучшими характеристиками обладали гидролизаты пшеничного глю-тена, полученные в результате 5 ч гидролиза препаратом Рго1еах. В них обнаруживали максимальное количество пептидов с ММ 180-500 Да и сниженную горечь. Дипеп-тидилпептидаза DPPIV из A. oryzae и аспергиллопепсин из A. niger по отдельности не разрушали иммунотоксич-ные эпитопы глютена, но их совместное применение позволило снизить его иммуногенность [41, 99].

Предварительная экструзионная обработка повысила эффективность гидролиза пшеничного глютена панкреатином: существенно увеличились СГ и выход растворимого белка в гидролизатах, значительно возросли доля пептидов с ММ <5 кДа и содержание свободных незаменимых аминокислот [100, 101]. Сравнивали эффективность гидролиза пшеничного глютена и его экструдата препаратами грибных протеаз: флавозим, Протоферм РР (продуцент A. niger, Китай) и КФПА (комплекс экзо-и эндопептидаз A. oryzae, лабораторный образец). Наименее эффективным оказался Протоферм РР, наибольшую способность к расщеплению белков как натив-ного, так и экструдированного глютена проявил КФПА. На электрофореграммах гидролизатов проэкструди-рованного глютена отсутствовали белковые полосы, соответствующие основным субъединицам глиадина и глютенина [100].

Заключение

Таким образом, наиболее интенсивное расщепление основных видов белковых субстратов обеспечивали сериновые протеазы, в большинстве экспериментов бактериального происхождения. В ряде случаев применение металло- и цистеиновых протеаз также позволяло получить гидролизаты, обладающие требуемыми характеристиками.

Для увеличения СГ и получения максимального количества низкомолекулярных пептидов рекомендуется комбинирование нескольких протеаз, предпочтительно сериновых эндопептидаз с грибными экзопептидазами. Применение экзопептидаз также способствует снятию горечи и приданию биоактивных и положительных ор-ганолептических свойств гидролизатам. При гидролизе глютена и коллагена возможно использование специфических протеаз, способных гидролизовать белки с высоким содержанием остатков пролина.

Повышению СГ большинства субстратов способствует физико-химическая предобработка. Для животных белков (коллаген, белки молочной сыворотки) может быть рекомендована предварительная термообработка для денатурации основных белков и повышения их атакуе-мости протеазами. Для растительного сырья (соя, пшеничный глютен) наиболее эффективно использование экструзионных технологий.

Сведения об авторах

ВНИИПБТ - филиал ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация): Костылева Елена Викторовна (Elena V. Kostyleva) - кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии новых продуцентов гидролитических ферментов E-mail: ekostyleva@list.ru https://orcid.org/0000-0002-4775-303X

Середа Анна Сергеевна (Anna S. Sereda) - кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии новых продуцентов гидролитических ферментов E-mail: as.sereda@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-9097-3946

Великорецкая Ирина Александровна (Irina A. Velikoretskaya) - научный сотрудник лаборатории биотехнологии новых продуцентов гидролитических ферментов E-mail: smirnova_i.a@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-1851-1127

Курбатова Елена Ивановна (Elena I. Kurbatova) - кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник отдела биотехнологии ферментов, дрожжей, органических кислот и БАД E-mail: elena_kurbatova@list.ru https://orcid.org/0000-0002-5781-5548

Цурикова Нина Васильевна (Nina V. Tsurikova) - кандидат технических наук, заведующий лабораторией биотехнологии новых продуцентов гидролитических ферментов E-mail: nina.tsurikova@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-9609-0818

Литература

1. Гиро Т.М., Старшинов Р.В. Технология переработки не пищевого сырья животного происхождения // Наилучшие доступные технологии. Применение в различных отраслях промышленности : сборник. Москва : Перо, 2017. С. 130-133. ISBN 978-5-906927-59-0.

2. Jayathilakan K., Sultana K., Radhakrishna K., Bawa A.S. Utilization of byproducts and waste materials from meat, poultry and fish processing

industries: a review // J. Food Sci. Technol. 2012. Vol. 49, No 3. P. 278-293. DOI: https://doi.org/10.1007/s13197-011-0290-7 3. Mora L., Toldra-Reig F., Reig M., Toldra F. Possible Uses of Processed Slaughter Byproducts // Sustainable Meat Production and Processing / ed. C.M. Galanakis. London : Academic Press, 2019. P. 145-160. DOI: https:// doi.org/10.1016/B978-0-12-814874-7.00008-0 ISBN 9780128148747

4. León-López A., Morales-Peñaloza A., Martínez-Juárez V.M., Vargas-Torres A., Zeugolis D.I., Aguirre-Álvarez G. Hydrolyzed collagen-sources and applications // Molecules. 2019. Vol. 24, N 22. P. 4031. 25. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules24224031

5. Gulevsky A.K., Shcheniavsky I.I. Collagen: structure, metabolism, production and industrial application // Biotechnol. Acta. 2020. Vol. 13, 26. N 5. P. 42-61. https://doi.org/10.15407/biotech13.05.042

6. Hong G.P., Min S.G., Jo Y.J. Anti-oxidative and anti-aging activities of porcine by-product collagen hydrolysates produced by commercial proteases: effect of hydrolysis and ultrafiltration // Molecules. 2019. 27. Vol. 24, N 6. P. 1104. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules24061104

7. Bhagwat P.K., Dandge P.B. Collagen and collagenolytic proteases: A review // Biocatal. Agric. Biotechnol. 2018. Vol. 15. P. 43-55. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bcab.2018.05.005

8. Vidal A.R., Ferreira T.E., Mello R.D.O., Schmidt M.M., Kubota E.H., 28. Demiate I.M. et al. Effects of enzymatic hydrolysis (Flavourzyme®) assisted by ultrasound in the structural and functional properties

of hydrolyzates from different bovine collagens // Food Sci. Technol. 29. 2018. Vol. 38, suppl. 1. P. 103-108. DOI: https://doi.org/10.1590/ fst.16717

9. Pakbin B., Allahyari S., Dibazar S.P., Brück W.M., Vahidi R., Mahmoudi R. et al. Production of bovine collagen hydrolysate with 30. antioxidant activity; optimized by response surface methodology //

Sci. Pharm. 2022. Vol. 90, N 4. Р. 62. DOI: https://doi.org/10.3390/ scipharm90040062

10. Qi L., Zhang H., Guo Y., Zhang C., Xu Y. A novel calcium-binding 31. peptide from bovine bone collagen hydrolysate and chelation mechanism

and calcium absorption activity of peptide-calcium chelate // Food Chem. 2023. Vol. 410. Article ID 135387. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.foodchem.2023.135387

11. Hu G., Wang D., Sun L., Su R., Corazzin M., Sun X. et al. Isolation, 32. purification and structure identification of a calcium-binding peptide from sheep bone protein hydrolysate // Foods. 2022. Vol. 11, N 17.

Р. 2655. DOI: https://doi.org/10.3390/foods11172655

12. Dybka K., Walczak P. Collagen hydrolysates as a new diet supplement // Biotechnol. Food Sci. 2009. Vol. 73. P. 83-92. 33.

13. Holwerda A.M., van Loon L.J.C. The impact of collagen protein ingestion on musculoskeletal connective tissue remodeling: a narrative review // Nutr. Rev. 2022. Vol. 80, N 6. P. 1497-1514. DOI: https://doi. 34. org/10.1093/nutrit/nuab083

14. Lupu M.A., Gradisteanu Pircalabioru G., Chifiriuc M.C., Albulescu R., Tanase C. Beneficial effects of food supplements based on hydrolyzed collagen for skin care (review) // Exp. Ther. Med. 2020. Vol. 20, N 1. 35. P. 12-17. DOI: https://doi.org/10.3892/etm.2019.8342

15. Välimaa A.-L., Mäkinen S., Mattila P., Marnila P., Pihlanto A., Mäki M. et al. Fish and fish side streams are valuable sources of high- 36. value components // Food Qual. Saf. 2019. Vol. 3, N 4. P. 209-226. DOI: https://doi.org/10.1093/fqsafe/fyz024

16. Zamora-Sillero J., Gharsallaoui A., Prentice C. Peptides from fish by-product protein hydrolysates and its functional properties: an 37. overview // Mar. Biotechnol. (N.Y.). 2018. Vol. 20, N 2. P. 118-130. DOI: https://doi.org/10.1007/s10126-018-9799-3

17. Ananey-Obiri D., Matthews L.G., Tahergorabi R. Proteins from fish processing by-products // Proteins: Sustainable Source, Processing and 38. Applications / ed. C.M. Galanakis. London : Academic Press, 2019.

