CC BY
8ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ
Ученые записки Крымского федерального университета имени В. И. Вернадского Биология. Химия. Том 7 (73). 2021. № 4. С. 234-241.
УДК 544.478-03
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРИРОДНЫХ МЕТАЛЛОПОРФИРИНОВ В ФОТОКАТАЛИЗЕ
Вяткина О. В., Кандагура Е. А., Изнаирова М. Д.
Институт биохимических технологий, экологии и фармации (структурное подразделение) федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского», Симферополь, Россия
Е-шаП: оквапа_гуа1к1па @Ш1.ги
В статье представлены результаты изучения каталитической активности веществ, имеющих в своём составе структуру порфирина, а именно: хорофиллсодержащих препаратов, выделенных из шпината, туи и зеленого чая; Си2+-замещенного хлорофилла шпината; препарата пероксидазы, выделенной из корнеплодов редьки черной, в водных растворах пероксида водорода под действием излучения видимой и ультрафиолетовой областей. Наличие порфириноподобных структур в препаратах, выделенных из растительного сырья было подтверждено методом ИК-сперктроскопии и спектрофотометрии в УФ и видимой областях. Проведено сравнение каталитических свойств порфириносодержащих жидких спиртовых экстрактов и препаратов, выделенных из них в твердой форме методом вакуумной перегонки. В ходе исследований установлено, что замещение Mg2+на Си2+ в молекулах хлорофилла приводит к увеличению оксидоредуктазной активности как при воздействии видимого света, так и при воздействии УФ-излучения. Удельная активность медного комплекса хлорофилла, выделенного в твердом виде, больше удельной активности пероксидазы в 1,5 раза на видимом свету. Экспериментально подтверждена активация пероксидазы редьки черной УФ- излучением в исследуемых системах.
Ключевые слова: фотокатализ, металлопорфирины, хлорофилл, пероксидаза, оксидоредуктазная активность.
ВВЕДЕНИЕ
Порфирины и металлопорфирины, широко распространены в природе и имеют большое биологическое значение. Молекулярные комплексы, содержащие порфириновую группировку, служат активными центрами белковых макромолекул - ферментов и переносчиков электронов в дыхательных цепях живых организмов и играют определяющую роль в фотосинтезе. Выполнение этими соединениями важнейших биохимических, ферментативных и фотохимических функций основано на особых свойствах тетрапиррольного макроцикла и его взаимодействии с другими функциональными элементами. Однако синтез порфиринов из-за своей сложности и многостадийности, до сих пор не поставлен на промышленный поток, поэтому
изучение особых свойств природных порфиринов служит основой не только для решения значимых проблем, но и многих практически важных вопросов, например создание сенсорных и каталитически активных материалов нового поколения. Поэтому нашей целью было изучение оптических и фотокаталитических свойств порфириноподобных структур, выделенных из природного сырья в нативном виде.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для изучения фотолюминесцентных и каталитических свойств из природного сырья выделяли препараты, содержащие хлорофилл и пероксидазу по методикам указанным в [1—3]. В качестве экстрагентов хлорофилла использовали этиловый и изопропиловый спирты. Пероксидазу (PR) из корнеплода черной редьки экстрагировали в фосфатный буфер с рН=7. Концентрации веществ в экстрактах определяли методом прямой фотоколориметрии на приборе ЭКСПЕРТ-003, принимая, что для хлорофилла £gjj=M04 л/(моль см), s400=2105 л/(моль-см); для пероксидазы s400= 9,6404 л/(моль-см).
Полученные образцы исследовали методом ИК-сперктроскопии (ИК-спектрометр Perkin Elmer Spectrum Two, снабженный призмой НПВО (нарушенного полного внутреннего отражения). Запись спектров осуществляли в диапазоне 4000-400 см-1) и спектрофотометрии в УФ и видимой областях электромагнитного излучения. Использовались приборы (Спектрофотометр cintra 4040: спектральный диапазон (190-900 нм), Точность установки длины волны, нм (шаг 0,1 нм), ширина щели в диапазоне (0,1-2,0 нм)).
В молекулах хлорофилла, выделенного из шпината по методике [4] произвели замещение иона Mg2+ на ион Cu2+ (Chl(Mg2+)^ Chl(Cu2+)), которое подтвердили методами спектроскопии в УФ и видимой области спектра. Из спиртовых экстрактов в образцах, полученных из листьев шпината, выделяли препарат в твердой форме методом вакуумной перегонки (Chl(Mg2+)(s), Chl(Cu2+)(s).
