Использование отходов деревообрабатывающей промышленности для создания биопрепаратов на основе грибов рода Trichoderma Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПЕРЕРАБОТКИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

УДК 674.8: 502.1

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОТХОДОВ ДЕРЕВООБРАБАТЫВАЮЩЕЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ

ГРИБОВ РОДА TRICHODERMA

П.Н Бондарь, В.С. Садыкова

ФГБОУ ВО «Сибирский государственный технологический университет», 660049, г. Красноярск, пр. Мира, 82, e-mail: [email protected]

Для подбора дешевых и экологически чистых субстратов была проведена оценка способности биодеструкции отходов деревообрабатывающей промышленности тремя исследуемыми штаммами грибов рода Trichoderma (Trichoderma asperellum «Mg-6», Trichoderma koningii «ТСЛ-06» и Trichoderma harzianum «M99/5»), отобранными по ряду критериев для производства биопрепаратов защиты и стимуляции роста растений.

В качестве субстратов использовали: гидролизный лигнин, кору лиственницы после СО2-экстракции, кору пихты, твердый остаток коры пихты после различных экстракций (изопропанолом, гексаном, горячей и холодной водой).

О результатах эффективности воздействия ферментативного комплекса исследуемых штаммов рода Trichoderma на лигноуглеводные субстраты судили по изменению основных целлюлозных и лигниновых компонентов, а также накоплению гуминовых веществ. Был исследован химический состав субстратов до и после биодеструкции штаммами и показано, что исследуемые штаммы утилизируют субстраты и полученный продукт после твердофазной ферментации может быть использован при создании биопрепаратов на основе грибов рода Trichoderma.

Отмечено, что предварительная химическая обработка различными органическими растворителями либо не повышает степень доступности сырья для деструкции штаммов, либо, в ряде случаев, оказывает ингибирующий эффект на рост грибов. Таким образом, для наработки препарата можно использовать отходы без предварительной химической обработки.

Установлено, что в результате культивирования штаммов рода Trichoderma на лигноуглеводных субстратах деструкции подвергаются как полисахариды, так и вещества лигниновой природы. Процесс деструкции лигноуглеводного комплекса сопровождается образованием гуминовых веществ.

Для получения биопрепарата по совокупности показателей в качестве субстрата была предложена кора пихты и штаммы Trichoderma asperellum «Mg-6» и Trichoderma harzianum «M99/5» как продуценты.

Ключевые слова: субстрат, продуктивность, твердофазная ферментация, биодеструкция, полисахариды, лигни-новые вещества, гуминовые кислоты.

For selection of cheap and environmentally friendly substrates were evaluated the ability of biodegradation of waste wood processing industry in three studied strains of the genus Trichoderma (Trichoderma asperellum «Mg-6», Trichoderma koningii «ТСЛ-06» and Trichoderma harzianum «M99/5»). These strains were selected based on several criteria for biologicals production protection and stimulation of plant growth.

As substrates used: lignin, bark larch after CO2 - extraction, fir bark, bark fir solid residue after various extractions (isopro-panol, hexane, hot and cold water). It was studied the chemical composition of substrates before and after biodegradation strains. It was shown that the strain can utilize the substrates and solid-phase product obtained after fermentation may be used to create biological products based on fungi of the genus Trichoderma.

It is noted that the preliminary chemical treatment of various organic solvents or will not increase the degree of availability of raw materials to degradation strains, or has an inhibitory effect on the growth of fungi. Therefore, for the production of the biological products can be used waste without chemical pretreatment.

It is found that by culturing strains of the genus Trichoderma on substrates subjected to degradation as polysaccharides and lignin substance nature. The process of degradation of the complex ligno-carbohydrate accompanied by the formation of humic substances.

In the aggregate indicators for a biological product as a substrate it was recommended fir bark and strains of Trichoderma asperellum «Mg-6» and Trichoderma harzianum «M99/5» as producers.