P. 163-191. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-816695-6.00006-4 ISBN 9780128166956, 39.

18. Abuine R., Rathnayake A.U., Byun H.G. Biological activity of peptides purified from fish skin hydrolysates // Fish Aquatic Sci. 2019. Vol. 22.

P. 10. DOI: https://doi.org/10.1186/s41240-019-0125-4 40.

19. Behera A., Das R., Patnaik P., Mohanty J., Mohanty G. A review on fish peptides isolated from fish waste with their potent bioactivities //

J. Appl. Biol. Biotechnol. 2022. Vol. 10, N 3. P. 195-209. DOI: https:// 41. doi.org/10.7324/JABB.2022.100323

20. Tian Q., Li S.-M., Li B. The Pro-Gly or Hyp-Gly containing peptides from absorbates of fish skin collagen hydrolysates inhibit platelet aggregation and target P2Y12 receptor by molecular docking // Foods. 2021. Vol. 10, N 7. P. 1553. DOI: https://doi.org/10.3390/foods10071553 42.

21. Pires A.F., Marnotes N.G., Rubio O.D., Garcia A.C., Pereira C.D. Dairy by-products: A review on the valorization of whey and second cheese whey // Foods. 2021. Vol. 10, N 5. P. 1067. DOI: https://doi. org/10.3390/foods10051067 43.

22. Eberhardt A., López E.C., Marino F., Mammarella E.J., Manzo R.M., Sihufe G.A. Whey protein hydrolysis with microbial proteases: Determination of kinetic parameters and bioactive properties for different reaction conditions // Int. J. Dairy Technol. 2021. Vol. 74, 44. N 3. P. 489-504. DOI: https://doi.org/10.1111/1471-0307.12795

23. Deeth H., Bansal N. Whey proteins: an overview // Whey Proteins: from Milk to Medicine. San Diego : Academic Press, 2019. P. 1-50. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-812124-5.00001-1 ISBN 9780128121245. 45.

24. Рытченкова О.В., Красноштанова А.А. Оптимизация процесса получения ферментативных гидролизатов белков молочной

сыворотки с применением протеолитических ферментов // Фундаментальные исследования. 2011. № 8. С. 663—666. Minj S., Anand S. Whey proteins and its derivatives: bioactivity, functionality, and current applications // Dairy. 2020. Vol. 1, N 3. P. 233-258. DOI: https://doi.org/10.3390/dairy1030016 Bu G., Luo Y., Chen F., Liu K., Zhu T. Milk processing as a tool to reduce cow's milk allergenicity: A mini-review // Dairy Sci. Technol. 2013. Vol. 93, N 3. P. 211-223. DOI: https://doi.org/10.1007/s13594-013-0113-x

Зорин С.Н., Петров Н.А., Борисов А.Ю. Ферментолизаты белка молочной сыворотки: получение, физико-химическая и имму-нохимическая характеристика // Пищевая промышленность. 2019. № 4. С. 41-43. DOI: https://doi.org/10.24411/0235-2486-2019-10020

Ghosh B.C., Prasad L.N., Saha N.P. Enzymatic hydrolysis of whey and its analysis // J. Food Sci. Technol. 2017. Vol. 54, N 6. P. 1476-1483. DOI: https://doi.org/10.1007/s13197-017-2574-z

Abd El-Salam M.H., El-Shibiny S. Preparation, properties and uses of enzymatic milk protein hydrolysates // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2017. Vol. 57, N 6. P. 1119-1132. DOI: https://doi.org/10.1080/10408398.201 4.899200

Асраркулова А.С., Булушова Н.В. Пшеничный глютен и его гидролизаты. Возможные направления практического использования: обзор // Биотехнология. 2018. Т. 34, № 4. С. 6-17. DOI: https://doi.org/10.21519/0234-2758-2018-34-4-6-17 Милорадова Е.В., Иванушкин П.А., Ананьев А.А., Траубен-берг С.Е., Софьин А.В. Сравнительное изучение ферментативных гидролизатов изолированного соевого белка и соевой муки методом SE-HPLC // Тонкие химические технологии. 2010. Т. 5, № 2. С. 82-88.

Liang Y., Guo Y., Zheng Y., Liu S., Cheng T., Zhou L. et al. Effects of high-pressure homogenization on physicochemical and functional properties of enzymatic hydrolyzed soybean protein concentrate // Front. Nutr. 2022. Vol. 9. Article ID 1054326. DOI: https://doi. org/10.3389/fnut.2022.1054326

Fischer M. Limiting factors for the enzymatic accessibility of soybean protein. Ph.D. Thesis. Netherlands : Wageningen University, 2006. 155 p. ISBN 9789085044963 - 139

Basson A.R., Ahmed S., Almutairi R., Seo B., Cominelli F. Regulation of intestinal inflammation by soybean and soy-derived compounds // Foods. 2021. Vol. 10, N 4. Р. 774. DOI: https://doi.org/10.3390/ foods10040774

Zilic S., Bozovic I., Hadzi-Taskovic Sukalovic V. Thermal inactivation of soybean bioactive proteins // Int. J. Food Eng. 2012. Vol. 8, N 4. P. 14. DOI: https://doi.org/10.1515/1556-3758.2521

Jung S., Roussel-Philippe C., Briggs J.L., Murphy P.A., Johnson L.A. Limited hydrolysis of soy proteins with endo- and exoproteases // JAOCS. 2004. Vol. 81. P. 953-960. DOI: https://doi.org/10.1007/ s11746-004-1007-3

Islam M., Huang Y., Islam S., Fan B., Tong L., Wang F. Influence of the degree of hydrolysis on functional properties and antioxidant activity of enzymatic soybean protein hydrolysates // Molecules. 2022. Vol. 27. Р. 6110. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules27186110 Chatterjee C., Gleddie S., Xiao C.W. Soybean bioactive peptides and their functional properties // Nutrients. 2018. Vol. 10, N 9. P. 1211. DOI: https://doi.org/10.3390/nu10091211

Kim I.S., Yang W.S., Kim C.H. Beneficial effects of soybean-derived bioactive peptides // Int. J. Mol. Sci. 2021. Vol. 22, N 16. P. 8570. DOI: https://doi.org/10.3390/yms22168570

Sun X.D. Enzymatic hydrolysis of soy proteins and the hydrolysates utilization // Int. J. Food Sci. Technol. 2011. Vol. 46, N 12. P. 24472459. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.2011.02785.x Dunaevsky Y.E., Tereshchenkova V.F., Belozersky M.A., Filippova I.Y., Oppert B., Elpidina E.N. Effective degradation of gluten and its fragments by gluten-specific peptidases: A review on application for the treatment of patients with gluten sensitivity // Pharmaceutics. 2021. Vol. 13, N 10. Р. 1603. DOI: https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13101603 Delcour J.A., Joye I.J., Pareyt B., Wilderjans E., Brij s K., Lagrain B. Wheat gluten functionality as a quality determinant in cereal-based food products // Annu. Rev. Food Sci. Technol. 2012. Vol. 3. P. 469492. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev-food-022811-101303 Pourmohammadi K., Abedi E. Hydrolytic enzymes and their directly and indirectly effects on gluten and dough properties: An extensive review // Food Sci. Nutr. 2021. Vol. 9, N 7. P. 3988-4006. DOI: https:// doi.org/10.1002/fsn3.2344