Осаждение фермента из фосфатного буфера проводили в ацетоне, при температуре 4 оС в течении 24 часов. Состав осадителя: (CH3)2CO-(NH4)2SO4; где концентрация сульфата аммония C((NH4)2SO4) = 0,2 моль/л. Соотношение объемов экстракта пероксидазы, раствора сульфата аммония и ацетона составляло Уп:Ус:Уо = 1:1:1 (100 мл). Полученные осадки отделяли с помощью центрифуги на 7000 об в течении 15 мин. Затем, максимально удалив жидкость фермент высушивали в течение 12 часов при комнатной температуре, получая (PR)(s) [5].
У полученных препаратов изучали каталитическую и фотоактивность в водных растворах пероксида водорода методом волюмометрии. Состав каталитических систем указан в табл. 1.
Относительную активность катализаторов в исследуемых процессах в гомогенных системах рассчитывали по формуле:
А(г)= w/v, мл/(моль-мин.) (1)
Где: w, (мл/мин) - скорость выделения кислорода
v, (моль) - количество активных центров катализатора.
Относительную активность катализаторов в гетерогенных системах рассчитывали по формуле:
А^^1^^ мл/(моль(8) •мин) (2)
Где: w, мл/мин - скорость выделения кислорода
у8, (моль) - количество активных центров в твердом катализаторе массой т.
Таблица 1
Состав систем, используемых для определения каталитической активности
препаратов
Системы Состав У(Н2О2) (мл) СЩ2О2) (моль/л) катализатор
А1 Н2О2, СЫ(Си2+) 10 0,98+2-10-4 1 мл СЫ(Си2+)
А2 Н2О2, СЫ^2+) 0,7 мл СЫ^2+)
А3 Н2О2, СЫ(Си2+)(8) 0,005 г СЫ(Си2+)(8)
А4 Н2О2, (РЯ)© 0,005 г пероксидаза
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе эксперимента были получили спиртовые растворы хлорофилла из чая, туи и шпината. Для последнего был снят спектр поглощения в диапазоне от 300 нм до видимой области (рис. 1), в котором наблюдается часть широкой полосы поглощения на границе УФ и видимой областей (^=370-420 нм) - полоса Соре (в400=2-105). Вторая характеристическая полоса (точка А) соответствует максимуму поглощения порфирина при длине волны 660 нм - Q-полоса (I). Обе полосы обусловлены электронным п-п* переходом [6].
А -к
ю аоо » О БОО 600 700 В о нос
( ши )
Рис. 1. Спектр поглощения Сhl(Mg2+).
Также в соответствии с методикой описанной в [4] был получен хлорофилл, с замещение Mg2+ на Си2+. Спектр этого образца изображен на рис. 2. Точка А1- максимум поглощения при длине волны 645 нм. Спиртовой раствор Сhl(Mg2+), должен иметь максимум поглощения при длине волны 662-652 нм, смещение
максимума поглощения в область 648-652 нм подтверждает замещение (СЫ^2+)^ СЫ(Си2+).
Рис. 2. Спектр поглощения СЫ(Си).
Для образцов СЫ^2+), СЫ(Си2+), СЫ(Си2+)(8), (РЯ)© были сняты ИК-спектры.
На спектре Ch1(Mg2+) (рис.3) идентифицируется ряд полос поглощения. Полоса в области 3350 см-1, соответствует колебаниям К—И группы, 2950 см-1 интерпретируется, как асимметрические колебания С-И связей порфирина. Группа -С=О характеризуются полосой поглощения в области 1750 см-1, 1400 см-1 свойствен группе —С=К [6]. В ИК-спектрах поглощения СЫ(Си2+), СЫ(Си2+)(8), (РЯ)^) в жидком и твердом виде других значимых полос не наблюдается, что подтверждает наличие порфиринового кольца во всех исследуемых препаратах, однако отмечено незначительное смещение исходных, которое вероятно связанно с сменой центрального атома в активном центре молекулы.
Параллельно проводились колличественные фотоколориметрические исследования спиртовых экстрактов содержащих порфирин, которые показали, что максимумы светопоглощения наблюдаются при длинах волн ^=400 нм и ^=655 нм. Использовав характерные для этих длин волн молярные коэффициенты светопоглощения хлорофиллов рассчитали их эффективные концентрации, которые приведены в табл. 2.
Максимальное светопоглощение экстрактов, а следовательно и содержание экстрагированных веществ наблюдается при ^=655 нм. Однако, учитывая, что именно при ^=400 нм поглощают порфириноподобные активные центры исследуемых биомолекул в качестве критерия степени чистоты экстрактов использовали отношение С2/С1 (табл. 1). Эксперимент показал, что меньше посторонних светопоглощающих примесей экстрагируется вместе с хлорофиллом из растительного сырья при использовании этилового спирта. Поэтому именно такие экстракты использовали для иследования оксидоредуктазной активности в
водных растворах пероксида водорода волюмометрическим методом. Состав каталитических систем показан в (табл. 1). Использовали объемы жидких экстрактов, изомолярные по каталитическим центрам. Среднее количество активных центров в твердых образцах расчитывали делением их масы на средние молекулярные массы хлорофилла и пероксидазы (М(РЯ)=40000, М(СЫ)=894). Результаты представлены в табл. 3-4.
