CC BY
12DOI: 10.25690/VETPAT.2021.63.45.004 УДК: 619:616.833.3
Лобова Т. П., Михайлова В. В., Шишкина М. С., Скворцова А. Н., Варенцова А. А.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕРЕВИВАЕМОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ПОЧЕК ТЕЛЕНКА ТАУРУС-1 (Т-1) ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АДЕНОВИРУСОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Ключевые слова: перевиваемые культуры клеток: ПТ-80, МДБК, ТР, Таурус-1(Т-1), первичная культура клеток: ТБ, ЛЕК, ПЭК, аденовирусы 1-10 серотипов, изоляты аденовирусов КЛБ и Русь 18/81.
Резюме: В статье представлены результаты исследования культуральных свойств аденовирусов крупного рогатого скота - Bovine-10 (серотип 1), Bovine-19 (серотип 2), WBR-1 (серотип 3), ТНТ-62 (серотип-4), В/4 65 (серотип-5), 671/130 (серотип-6), Fucuroi (серотип-7), Misk (серо-тип-8), Sofia 4/67 (серотип-9), Стендел (серотип-10), изолятов КЛБ и Русь 18/81, идентифицированных как первый и седьмой серотип. Аденовирусы с 1-10 серотипов культивировали в перевиваемых культурах клеток ПТ-80 (почка теленка), МДБК (почка коровы), ТР (трахея коровы), Таурус-1(Т-1) (почка теленка - фибробластоподобный клон) в течение 15-ти пассажей, а также в первичной культуре клеток ТБ (тестикулы бычка). В качестве питательной среды использовали культуральную среду MEM с двойным набором аминокислот с добавлением 10%-ной фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота. Выращивание монослоя клеток проводили в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С. Титры вирусов учитывали после проведения 15-го пассажа, которые составляли от 5,0 до 8,86 lg ТЦД50/мл. Титр инфекционной активности определяли согласно методу Рида и Менча, выражая в lg ТЦД50/мл.
Введение
Одной из причин гибели молодняка крупного рогатого скота (КРС) в животноводческих комплексах являются респи-раторно-кишечная патология заразной и незаразной этиологии. В развитии инфекционных пневмогастроэнтеритов не последнюю роль играют респираторные вирусы. Наиболее восприимчивы являются телята до шести месяцев (смертность достигает 20-30 %). Наиболее значимыми с точки зрения эпизоотологии и экономического ущерба являются инфекционный ринотрахеит-пустулезный вульвовагинит (ИРТ-ИВП), респираторно-синтициаль-ная инфекция (РСИ), парагрипп-3 (ПГ-3), вирусная диарея-болезнь слизистых (ВД-БС), корона- и ротавирусная инфекции, а также аденовирусная инфекция КРС. Чаще всего эти заболевания протекают смешанно, в различных сочетаниях, а так как многие из них являются иммуносупрессо-рами, идет осложнение вторичной микрофлорой. Аденовирусная инфекция (АВИ) регистрируется во многих странах мира [1-3]. Первые сообщения о неблагополучии хозяйств в отношении данного заболевания в СССР появились в конце 60-х го-
дов [4, 5]. Аденовирусная инфекция характеризуется острым течением, поражением респираторно-кишечного тракта, тяжелыми конъюнктивитами, ринитами и диареями. У взрослых животных инфекция проходит бессимптомно. Все штаммы аденовирусов разделены на 2 антигенные подгруппы. Первая подгруппа аденовирусов включает штаммы: Bovine-10 (серотип-1), Bovine-19 (серотип-2), WBR-1 (серотип 3). Вторая подгруппа вирусов включает штаммы: ТНТ-62 (серотип-4), В/4 65 (серо-тип-5), 671/130 (серотип-6), Fucuroi (серотип -7), Misk (серотип-8), Sofia 4/67 (серо-тип-9), Стендел (серотип-10). Из-за сходства клинического и патологоанатомиче-ского течения с другими респираторно-кишечными заболеваниями вирусной этиологии, такими как ПГ-3, ВД, ИРТ, РС и др., основную роль в постановке диагноза на аденовирусную инфекцию крупного рогатого скота отводится лабораторной диагностике. Одним из лабораторных методов является вирусовыделение на культуре клеток. Этот метод является «золотым стандартом». Нормативная документация, разработанная в РФ для ветеринарных лабораторий, регламентирует исполь-
зование первичных культур клеток, такие как тестикулы бычка (ТБ), легкое эмбриона коровы (ЛЭК), почка эмбриона коровы (ПЭК), что в современных условиях трудоемко и неэкономично [6, 7]. По данным литературных источников перевиваемые культуры клеток могут быть надежной альтернативой первичных культур клеток для культивирования аденовирусов [8-10].