Cruz-Chamorro I., Álvarez-Sánchez N., Santos-Sánchez G., Pedroche J., Fernández-Pachón M.S., Millán F. et al. Immunomodulatory and antioxidant properties of wheat gluten protein hydrolysates in human peripheral blood mononuclear cells // Nutrients. 2020. Vol. 12, N 6. P. 1673. DOI: https://doi.org/10.3390/nu12061673 Raksakulthai R., Haard N.F. Exopeptidases and their application to reduce bitterness in food: A review // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2003. Vol. 43, N 4. Р. 401-445. DOI: https://doi.org/10.1080/10408690390826572

46. Fu Y., Chen J., Bak K.H., Lametsch R. Valorisation of protein 66. hydrolysates from animal by-products: perspectives on bitter taste and debittering methods: A review // Int. J. Food Sci. Technol. 2019. Vol. 54,

N 4. P. 978-986. DOI: https://doi.org/10.1111/yfs.14037

47. Idowu A.T., Benjakul S. Bitterness of fish protein hydrolysate and its 67. debittering prospects // J. Food Biochem. 2019. Vol. 43, N 9. Article

ID e12978. DOI: https://doi.org/10.1111/jfbc.12978

48. Лысенко Л.А., Немова Н.Н., Канцерова Н.П. Протеолитическая регуляция биологических процессов. Петрозаводск : Карель- 68. ский научный центр РАН, 2011. 482 с.

49. Solanki P., Putatunda C., Kumar A., Bhatia R., Walia A. Microbial proteases: ubiquitous enzymes with innumerable uses // 3 Biotech. 2021. Vol. 11, N 10. P. 428. DOI: https://doi.org/10.1007/s13205-021-02928-z

50. Industrial Enzymes: Structure, Function, and Applications / 69. eds J. Polaina, A.P. MacCabe. Dordrecht : Springer, 2007. 281 p. DOI: https://doi.org/10.1007/1-4020-5377-0 ISBN 978-1-4020-5376-4.

51. Wu J.W., Chen X.L. Extracellular metalloproteases from bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011. Vol. 92, N 2. P. 253-262. 70. DOI: https://doi.org/10.1007/s00253-011-3532-8

52. Зинина О.В., Соловьева А.А., Ребезов Я.М., Тарасова И.В., Окус-ханова Э.К. Ферменты в мясной отрасли пищевой промышленности // Международный студенческий научный вестник. 2015.

№ 6. С. 1-7. URL: https://eduherald.ru/ru/article/view?id=14245 71. (дата обращения: 20.09.2022).

53. Баженова Б.А., Данилов А.М. Получение ферментного раствора из говяжьего цельного сычуга для модификации свойств коллагенсодержащего рубца // Теория и практика переработки 72. мяса. 2017. Т. 2, № 4, P. 62-75. DOI: https://doi.org/10.21323/2414-438X-2017-2-4-62-75

54. Сухих С.А., Бабич О.О., Ульрих Е.В. Изучение коллагеназной активности ферментов микробного, растительного и животного происхождения // АгроЭкоИнженерия. 2021. № 2 (107). 73. С. 142-148. DOI: https://doi.org/10.24412/2713-2641-2021-2107-142-

148

55. Lukin A.A. Application and comparison of proteolytic enzyme preparations in technology of protein hydrolyzates // Food Sci. Technol. 74. 2020. Vol. 40, suppl. 1. P. 287-292. DOI: https://doi.org/10.1590/ fst.09319

56. Schlegel K., Sontheimer K., Hickisch A., Wani A.A., Eisner P., Schweiggert-Weisz U. Enzymatic hydrolysis of lupin protein isolates -changes in the molecular weight distribution, techno-functional 75. characteristics, and sensory attributes // Food Sci. Nutr. 2019. Vol. 7,

N 8. P. 2747-2759. DOI: https://doi.org/10.1002/fsn3.1139

57. Ou J.-F., Zhu M.-J. An overview of current and novel approaches for microbial neutral protease improvement // Int. J. Mod. Biol. Med. 2012.

Vol. 2, N 1. P. 1-31. 76.

58. Meinlschmidt P., Sussmann D., Schweiggert-Weisz U., Eisner P. Enzymatic treatment of soy protein isolates: effects on the potential allergenicity, techno-functionality, and sensory properties // Food Sci. 77. Nutr. 2015. Vol. 4, N 1. P. 11-23. DOI: https://doi.org/10.1002/fsn3.253

59. Zinchenko D.V., Muranova T.A., Melanyina L.A., Belova N.A., Miroshnikov A.I. Soy and rapeseed protein hydrolysis by the enzyme preparation protosubtilin // Appl. Biochem. Microbiol. 2018. Vol. 54.

P. 294-300. DOI: https://doi.org/10.1134/S000368381803016X 78.

60. Tavano O.L., Berenguer-Murcia A., Secundo F., Fernandez-Lafuente R. Biotechnological applications of proteases in food technology // Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2018. Vol. 17, N 2. P. 412-436. DOI: https://doi.org/10.1111/1541-4337.12326 79.

61. Lindberg D., Kristoffersen K.A., de Vogel-van den Bosch H., Wub-shet S.G., Bocker U., Rieder A. et al. Effects of poultry raw material variation and choice of protease on protein hydrolysate quality // Process Biochem. 2021. Vol. 110. P. 85-93. DOI: https://doi.org/10.1016/ 80. j.procbio.2021.07.014

62. Merz M., Eisele T., Berends P., Appel D., Rabe S., Blank I. et al. Flavourzyme, an enzyme preparation with industrial relevance: automated nine-step purification and partial characterization of eight 81. enzymes // J. Agric. Food Chem. 2015. Vol. 63, N 23. P. 5682-5693. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.5b01665

63. Morais H.A., Silvestre M.P., Amorin L.L., Silva V.D.M., Silva M.R., 82. Silva A.C.S. et al. Use of different proteases to obtain whey protein concentrate hydrolysates with inhibitory activity toward angiotensin-converting enzyme // J. Food Biochem. 2014. Vol. 38, N 1. P. 102-109. DOI: https://doi.org/10.1111/jfbc.12032

64. Senevirathne M., Kim S.H., Jeon Y.J. Protective effect of enzymatic 83. hydrolysates from highbush blueberry (Vaccinium corymbosum L.) against hydrogen peroxide-induced oxidative damage in Chinese hamster lung fibroblast cell line // Nutr. Res. Pract. 2010. Vol. 4, N 3.

P. 183-190. DOI: https://doi.org/10.4162/nrp.2010.4.3.183

65. Pasupuleti V.K., Braun S. State of the art manufacturing of protein 84. hydrolysates // Protein Hydrolysates in Biotechnology / eds

V. Pasupuleti, A. Demain. Dordrecht : Springer, 2010. P. 11-32. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4020-6674-0_2 ISBN 978-1-40206673-3.

Hong H., Fan H., Chalamaiah M., Wu J. Preparation of low-molecular-weight, collagen hydrolysates (peptides): Current progress, challenges, and future perspectives // Food Chem. 2019. Vol. 301. Article ID 125222. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.125222 Yang H., Xue Y., Liu J., Song S., Zhang L., Song Q. et al. Hydrolysis process optimization and functional characterization of yak skin gelatin hydrolysates // J. Chem. 2019. Vol. 2019. Article ID 9105605. DOI: https://doi.org/10.1155/2019/9105605

León-López A., Fuentes-Jiménez L., Hernández-Fuentes A.D., Campos-Montiel R.G., Aguirre-Álvarez G. Hydrolysed collagen from sheepskins as a source of functional peptides with antioxidant activity // Int. J. Mol. Sci. 2019. Vol. 20, N 16. Р. 3931. DOI: https://doi. org/10.3390/ijms20163931

Feng M., Betti M. Transepithelial transport efficiency of bovine collagen hydrolysates in a human Caco-2 cell line model // Food Chem. 2017. Vol. 224. P. 242-250. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.foodchem.2016.12.044

Костылева Е.В., Середа А.С., Великорецкая И.А., Цурикова Н.В. Сравнение эффективности различных препаратов бактериальных протеаз при гидролизе коллагена // Пищевая промышленность. 2021. № 11. С. 67-69. DOI: https://doi.org/10.52653/ PPI.2021.11.11.010

Юнусов Э.Ш., Пономарев В.Я., Морозова С.А., Ежкова Г.О. Изучение гидролиза коллагенсодержащего сырья протеолитиче-скими ферментами // Вестник технологического университета. 2016. Т. 19, № 24. С. 168-170.