Рис. 3. ИК-спектр поглощения Chl(Mg +).
Таблица 2
Концентрации порфирин содержащих веществ в спиртовых экстрактах
Сырьё Растворитель Ci(-10-4), моль/л При ^=655 нм С2010-4), моль/л При ^=400 нм С2/С1
Шпинат Изопропиловый спирт 1,90 0,120 0,06
Этиловый спирт Chl(Cu2+) 0,64 0,072 0,11
Chl(Mg2+) 0,91 0,099 0,11
Чай Изопропиловый спирт 1,70 0,120 0,07
Туя 0,85 0,099 0,12
В Chl(Cu2+) (система А1) наблюдается активация катализатора на видимом свету, в отличие от Chl(Mg ) (система А2), поскольку медь является металлом переменной степени окисления и способна проявлять каталитическое действие в Red/Ox реакции разложения пероксида водорода [7]. Без доступа излучения видимой области (в темноте) ни одна из систем не является активной.
Активность Chl(Cu2+)(s) (А3), больше активности пероксидазы (PR)(s) в 1,5 раза на видимом свету. Данный факт логичен, так как благодаря особенностям
возбужденных состояний порфиринового фрагмента в хлорофилле, таких как энергетическая близость возбужденных состояний Т1* и Б1*, высокий квантовый выход интеркомбинационной конверсии Б1*—>Т1* и длительное время жизни триплетного состояния Т1* (тт=0,01-0,1 с), хлорофилл является одними из наиболее эффективных фотосенсибилизаторов, выполняя исключительную роль в процессе фотосинтеза [2, 8].
Таблица 3
Скорость разложения Н202 в гомогенных системах (А1, А2) в различных
условиях
Система Условия w, (мл/мин) А(г) (106), мл/(моль • мин)
А1 видимый свет 0,13 25
в темноте - -
УФ 0,15 28
А2 видимый свет - -
в темноте - -
УФ 0,1 20
Таблица 4
Скорость разложения Н202 в системах А3 А4 с использованием препаратов, выделенных в твердом (8) виде, в различных условиях
Система Условия w, (мл/мин) А(8), мл/(моль • мин)
А3 видимый свет 0,03 186 106
в темноте - -
УФ 0,05 19 -10'
А4 видимый свет 0,07 112 106
в темноте - -
УФ 0,15 2,4 -108
При воздействии УФ излучения А(8) пероксидазы превышает активность СЫ(Си)(8) в 1,3 раза. Фотоактивность пероксидазы под действием УФ-излучения была доказана нами ранее [9]. В темноте обе системы не активны.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Замещение Mg2+на Си2+ в молекулах хлорофилла приводит к увеличению оксидоредуктазной активности катализатора под воздействием тзлучений видимого и УФ-диапазонов.
2. Медный комплекс хлорофилла в твердом состоянии более активный фотосенсибилизатор на видимом свету по сравнении с пероксидазой редьки черной, тогда как водействие УФ-излучения приводит к обратному эффекту.
Список литературы
1. Аскаров К. А. Способы выделения порфиринов из естественных источников и модификация с целью применения в медицине [Электронный ресурс] / К. А. Аскаров - Респ. Узбекистан: 2019. -Режим доступа: https://scientific-conference.com/images/PDF/2019/14/sposoby-vydeleniya.pdf
2. Денисов Ю. А. Экстракция хлорофилла изопропанолом. Люминесценция экстракта хлорофилла в ультрафиолетовом свете [Электронный ресурс] / Ю. А. Денисов // Журнал Химиков-Энтузиастов. - 2017. - N 4. - Режим доступа: http://chemistrychemists.com/N4_2017/ChemistryAndChem..
3. Селибер Г. Л. Большой практикум по микробиологии. / Селибер Г. Л. - М.: Мир, 1962. - 492 с.
4. Патент 2611409 Россия, МПК A61K36/00, A61K33/34. Способ получения медного комплекса хлорофилла / Л. И. Мухортова, Н. С. Никифорова, П. М. Лукин; Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова. - № 2016109418; заявл. 03.15.2016; опубл. 02.21.2017, Бюл. № 6. - 3 с.
5. Вяткина О. В. Проблемы выделения и очистки растительных пероксидаз. / О. В. Вяткина // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. - 2012. -Т. 25 (64), №3. - С. 271-276.
6. Тарасевич Б. Н. ИК спектры основных классов органических соединений (Справочные материалы) / Б. Н. Тарасевич. - М.: МГУ им. М. В. Ломоносова, 2012. - 55 с.