Сотрудники ФГБУ ЦНМВЛ провели исследования (валидацию/верифика-цию) по установлению чувствительности перевиваемой культуры клеток Таурус-1 к аденовирусам крупного рогатого скота и предлагают заменить первичную культуру клеток в лабораторной диагностике АВИ на перевиваемую, что позволит упростить и удешевить метод вирусовыделения.
Материалы и методы исследований
Вирусы. В качестве положительного контроля использовали референтные штаммы аденовирусов Bovine-10 (серотип 1), Bovine-19 (серотип 2), WBR-1 (серотип з), ТНТ-62 (серотип-4), В/4 65 (серотип-5), 671/130 (серотип-6), Fucuroi (серотип-7), Misk (серотип-8), Sofia 4/67 (серотип-9), Стендел (серотип-10) с титром инфекционной активности от 5,0 до 8,86 lg ТЦД50/ мл, а также изоляты аденовирусов KLB (серотип 1), Русь 18/81 (серотип 7).
Культура клеток. Для репродукции аденовирусов использовали перевиваемые клеточные линии МДВК, ПТ-80, ТР, Тау-
рус-1.
Культивирование аденовирусов. Репродукцию аденовирусов осуществляли в монослое культур клеток МДВК, ПТ-80, ТР, Таурус-1 (Т-1) в течение 15-ти последовательных пассажей. Доза заражения составляла 0,1-0,2 ТЦД50/кл.
Культивирование клеток. Клеточный монослой выращивали в условиях термостата в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С. Использовали культуральную среду МЕМ с двойным набором аминокислот с добавлением 10%-ной фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота.
Титрование аденовирусов проводили в монослое соответствующих клеточных культур клеток, выращенном в 96-луноч-ном культуральных планшетах. Титр инфекционной активности вычисляли по методу Рида и Менча, выражая в ^ ТЦД50/мл.
Результаты и обсуждение
Скрининг чувствительности эталонных штаммов аденовирусов всех десяти серо-типов и изолятов к перевиваемым клеточным культурам МДВК, ПТ-80, ТР, Таурус-1 проводили путем заражения клеточного монослоя в дозе 0,1-0,2 ТЦД50/кл. Полученные результаты представлены в табл. 1.
Из материалов, представленных в табл. 1, видно, что перевиваемые культуры клеток МДВК, ПТ-80, ТР чувствительны лишь к аденовирусам первой антигенной подгруппы и нечувствительны к аденовирусам второй антигенной подгруппы. Перевиваемая культура клеток Таурус-1 оказалась
Таблица 1. Скрининг чувствительности перевиваемых культур клеток
МДВК, ПТ-80, ТР, Таурус-1 к аденовирусам крупного рогатого скота
Эталонные штаммы, изоляты аденовирусов Наименование перевиваемых клеточных культур
МДВК ПТ-80 ТР Таурус-1
Вovine -10 (серотип 1) ++++* ++++ ++++ ++++
Вovine-19 (серотип 2) ++++ ++++ ++++ ++++
WBR-1 (серотип 3) ++++ ++++ ++++ ++++
ТНТ-62 (серотип 4) ____** — — ++++
В/4 65 (серотип 5) — — ---- ++++
671/130 (серотип 6) — — ---- ++++
Fucuroi (серотип 7) — — ---- ++++
Misk (серотип 8) — — ---- ++++
Sofia 4/67 (серотип 9) — — ---- ++++
Стендел (серотип 10) — — ---- ++++
Изолят КЬВ (серотип 1) ++++ ++++ ++++ ++++
Изолят «Русь» (серотип 7) — — — ++++
Примечание: * ++++ чувствительная культура клеток;
** — нечувствительная культура клеток.
чувствительна ко всем десяти серотипам аденовирусов крупного рогатого скота.