O'Keeffe M.B., Norris R., Alashi M.A., Aluko R.E., FitzGerald R.J. Peptide identification in a porcine gelatin prolyl endoproteinase hydrolysate with angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory and hypotensive activity // J. Funct. Foods. 2017. Vol. 34. P. 77-88. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jff.2017.04.018

Zhang Y., Olsen K., Grossi A., Otte J. Effect of pretreatment on enzymatic hydrolysis of bovine collagen and formation of ACE-inhibitory peptides // Food Chem. 2013. Vol. 141, N 3. P. 2343-2354. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2013.05.058 Lin Y.J., Le G.W., Wang J.Y., Li Y.X., Shi Y.H., Sun J. Antioxidative peptides derived from enzyme hydrolysis of bone collagen after microwave assisted acid pre-treatment and nitrogen protection // Int. J. Mol. Sci. 2010. Vol. 11, N 11. P. 4297-4308. DOI: https://doi. org/10.3390/ims11114297

Pramualki ja T., Pirak T., Euston S.R. Valorization of chicken slaughterhouse by-products: Production and properties of chicken trachea hydrolysates using commercial proteases // Int. J. Food Prop. 2021. Vol. 24, N 1. P. 1642-1657. DOI: https://doi.org/10.1080/1094291 2.2021.1986522

Nchienzia H.A., Morawicki R.O., Gadang V.P. Enzymatic hydrolysis of poultry meal with endo- and exopeptidases // Poult. Sci. 2010. Vol. 89, N 10. P. 2273-2280. DOI: https://doi.org/10.3382/ps.2008-00558 Khiari Z., Ndagi imana M., Betti M. Low molecular weight bioactive peptides derived from the enzymatic hydrolysis of collagen after isoelectric solubilization/precipitation process of turkey by-products // Poult. Sci. 2014. Vol. 93, N 9. P. 2347-2362. DOI: https://doi. org/10.3382/ps.2014-03953

Korczek K., Tkaczewska J., Migdai W. Antioxidant and antihypertensive protein hydrolysates in fish products - a review // Czech J. Food Sci. 2018. Vol. 36, N 3. P. 195-207. DOI: https://doi.org/10.17221/283/2017-CJFS

Choonpicharn S., Jaturasitha S., Rakariyatham N., Suree N., Niamsup H. Antioxidant and antihypertensive activity of gelatin hydrolysate from Nile tilapia skin // J. Food Sci. Technol. 2015. Vol. 52, N 5. P. 3134-3139. DOI: https://doi.org/10.1007/s13197-014-1581-6 Han Y., Byun S.-H., Park J.-H., Kim S.-B. Bioactive properties of enzymatic hydrolysates from abdominal skin gelatin of yellowfin tuna (Thunnus albacares) // Int. J. Food Sci. Technol. 2015. Vol. 50. P. 1996-2003. DOI: https://doi.org/10.1111/ifs.12890 Fernandes P. Enzymes in fish and seafood processing // Front. Bioeng. Biotechnol. 2016. Vol. 4. Р. 59. DOI: https://doi.org/10.3389/ fbioe.2016.00059

Aspevik T., Egede-Nissen H., Oterhals L. A systematic approach to the comparison of cost efficiency of endopeptidases for the hydrolysis of Atlantic salmon (Salmo salar) by-products // Food Technol. Biotechnol. 2016. Vol. 54, N 4. P. 421-431. DOI: https://doi.org/10.17113/ ftb.54.04.16.4553

Tacias-Pascacio V.G., Morellon-Sterling R., Siar E.H., Tavano O., Berenguer-Murcia Á., Fernandez-Lafuente R. Use of alcalase in the production of bioactive peptides: A review // Int. J. Biol. Macromol. 2020. Vol. 165, pt B. P. 2143-2196. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.ibiomac.2020.10.060

Wasswa J., Tang J., Gu X. Functional properties of grass carp (Ctenopharyngodon Idella), Nile perch (Lates Niloticus) and Nile tilapia (Oreochromis Niloticus) skin hydrolysates // Int. J. Food Prop. 2008. Vol. 11,N2. P.339-350.DOI:https://doi.org/10.1080/10942910701381188

85. Головач Т.Н., Курченко В.П. Гидролиз белков молока ферментными препаратами и протеолитическими системами молочнокислых бактерий // Труды БГУ. 2012. Т. 7, ч. 1. С. 106-126. 94.

86. Jeewanthi R.K., Kim M.H., Lee N.K., Yoon Y.C., Paik H.D. Peptide analysis and the bioactivity of whey protein hydrolysates from cheese whey with several enzymes // Korean J. Food Sci. Anim. Resour. 2017. 95. Vol. 37, N 1. P. 62-70. DOI: https://doi.org/10.5851/kosfa.2017.37.1.62

87. Cui Q., Sun Y., Zhou Z., Cheng J., Guo M. Effects of enzymatic hydrolysis on physicochemical properties and solubility and bitterness of milk protein hydrolysates // Foods. 2021. Vol. 10, N 10. Р. 2462. DOI: https://doi.org/10.3390/foods10102462 96.

88. Corrochano A.R., Buckin V., Kelly P.M., Giblin L. Invited review: Whey proteins as antioxidants and promoters of cellular antioxidant pathways // J. Dairy Sci. 2018. Vol. 101, N 6. P. 4747-4761. DOI: https:// doi.org/10.3168/jds.2017-13618 97.

89. Kleekayai T., Le Gouic A.V., Deracinois B., Cudennec B., FitzGerald R.J. In vitro characterization of the antioxidative properties ofwhey protein hydrolysates generated under pH- and non pH-controlled conditions // Foods. 2020. Vol. 9, N 5. P. 582. DOI: https://doi. 98. org/10.3390/foods9050582

90. Kim S.B., Seo I.S., Khan A., Ki K.S., Lee W.S., Lee H.J. et al. Enzymatic hydrolysis of heated whey: Iron-binding ability of peptides 99. and antigenic protein fractions // J. Dairy Sci. 2007. Vol. 90, N 9.

P. 4033-4042. DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2007-0228

91. Izquierdo F.J., Peñas E., Baeza M.L., Gomez R. Effects of combined microwave and enzymatic treatments on the hydrolysis and 100. immunoreactivity of dairy whey proteins // Int. Dairy J. 2008. Vol. 18,

N 9. P. 918-922. DOI: https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2008.01.005

92. Uluko H., Zhang S., Liu L., Chen J., Sun Y., Su Y. et al. Effects of microwave and ultrasound pretreatments on enzymolysis of milk protein concentrate with different enzymes // Int. J. Food Sci. Technol. 2013. Vol. 48, N 11. P. 2250-2257. DOI: https://doi.org/10.1111/ 101. ijfs.12211

93. Ma W., Qi B., Sami R., Jiang L., Li Y., Wang H. Conformational and functional properties of soybean proteins produced by extrusion-

hydrolysis approach // Int. J. Anal. Chem. 2018. Vol. 2018. Article ID 9182508. P. 1-11. DOI: https://doi.org/10.1155/2018/9182508 Jung S., Mahfuz A. Structure, protein interactions and in vitro protease accessibility of extruded and pressurized full-fat soybean flakes // J. Am. Oil Chem. Soc. 2009. Vol. 86. P. 475-483.