7. Першина Е. Д. Сравнительный анализ распада пероксида водорода в присутствии ионов меди (II) и железа(Ш) / Е. Д. Першина, И. В. Алексашкин, О. В. Вяткина // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения/ Труды Крымского государственного медицинского университета им С. И. Георгиевского. - 2003. -Т. 139.- С. 120-124.
8. Бабаян Н. С. Исследование in vitro зависимости структура/активность новых порфиринов как радиосенсибилизаторов / Н. С. Бабаян. // Ученые записки Ереванского государственного университета. - 2011. - 5 с.
9. Конарчук К. В. Влияние иммобилизации на фотоактивацию пероксидазы / К. В. Конарчук, С. Р. Измайлова, О. В. Вяткина // XXI Международная научно-практическая конференция «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 21-24 сентября 2020 г.): материалы конференции / Томск (Россия), 2020. - С. 262-263.
USE OF NATURAL METALLOPORPHYRINS IN PHOTOCATALYSIS
Vyatkina O. V., Kandagura E. A., Iznairova M. D.
Institute of Biochemical Technologies, Ecology and Pharmacy (structural subdivision) of the Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education "Vernadsky Crimean Federal University", Simferopol, Russia E-mail: [email protected]
The article presents the results of a study of the catalytic activity of substances which contain porphyrin structures, namely: chorophyll-containing preparations isolated from spinach, thuja and green tea; Cu2+-substituted chlorophyll of green tea and spinach; peroxidase preparation isolated from black radish root crops in water solutions of hydrogen peroxide under the action of electromagnetic radiation of visible range and ultraviolet region. The presence of porphyrin-like structures in the preparations isolated from plant raw materials was confirmed by infrared spectroscopy and spectrophotometry in the UV and visible regions. It was found that chlorophyll extracted with ethyl alcohol
contains a smaller amount of impurities that do not contain a porphyrin center in comparison with extracts into isopropyl alcohol. The catalytic properties of porphyrin-containing liquid alcohol extracts and preparations isolated from them in solid form by vacuum distillation were compared. In the course of the studies it was found that the substitution of Mg2+ for Cu2+ in chlorophyll molecules leads to the increase in oxidoreductase activity both in visible light and when being exposed to UV radiation. The specific activity of Copper Chlorophyll complex isolated in solid form is 1.5 times higher than the specific activity of peroxidase in visible light. This fact is logical, since due to the peculiarities of the excited states of the porphyrin fragment, chlorophyll is one of the most effective photosensitizers.The activation of black radish peroxidase by UV radiation in all systems studied was experimentally confirmed.
Keywords: photocatalysis, metalloporphyrins, chlorophyll, peroxidase, enzymatic activity.
References
1. Askarov K. A. Methods of isolation of porphyrins from natural sources and modification with the purpose of application in medicine, Aviable at: https://scientific-conference.com/images/PDF/2019/14/sposoby-vydeleniya.pdf (in Russ.)
2. Denisov Y. A. Extraction of chlorophyll with isopropanol. Luminescence of chlorophyll extract in ultraviolet light, Aviable at: http://chemistrychemists.com/N4_2017 / ChemistryAndChem.
3. Seliber G. L. A large workshop on microbiology, 492 (Mir, Moscow, 1962). (in Russ.).
4. Patent 2611409 Russia, IPC A61K36/00, A61K33/34. Method of obtaining chlorophyll copper complex / L. I. Mukhortova, N. S. Nikiforova, P. M. Lukin; Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education Chuvash State University named after I. N. Ulyanov. - No. 2016109418; application. 03.15.2016; publ. 02.21.2017 (in Russ.)
5. Vyatkina O. V. Problems of allocation and clearing plant peroxidase, Scientific Notes of Taurida V. I. Vernadsky National University, Biology, Chemistry, 67(1), 271 (2012) (in Russ.)
6. Tarasevich B. N. IR spectra of the main classes of organic compounds (Reference materials), 55 (Lomonosov State University, Moscow, 2012). (in Russ.)
7. Pershina E. D., Aleksashkin I. V., Vyatkina O. V. Comparative analysis of hydrogen peroxide decomposition in the presence of copper(II) and iron(III) ions. Problems, achievements and prospects of medical and biological sciences and practical healthcare, Proceedings of the Crimean State Medical University named after S. I. Georgievsky, 139, 120 (2003). (in Russ.)
8. Babayan N. S. In vitro study of structure/activity relationship of new porphyrins as radiosensitizers, Scientificational Notes of Yerevan State University, 5 (2011). (in Russ.).
9. Konarchuk K. V., Izmailova S. R., Vyatkina O. V., Effect of immobilization on photoactivation of peroxidase, Proceedings of the XXI International Scientific and Practical Conference "Chemistry and Chemical Technology in the XXI Century", Tomsk, 262 (2020). (in Russ.).