В дальнейшем мы проводили исследования по оценке репродукции аденовирусов в перевиваемых линиях клеток МДВК, ПТ-80, ТР и Таурус-1. Накопление аденовирусов в культуре клеток оценивали по их инфекционной активности после проведения 15 последовательных пассажей. Цито-патическое действие (ЦПД) наступало через 48 часов после заражения монослойной клеточной культуры клеток.
В табл. 2 представлены данные титрования аденовирусов и их инфекционная активность. Как видно из таблицы 2, аденовирусы первой антигенной подгруппы (серотипы 1, 2 и 3), включая изолят КЬБ, культивировались в перевиваемых линиях клеток МДВК, ПТ-80, ТР в высоких инфек-
ционных титрах от 4,5 до 6,77 ТЦД50/мл. В перевиваемой линии Т-1 инфекционный титр для аденовирусов первой антигенной подгруппы составлял от 5,69 до 8,5 ТЦД50/ мл, что примерно на 1,0 ± 0,03 ^ ТЦД50/мл выше, чем в перевиваемых культурах клеток МДВК, ПТ-80, ТР.
Далее на рис. 1 представлена перевиваемая культура клеток Таурус-1 (Т-1) без признаков ЦПД, а с признаками ЦПД через 48 часов после заражения - на рис. 2. Наиболее полное проявление разрушения монослоя под влиянием аденовирусов наблюдали на 3-5 сутки. Аналогичные данные были получены при анализе инфекционной активности изолятов аденовирусов КЬБ и Русь 18/81.
Аденовирусы как первой (серотипы 1, 2, 3), включая изволят КЬБ, и второй (серо-
Таблица 2. Значения титров инфекционной активности изолятов и аденовирусов с 1 по 10 серотип в перевиваемых клеточных линиях __МДВК, ПТ-80, ТР, Таурус-1_
Эталонные штаммы, изоляты аденовирусов Значения титров инфекционной активности изолятов и аденовирусов с 1 по10 серотип
Наименование перевиваемых клеточных культур
МДВК ПТ-80 ТР Таурус-1
Bovine-10 (серотип 1) 5,0 ± 0,03 ^ ТЦД50/МЛ 5,43 ± 0,03 ^ ТЦД50/мл 5,0 ± 0,03 ^ ТЦД50/мл 5,89 ± 0,02 lg ТЦД50/мл
Bovine-19 (серотип 2) 4,75 ± 0,01 ^ ТЦД50/МЛ 4,78 ± 0,02 ^ ТЦД50/мл 4,75 ± 0,01 ^ ТЦД50/мл 5,69 ± 0,03 lg ТЦД50/мл
WBR-1 (серотип 3) 7,5 ± 0,01 ^ ТЦД50/МЛ 7,5 ± 0,01 ^ ТЦД50/мл 7,5 ± 0,01 ^ ТЦД50/мл 8,5 ± 0,03 lg ТЦД50/мл
ТНТ-62 (серотип 4) Не чувствительна Не чувствительна Не чувствительна 6,5 ± 0,03 lg ТЦД50/мл
В/4-65 (серотип 5) Не чувствительна Не чувствительна Не чувствительна 6,56 ± 0,02 lg ТЦД50/мл
671/130 (серотип 6) Не чувствительна Не чувствительна Не чувствительна 7,5 ± 0,01 lg ТЦД50/мл
Fucuroi (серотип 7) Не чувствительна Не чувствительна Не чувствительна 8,86 ± 0,03 lg ТЦД50/мл
Misk (серотип 8) Не чувствительна Не чувствительна Не чувствительна 8,75 ± 0,02 lg ТЦД50/мл
Sofia 4/67 (серотип 9) Не чувствительна Не чувствительна Не чувствительна 8,5 ± 0,03 lg ТЦД50/мл
Стендел (серотип 10) Не чувствительна Не чувствительна Не чувствительна 7,75 ± 0,03 lg ТЦД50/мл
Изолят KLB (серотип 1) 5,75 ± 0,01 ^ ТЦД50/мл 5,75 ± 0,01 ^ ТЦД50/мл 5,75 ± 0,01 ^ ТЦД50/мл 6,5 ± 0,01 lg ТЦД50/мл
Изолят «Русь» (серотип 7) Не чувствительна Не чувствительна Не чувствительна 7,0 ± 0,02 lg ТЦД50/мл
типы 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), включая изолят Русь 18/81, антигенных подгрупп культивировались в перевиваемой линии Таурус-1 в высоких инфекционных титрах. ЦПД харак-
теризуется образованием гроздеподобных (виноградная гроздь) скоплений округлых клеток вокруг разрывов в клеточном монослое (рис. 2).