Середа А.С., Костылева Е.В., Шариков А.Ю., Смирнова И.А., Нефедова Л.И., Иванов В.В. и др. Разработка комбинированной технологии получения соевых кормовых добавок на основе экструзии и ферментативного гидролиза // Кормопроизводство. 2015. № 10. С. 28-33.

Kong X.G., Zhou H., Qian H. Enzymatic hydrolysis of wheat gluten by proteases and properties of the resulting hydrolysates // Food Chem. 2007. Vol. 102, N 3. P. 759-763. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.foodchem.2006.06.062

Koo S.H., Bae I.Y., Lee S., Lee D.H., Hur B.S., Lee H.G. Evaluation of wheat gluten hydrolysates as taste-active compounds with antioxidant activity // J. Food Sci. Technol. 2014. Vol. 51, N 3. P. 535-542. DOI: https://doi.org/10.1007/s13197-011-0515-9

Kim N. Production of wheat gluten hydrolyzates by enzymatic process at high pressure // Food Sci. Biotechnol. 2017. Vol. 26, N 6. Р. 15871593. DOI: https://doi.org/10.1007/s10068-017-0152-9 Liu B., Kexue Z., Peng W., Xiao-Na Guo X., Zhou H. Effect of sequential hydrolysis with endo- and exo-peptidase on bitterness properties of wheat gluten hydrolysates // RSC Adv. 2016. Vol. 6. P. 27 659-27 668. DOI: https://doi.org/10.1039/C5RA28171G Шариков А.Ю., Соколова Е.Н., Амелякина М.В., Юраскина Т.В., Иванов В.В., Серба Е.М. Разработка концепции производства снеков из пшеницы с элиминацией глютена биокаталитическим методом // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий (ВГУИТ). 2020. Т. 82, № 4. С. 77-83. DOI: https://doi.org/10.20914/2310-1202-2020-4-77-83 Cui C., Zhao H., Zhao M., Chai H. Effects of extrusion treatment on enzymatic hydrolysis properties of wheat gluten // J. Food Process Eng. 2011. Vol. 34, N 2. P. 187-203. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1745-4530.2008.00348.x

References

1. Giro T.M., Starshinov R.V. Processing technology of non-food raw materials of animal origin. In: The Best Available Technologies. Application in Various Industries. Moscow: Pero, 2017: 130—3. (in Russian) 12.

2. Jayathilakan K., Sultana K., Radhakrishna K., Bawa A.S. Utilization

of byproducts and waste materials from meat, poultry and fish process- 13. ing industries: a review. J Food Sci Technol. 2012; 49 (3): 278-93. DOI: https://doi.org/10.1007/s13197-011-0290-7

3. Mora L., Toldra-Reig F., Reig M., Toldrá F. Possible Uses of Processed Slaughter Byproducts. In: C.M. Galanakis (ed.). Sustainable Meat 14. Production and Processing. London: Academic Press, 2019: 145-60. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-814874-7.00008-0 ISBN 9780128148747

4. León-López A., Morales-Peñaloza A., Martínez-Juárez V.M., Vargas- 15. Torres A., Zeugolis D.I., Aguirre-Álvarez G. Hydrolyzed collagen-sources and applications. Molecules. 2019; 24 (22): 4031. DOI: https:// doi.org/10.3390/molecules24224031

5. Gulevsky A.K., Shcheniavsky I.I. Collagen: structure, metabolism, pro- 16. duction and industrial application. Biotechnol Acta. 2020; 13 (5): 42-61. https://doi.org/10.15407/biotech13.05.042

6. Hong G.P., Min S.G., Jo Y.J. Anti-oxidative and anti-aging activities

of porcine by-product collagen hydrolysates produced by commercial 17. proteases: effect of hydrolysis and ultrafiltration. Molecules. 2019; 24 (6): 1104. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules24061104

7. Bhagwat P.K., Dandge P.B. Collagen and collagenolytic proteases: A review. Biocatal Agric Biotechnol. 2018; 15: 43-55. DOI: https://doi. org/10.1016/j.bcab.2018.05.005 18.

8. Vidal A.R., Ferreira T.E., Mello R.D.O., Schmidt M.M., Kubota E.H., Demiate I.M., et al. Effects of enzymatic hydrolysis (Flavourzyme®) assisted by ultrasound in the structural and functional properties of 19. hydrolyzates from different bovine collagens. Food Sci Technol. 2018;

38 (suppl 1): 103-8. DOI: https://doi.org/10.1590/fst.16717

9. Pakbin B., Allahyari S., Dibazar S.P., Brück W.M., Vahidi R., Mah-moudi R., et al. Production of bovine collagen hydrolysate with antioxi- 20. dant activity; optimized by response surface methodology. Sci Pharm. 2022; 90 (4): 62. DOI: https://doi.org/10.3390/scipharm90040062

10. Qi L., Zhang H., Guo Y., Zhang C., Xu Y. A novel calcium-binding peptide from bovine bone collagen hydrolysate and chelation mech- 21. anism and calcium absorption activity of peptide-calcium chelate. Food Chem. 2023; 410: 135387. DOI: https://doi.org/10.1016/j.food-chem.2023.135387

11. Hu G., Wang D., Sun L., Su R., Corazzin M., Sun X., et al. Isolation, 22. purification and structure identification of a calcium-binding pep-

tide from sheep bone protein hydrolysate. Foods. 2022; 11 (17): 2655. DOI: https://doi.org/10.3390/foods11172655

Dybka K., Walczak P. Collagen hydrolysates as a new diet supplement. Biotechnol Food Sci. 2009; 73: 83-92.

Holwerda A.M., van Loon L.J.C. The impact of collagen protein ingestion on musculoskeletal connective tissue remodeling: a narrative review. Nutr Rev. 2022; 80 (6): 1497-514. DOI: https://doi.org/10.1093/ nutrit/nuab083

Lupu M.A., Gradisteanu Pircalabioru G., Chifiriuc M.C., Albulescu R., Tanase C. Beneficial effects of food supplements based on hydrolyzed collagen for skin care (review). Exp Ther Med. 2020; 20 (1): 12-7. DOI: https://doi.org/10.3892/etm.2019.8342

Välimaa A.-L., Mäkinen S., Mattila P., Marnila P., Pihlanto A., Mäki M., et al. Fish and fish side streams are valuable sources of high-value components. Food Qual Saf. 2019; 3 (4): 209-26. DOI: https://doi. org/10.1093/fqsafe/fyz024

Zamora-Sillero J., Gharsallaoui A., Prentice C. Peptides from fish by-product protein hydrolysates and its functional properties: an overview. Mar Biotechnol (NY). 2018; 20 (2): 118-30. DOI: https://doi. org/10.1007/s10126-018-9799-3

Ananey-Obiri D., Matthews L.G., Tahergorabi R. Proteins from fish processing by-products. In: C.M. Galanakis (ed.). Proteins: Sustainable Source, Processing and Applications. London: Academic Press, 2019: 163-91. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-816695-6.00006-4 ISBN 9780128166956,

Abuine R., Rathnayake A.U., Byun H.G. Biological activity of peptides

purified from fish skin hydrolysates. Fish Aquatic Sci. 2019; 22:L 10.

DOI: https://doi.org/10.1186/s41240-019-0125-4

Behera A., Das R., Patnaik P., Mohanty J., Mohanty G. A review on fish

peptides isolated from fish waste with their potent bioactivities. J Appl

Biol Biotechnol. 2022; 10 (3): 195-209. DOI: https://doi.org/10.7324/

JABB.2022.100323

Tian Q., Li S.-M., Li B. The Pro-Gly or Hyp-Gly containing peptides from absorbates of fish skin collagen hydrolysates inhibit platelet aggregation and target P2Y12 receptor by molecular docking. Foods. 2021; 10 (7): 1553. DOI: https://doi.org/10.3390/foods10071553 Pires A.F., Marnotes N.G., Rubio O.D., Garcia A.C., Pereira C.D. Dairy by-products: A review on the valorization of whey and second cheese whey. Foods. 2021; 10 (5): 1067. DOI: https://doi.org/10.3390/ foods10051067

Eberhardt A., López E.C., Marino F., Mammarella E.J., Manzo R.M., Sihufe G.A. Whey protein hydrolysis with microbial proteases: Determination of kinetic parameters and bioactive properties for differ-

ent reaction conditions. Int J Dairy Technol. 2021; 74 (3): 489-504. DOI: https://doi.org/10.1111/1471-0307.12795

23. Deeth H., Bansal N. Whey proteins: an overview. In: Whey Proteins: from Milk to Medicine. San Diego: Academic Press, 2019: 1-50. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-812124-5.00001-1 ISBN 9780128121245.

24. Rytchenkova O.V., Krasnoshtanova A.A. Optimization of the process of obtaining enzymatic hydrolysates of whey proteins using proteolytic enzymes. Fundamental'nye issledovaniya [Fundamental Researches]. 2011; (8): 663-6. (in Russian)

25. Minj S., Anand S. Whey proteins and its derivatives: bioactiv-ity, functionality, and current applications. Dairy. 2020; 1 (3): 233-58. DOI: https://doi.org/10.3390/dairy1030016

26. Bu G., Luo Y., Chen F., Liu K., Zhu T. Milk processing as a tool to reduce cow's milk allergenicity: A mini-review. Dairy Sci Tech-nol. 2013; 93 (3): 211-23. DOI: https://doi.org/10.1007/s13594-013-0113-x

27. Zorin S.N., Petrov N.A., Borisov A.Yu. Whey protein fermentoly-sates: preparation, physicochemical and immunochemical characteristics. Pishchevaya promyshlennost' [Food Industry]. 2019; (4): 41-3. DOI: https://doi.org/10.24411/0235-2486-2019-10020 (in Russian)

28. Ghosh B.C., Prasad L.N., Saha N.P. Enzymatic hydrolysis of whey and its analysis. J Food Sci Technol. 2017; 54 (6): 1476-83. DOI: https://doi. org/10.1007/s13197-017-2574-z

29. Abd El-Salam M.H., El-Shibiny S. Preparation, properties and uses of enzymatic milk protein hydrolysates. Crit Rev Food Sci Nutr. 2017; 57 (6): 1119-32. DOI: https://doi.org/10.1080/10408398.2014.899200

30. Asrarkulova A.S., Bulushova N.V. Wheat gluten and its hydrolysates. Possible fields of practical use. Biotechnologiya [Biotechnology]. 2018; 34 (4): 6-17. DOI: https://doi.org/10.21519/0234-2758-2018-34-4-6-17 (in Russian)

31. Miloradova E.V., Ivanushkin P.A., Anan'ev A.A., Traubenberg S.E., Sof'in A.V. Comparative study of enzymatic hydrolysates of isolated soy protein and soy flour by SE-HPLC. Tonkie khimicheskie tekhnologii [Fine Chemical Technologies]. 2010; 5 (2): 82-8. (in Russian)

32. Liang Y., Guo Y., Zheng Y., Liu S., Cheng T., Zhou L., et al. Effects of high-pressure homogenization on physicochemical and functional properties of enzymatic hydrolyzed soybean protein concentrate. Front Nutr. 2022; 9: 1054326. DOI: https://doi.org/10.3389/fnut.2022.1054326

33. Fischer M. Limiting factors for the enzymatic accessibility of soybean protein. Ph.D. Thesis. Netherlands: Wageningen University, 2006: 155 p. ISBN 9789085044963 - 139

34. Basson A.R., Ahmed S., Almutairi R., Seo B., Cominelli F. Regulation of intestinal inflammation by soybean and soy-derived compounds. Foods. 2021; 10 (4): 774. DOI: https://doi.org/10.3390/foods10040774

35. Zilie S., Bozovie I., Hadzi-TaskoviC Sukalovie V. Thermal inactiva-tion of soybean bioactive proteins. Int J Food Eng. 2012; 8 (4): 14. DOI: https://doi.org/10.1515/1556-3758.2521

36. Jung S., Roussel-Philippe C., Briggs J.L., Murphy P.A., Johnson L.A. Limited hydrolysis of soy proteins with endo- and exoproteases. JAOCS. 2004; 81: 953-60. DOI: https://doi.org/10.1007/s11746-004-1007-3

37. Islam M., Huang Y., Islam S., Fan B., Tong L., Wang F. Influence of the degree of hydrolysis on functional properties and antioxidant activity of enzymatic soybean protein hydrolysates. Molecules. 2022; 27: 6110. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules27186110

38. Chatterjee C., Gleddie S., Xiao C.W. Soybean bioactive peptides and their functional properties. Nutrients. 2018; 10 (9): 1211. DOI: https:// doi.org/10.3390/nu10091211

39. Kim I.S., Yang W.S., Kim C.H. Beneficial effects of soybean-derived bioactive peptides. Int J Mol Sci. 2021; 22 (16): 8570. DOI: https://doi. org/10.3390/ijms22168570

40. Sun X.D. Enzymatic hydrolysis of soy proteins and the hydrolysates utilization. Int J Food Sci Technol. 2011; 46 (12): 2447-59. DOI: https:// doi.org/10.1111/j.1365-2621.2011.02785.x

41. Dunaevsky Y.E., Tereshchenkova V.F., Belozersky M.A., Filip-pova I.Y., Oppert B., Elpidina E.N. Effective degradation of gluten and its fragments by gluten-specific peptidases: A review on application for the treatment of patients with gluten sensitivity. Pharmaceutics. 2021; 13 (10): 1603. DOI: https://doi.org/10.3390/pharmaceutics 13101603

42. Delcour J.A., Joye I.J., Pareyt B., Wilderjans E., Brij s K., Lagrain B. Wheat gluten functionality as a quality determinant in cereal-based food products. Annu Rev Food Sci Technol. 2012; 3: 469-92. DOI: https:// doi.org/10.1146/annurev-food-022811-101303

43. Pourmohammadi K., Abedi E. Hydrolytic enzymes and their directly and indirectly effects on gluten and dough properties: An extensive review. Food Sci Nutr. 2021; 9 (7): 3988-4006. DOI: https://doi. org/10.1002/fsn3.2344

44. Cruz-Chamorro I., Álvarez-Sánchez N., Santos-Sánchez G., Pedroche J., Fernández-Pachón M.S., Millán F., et al. Immunomodulatory and antioxidant properties of wheat gluten protein hydrolysates in human peripheral blood mononuclear cells. Nutrients. 2020; 12 (6): 1673. DOI: https://doi.org/10.3390/nu12061673

45. Raksakulthai R., Haard N.F. Exopeptidases and their application to reduce bitterness in food: A review. Crit Rev Food Sci Nutr. 2003; 43 (4): 401-45. DOI: https://doi.org/10.1080/10408690390826572

46. Fu Y., Chen J., Bak K.H., Lametsch R. Valorisation of protein hydrolysates from animal by-products: perspectives on bitter taste and debitter-ing methods: A review. Int. J. Food Sci Technol. 2019; 54 (4): 978-86. DOI: https://doi.org/10.1111/yfs.14037

47. Idowu A.T., Benjakul S. Bitterness of fish protein hydrolysate and its debittering prospects. J Food Biochem. 2019; 43 (9): e12978. DOI: https://doi.org/10.1111/jfbc.12978

48. Lysenko L.A., Nemova N.N., Kantserova N.P. Proteolytic regulation of biological processes. Petrozavodsk: Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences. 2011: 482 p. (in Russian)

49. Solanki P., Putatunda C., Kumar A., Bhatia R., Walia A. Microbial proteases: ubiquitous enzymes with innumerable uses. 3 Biotech. 2021; 11 (10): 428. DOI: https://doi.org/10.1007/s13205-021-02928-z

50. Industrial Enzymes: Structure, Function, and Applications. In: J. Polaina, A.P. MacCabe (eds). Dordrecht: Springer, 2007: 281 p. DOI: https:// doi.org/10.1007/1-4020-5377-0 ISBN 978-1-4020-5376-4.