Рис 1. Монослой культуры клеток Т-1 до заражения аденовирусом без ЦПД, х400
Рис. 2. Монослой клеточной линии Т-1, инфицированный аденовирусом с признаками ЦПД через 48 часов после заражения, х400
Заключение
Установлено, что все эталонные штаммы аденовирусов (с 1 по 10 серотип), репродуцировались в культуре клеток Тау-рус-1 с высоким инфекционным титром от 5,0 до 8,86 ^ ТЦД50/мл. Полученные данные характеризуют перевиваемую куль-
туру клеток Таурус-1, как высокочувствительную биологическую систему, позволяющую использовать её в диагностике аденовирусной инфекции крупного рогатого скота в ветеринарных лабораториях Российской Федерации.
Библиографический список:
1. Белоусова Р. В. Практикум по ветеринарной виру-
сологии. 3-е изд. перераб. и доп. / Р. В. Белоусова, Н. И. Троценко, Э. А. Преображенская // - М.: Колос, 2007. - 178 с.
2. Бурцева И. А. Особенности течения аденовирус-
ной инфекции молодняка крупного рогатого скота в Якутии / И. А. Бурцева // Ветеринарные науки. - 2014. - С. 149-159.
3. Лобова Т. П. Усовершенствование лабораторной
диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота: дис____канд. биол. наук / Т. П. Лобова. - Москва, 2006. - 138 с.
4. Гуненков В. В. Малоизвестные вирусные инфек-
ции крупного рогатого скота / В. В. Гуненков, В.
Н. Сюрин, Вертинская // - М.: Колос, 1972. - 47 с.
5. Алиева Н. А. Аденовирусная инфекция телят / Н.
А. Алиева, М. К. Ганиев, Р. С. Дрейзин, Р. А. Алиева, Г. А. Сарыев // Труды АзНИВИ. - 1967. - Т. XXI.
6. Сюрин Н. В. Аденовирусная инфекция крупного
рогатого скота / В. Н. Сюрин, А. Я. Самуйленко // Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998. - С. 795-801.
7. Aldasy P. Pneumoenteritis in Caives Caused by Adenoviruses / P. Aldasy, L. Csontos, A. Bartha // Acta Vet. Acad. Sci. Hung. - 1965. - 15. - P. 175-176.
8. Ventura M. USE a simple method for the Epstein-Barr
virus transformation of lymthocytes from members
of large families of reunion Jsland / M. Ventura, A. Jibaud [et al.] // Hum. Hered. - 1988. - P. 36-38.
9. Caputo J. L. An effective method for establishing human B-lymphoblastic cell lines using Epstein-Barr virus / J. L. Caputo, A. Thomson, P. Mc. Clinetorck [et al.] // J. Tissue Culture methods. - 1988. - 13:1. - P.
39-44.
10. Takashima l. Relation of bovine leucosis production on cell growth cycle / l. Takashima, C. Olson // Archives of Virology. - 1981. - V. 69. - №. 2. - P. 141148.
References:
1. Belousova R. V. Praktikum po veterinarnoy virusologii
[Practicum on veterinary virology]. 3-e izd. pererab. i dop. / R. V. Belousova, N. I. Trotsenko, E. A. Preobrazhenskaya // - M.: Kolos, 2007. - 178 s.