51. Wu J.W., Chen X.L. Extracellular metalloproteases from bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 2011; 92 (2): 253-62. DOI: https://doi. org/10.1007/s00253-011-3532-8

52. Zinina O.V., Solov'eva A.A., Rebezov Ya.M., Tarasova I.V., Okuskha-nova E.K. Enzymes in the meat industry of the food industry. Mezh-dunarodniy studencheskiy nauchniy vestnik [International Student Scientific Bulletin]. 2015; (6): 1-7. https://eduherald.ru/ru/article/ view?id=14245 (date of access 20.09.2022) (in Russian)

53. Bazhenova B.A., Danilov A.M. Obtaining an enzyme solution from whole beef abomasum to modify the properties of a collagen-containing rumen. Teoriya i praktika pererabotki myasa [Theory and Practice of Meat Processing]. 2017; 2 (4): 62-75. DOI: https://doi. org/10.21323/2414-438X-2017-2-4-62-75 (in Russian)

54. Sukhikh S.A., Babich O.O., Ul'rikh E.V. Study of collagenase activity of the microbial, plant and animal enzymes - substantiation of the choice of enzymes for collagen-containing waste hydrolysis. AgroEkoInzheneriya [AgroEcoEngineering]. 2021; (2): 142-8. DOI: https://doi.org/10.24412/2713-2641-2021-2107-142-148 (in Russian)

55. Lukin A.A. Application and comparison of proteolytic enzyme preparations in technology of protein hydrolyzates. Food Sci Technol. 2020; 40 (suppl 1): 287-92. DOI: https://doi.org/10.1590/fst.09319

56. Schlegel K., Sontheimer K., Hickisch A., Wani A.A., Eisner P., Schweiggert-Weisz U. Enzymatic hydrolysis of lupin protein isolates -changes in the molecular weight distribution, techno-functional characteristics, and sensory attributes. Food Sci Nutr. 2019; 7 (8): 2747-59. DOI: https://doi.org/10.1002/fsn3.1139

57. Ou J.-F., Zhu M.-J. An overview of current and novel approaches for microbial neutral protease improvement. Int J Mod Biol Med. 2012; 2 (1): 1-31.

58. Meinlschmidt P., Sussmann D., Schweiggert-Weisz U., Eisner P. Enzymatic treatment of soy protein isolates: effects on the potential aller-genicity, techno-functionality, and sensory properties. Food Sci Nutr. 2015; 4 (1): 11-23. DOI: https://doi.org/10.1002/fsn3.253

59. Zinchenko D.V., Muranova T.A., Melanyina L.A., Belova N.A., Mirosh-nikov A.I. Soy and rapeseed protein hydrolysis by the enzyme preparation protosubtilin. Appl Biochem Microbiol. 2018; 54: 294-300. DOI: https://doi.org/10.1134/S000368381803016X

60. Tavano O.L., Berenguer-Murcia A., Secundo F., Fernandez-Lafuente R. Biotechnological applications of proteases in food technology. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2018; 17 (2): 412-36. DOI: https://doi. org/10.1111/1541-4337.12326

61. Lindberg D., Kristoffersen K.A., de Vogel-van den Bosch H., Wubs-het S.G., Böcker U., Rieder A., et al. Effects of poultry raw material variation and choice of protease on protein hydrolysate quality. Process Biochem. 2021; 110: 85-93. DOI: https://doi.org/10.1016/j. procbio.2021.07.014

62. Merz M., Eisele T., Berends P., Appel D., Rabe S., Blank I., et al. Flavourzyme, an enzyme preparation with industrial relevance: automated nine-step purification and partial characterization of eight enzymes. J Agric Food Chem. 2015; 63 (23): 5682-93. DOI: https://doi. org/10.1021/acs.jafc.5b01665

63. Morais H.A., Silvestre M.P., Amorin L.L., Silva V.D.M., Silva M.R., Silva A.C.S., et al. Use of different proteases to obtain whey protein concentrate hydrolysates with inhibitory activity toward angiotensin-converting enzyme. J Food Biochem. 2014; 38 (1): 102-9. DOI: https:// doi.org/10.1111/jfbc.12032

64. Senevirathne M., Kim S.H., Jeon Y.J. Protective effect of enzymatic hydrolysates from highbush blueberry (Vaccinium corymbosum L.) against hydrogen peroxide-induced oxidative damage in Chinese hamster lung fibroblast cell line. Nutr Res Pract. 2010; 4 (3): 183-90. DOI: https://doi.org/10.4162/nrp.2010A3.183

65. Pasupuleti V.K., Braun S. State of the art manufacturing of protein hydrolysates. In: V. Pasupuleti, A. Demain (eds). Protein Hydrolysates

in Biotechnology. Dordrecht: Springer, 2010: 11—32. DOI: https://doi. org/10.1007/978-1-4020-6674-0_2 ISBN 978-1-4020-6673-3

66. Hong H., Fan H., Chalamaiah M., Wu J. Preparation of low-molecular-weight, collagen hydrolysates (peptides): Current progress, challenges, and future perspectives. Food Chem. 2019; 301: 125222. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.125222

67. Yang H., Xue Y., Liu J., Song S., Zhang L., Song Q., et al. Hydrolysis process optimization and functional characterization of yak skin gelatin hydrolysates. J Chem. 2019; 2019: 9105605. DOI: https://doi. org/10.1155/2019/9105605

68. León-López A., Fuentes-Jiménez L., Hernández-Fuentes A.D., Cam-pos-Montiel R.G., Aguirre-Álvarez G. Hydrolysed collagen from sheepskins as a source of functional peptides with antioxidant activity. Int J Mol Sci. 2019; 20 (16): 3931. DOI: https://doi.org/10.3390/ ijms20163931

69. Feng M., Betti M. Transepithelial transport efficiency of bovine collagen hydrolysates in a human Caco-2 cell line model. Food Chem. 2017; 224: 242-50. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.12.044

70. Kostyleva E.V., Sereda A.S., Velikoretskaya I.A., Tsurikova N.V. Comparison of the Efficacy of Different Preparations of Bacterial Proteases in Collagen Hydrolysis. Pishhevaya promyshlennost' [Food Industry]. 2021 (11): 67-9. DOI: https://doi.org/10.52653/PPI.2021.11.11.010 (in Russian)

71. Yunusov E.Sh., Ponomarev V.Ya., Morozova S.A., Ezhkova G.O. Study of the hydrolysis of collagen-containing raw materials by proteo-lytic enzymes. Vestnik tekhnologicheskogo universiteta [Bulletin of the Technological University], 2016; 19 (24): 168-70. (in Russian)

72. O'Keeffe M.B., Norris R., Alashi M.A., Aluko R.E., FitzGerald R.J. Peptide identification in a porcine gelatin prolyl endoproteinase hydro-lysate with angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory and hypotensive activity. J Funct Foods. 2017; 34: 77-88. DOI: https://doi. org/10.1016/j.jff.2017.04.018

73. Zhang Y., Olsen K., Grossi A., Otte J. Effect of pretreatment on enzymatic hydrolysis of bovine collagen and formation of ACE-inhibitory peptides. Food Chem. 2013; 141 (3): 2343-54. DOI: https://doi. org/10.1016/j.foodchem.2013.05.058

74. Lin Y.J., Le G.W., Wang J.Y., Li Y.X., Shi Y.H., Sun J. Antioxidative peptides derived from enzyme hydrolysis of bone collagen after microwave assisted acid pre-treatment and nitrogen protection. Int J Mol Sci. 2010; 11 (11): 4297-308. DOI: https://doi.org/10.3390/ims11114297

75. Pramualki ja T., Pirak T., Euston S.R. Valorization of chicken slaughterhouse by-products: Production and properties of chicken trachea hydrolysates using commercial proteases. Int J Food Prop. 2021; 24 (1): 1642-57. DOI: https://doi.org/10.1080/10942912.2021.1986522

76. Nchienzia H.A., Morawicki R.O., Gadang V.P. Enzymatic hydrolysis of poultry meal with endo- and exopeptidases. Poult Sci. 2010; 89 (10): 2273-80. DOI: https://doi.org/10.3382/ps.2008-00558

77. Khiari Z., Ndagi imana M., Betti M. Low molecular weight bioactive peptides derived from the enzymatic hydrolysis of collagen after isoelec-tric solubilization/precipitation process of turkey by-products. Poult Sci. 2014; 93 (9): 2347-62. DOI: https://doi.org/10.3382/ps.2014-03953

78. Korczek K., Tkaczewska J., Migdal W. Antioxidant and antihyperten-sive protein hydrolysates in fish products - a review. Czech J Food Sci. 2018; 36 (3): 195-207. DOI: https://doi.org/10.17221/283/2017-CJFS

79. Choonpicharn S., Jaturasitha S., Rakariyatham N., Suree N., Niam-sup H. Antioxidant and antihypertensive activity of gelatin hydroly-sate from Nile tilapia skin. J Food Sci Technol. 2015; 52 (5): 3134-9. DOI: https://doi.org/10.1007/s13197-014-1581-6

80. Han Y., Byun S.-H., Park J.-H., Kim S.-B. Bioactive properties of enzymatic hydrolysates from abdominal skin gelatin of yellowfin tuna (Thunnus albacares). Int J Food Sci Technol. 2015; 50: 1996-2003. DOI: https://doi.org/10.1111/ifs.12890

81. Fernandes P. Enzymes in fish and seafood processing. Front Bioeng Biotechnol. 2016; 4: 59. DOI: https://doi.org/10.3389/fbioe.2016.00059

82. Aspevik T., Egede-Nissen H., Oterhals L. A systematic approach to the comparison of cost efficiency of endopeptidases for the hydrolysis of Atlantic salmon (Salmo salar) by-products. Food Technol Biotechnol. 2016; 54 (4): 421-31. DOI: https://doi.org/10.17113/ftb.54.04.16.4553

83. Tacias-Pascacio V.G., Morellon-Sterling R., Siar E.H., Tavano O., Berenguer-Murcia Á., Fernandez-Lafuente R. Use of alcalase in the production of bioactive peptides: A review. Int J Biol Macromol. 2020; 165 (pt B): 2143-96. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ybiomac.2020.10.060

84. Wasswa J., Tang J., Gu X. Functional properties of grass carp (Cteno-pharyngodon Idella), Nile perch (Lates Niloticus) and Nile tilapia (Oreochromis Niloticus) skin hydrolysates. Int J Food Prop. 2008; 11 (2): 339-50. DOI: https://doi.org/10.1080/10942910701381188

85. Golovach T.N., Kurchenko V.P. Hydrolysis of milk proteins by enzyme preparations and proteolytic systems of lactic acid bacteria. Trudy BGU [BSU Proceedings]. 2012; 7 (1): 106-6. (in Russian)

86. Jeewanthi R.K., Kim M.H., Lee N.K., Yoon Y.C., Paik H.D. Peptide analysis and the bioactivity of whey protein hydrolysates from cheese whey with several enzymes. Korean J Food Sci Anim Resour. 2017; 37 (1): 62-70. DOI: https://doi.org/10.5851/kosfa.2017.37.1.62

87. Cui Q., Sun Y., Zhou Z., Cheng J., Guo M. Effects of enzymatic hydrolysis on physicochemical properties and solubility and bitterness of milk protein hydrolysates. Foods. 2021; 10 (10): 2462. DOI: https://doi. org/10.3390/foods10102462

88. Corrochano A.R., Buckin V., Kelly P.M., Giblin L. Invited review: Whey proteins as antioxidants and promoters of cellular antioxidant pathways. J Dairy Sci. 2018; 101 (6): 4747-61. DOI: https://doi. org/10.3168/jds.2017-13618

89. Kleekayai T., Le Gouic A.V., Deracinois B., Cudennec B., FitzGerald R.J. In vitro characterization of the antioxidative properties of whey protein hydrolysates generated under pH- and non pH-controlled conditions. Foods. 2020; 9 (5): 582. DOI: https://doi.org/10.3390/ foods9050582

90. Kim S.B., Seo I.S., Khan A., Ki K.S., Lee W.S., Lee H.J., et al. Enzymatic hydrolysis of heated whey: Iron-binding ability of peptides and antigenic protein fractions. J Dairy Sci. 2007; 90 (9): 4033-42. DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2007-0228

91. Izquierdo F.J., Peñas E., Baeza M.L., Gomez R. Effects of combined microwave and enzymatic treatments on the hydrolysis and immunore-activity of dairy whey proteins. Int Dairy J. 2008; 18 (9): 918-22. DOI: https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2008.01.005

92. Uluko H., Zhang S., Liu L., Chen J., Sun Y., Su Y., et al. Effects of microwave and ultrasound pretreatments on enzymolysis of milk protein concentrate with different enzymes. Int J Food Sci Technol. 2013; 48 (11): 2250-7. DOI: https://doi.org/10.1111/yfs.12211

93. Ma W., Qi B., Sami R., Jiang L., Li Y., Wang H. Conformational and functional properties of soybean proteins produced by extrusion-hydrolysis approach. Int J Anal Chem. 2018; 2018: 9182508. P. 1-11. DOI: https://doi.org/10.1155/2018/9182508

94. Jung S., Mahfuz A. Structure, protein interactions and in vitro protease accessibility of extruded and pressurized full-fat soybean flakes. J Am Oil Chem Soc. 2009; 86: 475-83.

95. Sereda A.S., Kostyleva E.V., Sharikov A.Yu., Smirnova I.A., Nefe-dova L.I., Ivanov V.V., et al. Development of combined technology of soybean feed additives based on extrusion and enzyme hydrolysis. Kor-moproizvodstvo [Fodder Production]. 2015; (10): 28-33. (in Russian)

96. Kong X.G., Zhou H., Qian H. Enzymatic hydrolysis of wheat gluten by proteases and properties of the resulting hydrolysates. Food Chem. 2007; 102 (3): 759-63. DOI: https://doi.org/10.1016/j.food-chem.2006.06.062

97. Koo S.H., Bae I.Y., Lee S., Lee D.H., Hur B.S., Lee H.G. Evaluation of wheat gluten hydrolysates as taste-active compounds with antioxidant activity. J Food Sci Technol. 2014; 51 (3): 535-542. DOI: https://doi. org/10.1007/s13197-011-0515-9

98. Kim N. Production of wheat gluten hydrolyzates by enzymatic process at high pressure. Food Sci Biotechnol. 2017; 26 (6): 1587-93. DOI: https://doi.org/10.1007/s10068-017-0152-9

99. Liu B., Kexue Z., Peng W., Xiao-Na Guo X., Zhou H. Effect of sequential hydrolysis with endo- and exo-peptidase on bitterness properties of wheat gluten hydrolysates. RSC Adv. 2016; 6: 27 659-68. DOI: https:// doi.org/10.1039/C5RA28171G

100. Sharikov A.Yu., Sokolova E.N., Amelyakina M.V., Yuraskina T.V., Ivanov V.V., Serba E.M. Development of a concept for the production of wheat snacks with the elimination of gluten by the biocatalysis. Vestnik Voronezhskogo gosudarstvennogo universiteta (VGUIT) [Bulletin of the Voronezh State University (VGUIT)]. 2020; 82 (4): 77-83. DOI: https://doi.org/10.20914/2310-1202-2020-4-77-83 (in Russian)

101. Cui C., Zhao H., Zhao M., Chai H. Effects of extrusion treatment on enzymatic hydrolysis properties of wheat gluten. J Food Process Eng. 2011; 34 (2): 187-203. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1745-4530.2008.00348.x