2. Burtseva I. A. Osobennosti techeniya adenovirusnoy
infektsii molodnyaka krupnogo rogatogo skota v Yakutii [Features of the course of adenovirus infection of young cattle in Yakutia] / I. A. Burtseva // Veterinarnyie nauki. - 2014. - S. 149-159.
3. Lobova T. P. Usovershenstvovanie laboratornoy diagnostiki adenovirusnoy infektsii krupnogo rogatogo skota [Improvement of laboratory diagnostics of adenovirus infection in cattle]: dis. ... kand. biol. nauk / T. P. Lobova. - Moskva, 2006. -138s.
4. Gunenkov V. V. Maloizvestnyie virusnyie infektsii krupnogo rogatogo skota [Little-known viral infections of cattle] / V. V. Gunenkov, V. N. Syurin, Vertinskaya // - M.: Kolos, 1972. - 47 s.
5. Alieva N. A. Adenovirusnaya infektsiya telyat [Calf
adenovirus infection] / N. A. Alieva, M. K. Ganiev, R. S. Dreyzin, R. A. Alieva, G. A. Saryiev // Trudyi AzNIVI. - 1967. - T. XXI.
6. Syurin N. V. Adenovirusnaya infektsiya krupnogo rogatogo skota [Adenovirus infection of cattle] / V. N. Syurin, A. Ya. Samuylenko // Virusnyie bolezni zhivotnyih. - M.: VNITIBP, 1998. - S. 795-801.
7-10. Vide supra.
DOI: 10.25690/VETPAT.2021.63.45.004
Lobova N. P., Mihaylova V. V., Shishkina M. S., Skvortsova A. N, Varentsova A. A. THE USE OF THE CONTINUOUS CALF KIDNEY CELLS CULTURE TAURUS-1 (T-1) FOR THE CULTIVATION OF BOVINE ADENOVIRUSES
Key Words: continuous cell cultures: PT-80, MDBC, TR, Taurus-1 (T-1), primary cell culture: TB, LEK, PEK, adenoviruses of 1-10 serotypes, isolates of adenoviruses of KLB and Rus 18/81.
Abstract: The article presents the results of a study of the cultural properties of bovine adenoviruses: Bovine-10 (serotype 1), Bovine-19 (serotype 2), WBR-1 (serotype 3), THT-62 (serotype 4), B/4 65 (serotype-5), 671/130 (serotype 6), Fucuroi (serotype 7), Misk (serotype 8), Sofia 4/67 (serotype 9), Standel (serotype 10), CLB isolates and Rus 18/81 identified as the first and seventh serotype. Adenoviruses with 1-10 serotypes were cultured in continuous cell cultures of PT-80 (calf kidney), MDBC (cow kidney), TR (cow trachea), Taurus-1(T-1) (calf kidney - fibroblast-like clone) cells for 15 passages, as well as in primary culture of TB cells (bull testicles). The culture medium MEM with a double set of amino acids with the addition of 10 % of fetal bovine blood serum was used as a nutrient medium. The cell monolayer was grown in a CO2 incubator at a temperature of 37 °C. Virus titers were taken into account after the 15th passage, which ranged from 5.0 to 8.86 lg TCD50/ml. The titer of
infectious activity was determined according to the method of Reed and Mench, expressed in lg TCD50/ ml. 50
Сведения об авторах:
Лобова Татьяна Петровна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник отдела вирусологии ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»; д. 23, ул. Оранжерейная, г. Москва, Россия, 111622; тел.: +7 (495) 700-01-37; e-mail: [email protected] Михайлова Вера Владимировна, младший научный сотрудник, исполняющая обязанности заведующей отделом вирусологии ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»; д. 23, ул. Оранжерейная, г. Москва, Россия, 111622; тел.: +7 (495) 700-01-37; e-mail: [email protected]
Шишкина Мария Сергеевна, младший научный сотрудник ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»; д. 23, ул. Оранжерейная, г. Москва, Россия, 111622; тел.: +7 (495) 700-01-37; e-mail: [email protected]
Скворцова Анастасия Николаевна, младший научный сотрудник ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»; д. 23, ул. Оранжерейная, г. Москва, Россия, 111622; тел.: +7 (495) 700-01-37; e-mail: [email protected]
Варенцова Алиса Алексеевна, канд. биол. наук, начальник отдела координации научно-исследовательских работ ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»; д. 23, ул. Оранжерейная, г. Москва, Россия, 111622; тел.: +7 (495) 700-01-37; e-mail: [email protected]
Author affiliation:
Lobova Tat'yana Petrovna, Ph. D. in Biology, Senior Researcher of the Department of Virology of the Federal State Budgetary Institution (FSBI) «Central Scientific and Methodical Veterinary Laboratory»; house. 23, Oranzhereinaya str., Moscow city, Russia, 111622; phone: +7 (495) 700-01-37; e-mail: [email protected]
Mikhailova Vera Vladimirovna, Junior Researcher, Acting Head of the Department of Virology of the Federal State Budgetary Institution (FSBI) «Central Scientific and Methodical Veterinary Laboratory»; house 23, Oranzhereinaya str., Moscow city, Russia, 111622; phone: +7 (495) 700-01-37; e-mail: [email protected]
Shishkina Maria Sergeevna, Junior Researcher of the Federal State Budgetary Institution (FSBI) «Central Scientific and Methodical Veterinary Laboratory»; house 23, Oranzhereinaya str., Moscow city, Russia, 111622; phone: +7 (495) 700-01-37; e-mail: [email protected]
Skvortsova Anastasia Nikolaevna, Junior Researcher of the Federal State Budgetary Institution (FSBI) «Central Scientific and Methodical Veterinary Laboratory»; house 23, Oranzhereinaya str., Moscow city, Russia, 111622; phone: +7 (495) 700-01-37; e-mail: science@ cnmvl.ru
Varentsova Alisa Alekseevna, Ph. D. in Biology, Head of the Department for Coordination of Research Works of the Federal State Budgetary Institution (FSBI) «Central Scientific and Methodical Veterinary Laboratory»; house 23, Oranzhereinaya str., Moscow city, Russia, 111622; phone: +7 (495) 700-01-37; e-mail: [email protected]
Б01: 10.25690ZVETPAT.2021.73.67.003
УДК: 619:616.98:578.821.42:579.843.95:578.824.9:636.92:615.371
Куникова Е. Д., Мороз Н. В., Кулаков В. Ю., Долгова М. А.
АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ МИКСОМАТОЗА, ПАСТЕРЕЛЛЁЗА И ВИРУСНОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ КРОЛИКОВ 1 И 2 ТИПОВ
Ключевые слова: ассоциированная вакцина против миксоматоза, пастереллёза и вирусной геморрагической болезни кроликов 1 и 2 типов, вирусная геморрагическая болезнь кроликов, миксоматоз кроликов, пастереллёз кроликов.
Резюме: Исследовали иммунобиологические свойства ассоциированной вакцины против мик-соматоза, пастереллёза и вирусной геморрагической болезни кроликов 1 и 2 типов, которая состоит из двух компонентов. Жидкий компонент - антигены инактивированного вируса геморрагической болезни (ЯОПУЛ и -II) и антиген инактивированных бактерий пастереллёза (Р тиНоайа серотипа А), в виде смеси на растворе геля гидроокиси алюминия. Сухой компонент -аттенуированный вирус миксоматоза кроликов (штамм «Миксо/ВНИИЗЖ-18»). Перед использованием компоненты в заданных пропорциях смешивали и внутримышечно прививали кроликам. Оценивали реактогенное, антигенное и протективное действие комбинированного препарата. Установили: - реактогенный эффект препарата в виде местной воспалительной реакции может сохранятся до 12-ти суток после инъекции; - накопление сывороточных антител до устойчивого протективного уровня ко всем антигенным составляющим происходит через 14 суток после иммунизации; - через 28 суток после прививки препарат способен создавать: а) предельный уровень защиты по положительному контролю к вирусу геморрагической болезни типов I и II; Ь) полностью протективный уровень иммунитета к пастереллёзу; с) индекс защищен-