Keywords: substratum, productivity, solid phase cultivation, biodegradation, polysaccharides, lignin substances, humic acids.

ВВЕДЕНИЕ

В соответствии с законом «Об охране окружаю-щеВ соответствии с законом «Об охране окружающей среды» и «Лесным кодексом» одной из основных задач, стоящих в настоящее время перед деревообрабатывающей промышленностью, является рациональная и комплексная переработка лесных ресурсов. Красноярский край располагает огромными лесными

запасами, однако, оценивая состояние лесопользования в крае, при традиционных способах заготовки и переработки древесного сырья, уровень его использования крайне низок и составляет от 25 до 30 % общего запаса биомассы дерева. Такие отходы как древесная кора и гидролизный лигнин в больших количествах скапливается на предприятиях деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности, их отходы составляют 30-40% массы перерабатыва-

емого сырья (Дитрих, 2010). Предприятия вывозят отходы на свалку или складируют на собственной территории. При химической переработке коры получают ценные химические и биологически активные соединения, такие как эфирные масла, воски, жирные кислоты, пектины, поэтому необходима ее химическая переработка с получением различных продуктов. Не переработанные остатки можно использовать в качестве субстратов для получения биопрепаратов защиты растений.

Во многих странах мира поводятся широкие исследования по разработке биологической защиты растений с использованием грибов рода Trichodermа. Однако, применение «европейских» штаммов в Средней Сибири, характеризуются большим числом как весьма обнадеживающих результатов, так и рядом негативных или противоречивых данных (Коломбет, 2007). Поэтому использование в качестве продуцентов штаммов Trichoderma, выделенных из разных биотопов регионов Сибири для ограничения развития местных видов возбудителей болезней растений и разработка на их основе экологически чистых технологий является важным направлением в биотехнологии. Успех биологического метода защиты растений зависит не только от подбора высокоэффективного штамма, но и возможности получения на его основе биопрепарата. Важным при его производстве является наличие доступного и дешевого сырья.

При твердофазном культивировании в качестве традиционных субстратов используют множество сельскохозяйственных продуктов, таких как рис, пшеница, просо, бобы, зерно, соя. В Средней Сибири перспективным является расширение сырьевой базы для производства биопрепаратов наиболее распространенных отходов деревообрабатывающей промышленности, которые при внесении одновременно улучшают структуру почв. Использование в качестве субстратов отходов техногенной сферы решает одновременно проблему их утилизации. Технология получения биопрепарата триходермина твердофазным способом культивирования на подходящем субстрате позволяет получить высокий титр спор (Садыкова, 2003).

Веским основание использованием твердофазной ферментации на лигноуглеводных субстратах является:

- вовлечение этих растительных остатков техногенной сферы Сибири в круговорот углерода и технологии растениеводства с целью защиты растений;

- полученный биопрепарат содержит питательные компоненты для биологического агента, способствующие его дальнейшему размножению и сохранению в природных экосистемах;

- внесение формы биопрепарата, содержащего растительные остатки, способствует активизации са-протрофной антагонистической микробиоты;

- положительное влияние растительных остатков коры и гидролизного лигнина как структурообразова-телей почв и источников прогумусовых веществ.

Целью работы было подбор субстратов и продуцентов для разработки твердофазной ферментации грибов рода Trichoderma.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ИССЛЕДОВАНИЙ

Для проведения исследований были отобраны трДля проведения исследований были отобраны три наиболее антагонистически активных штамма: Trichoderma а&регеИит «Mg-6», Trichoderma кэтщи «ТСЛ-06» и Trichoderma harzianum «М99/5».

Для твердофазного культивирования штаммов растительное сырье измельчали, увлажняли до 70%, помещали в чашки Петри и подвергали стерилизации. Исходное сырье измельчали на лабораторном измельчителе шнекового типа и методом квартования отбирали среднюю пробу, которую затем фракционировали на ситах. Для исследований использовали сырье размером 1.2-2.0 мм, так как очень маленькие частицы упаковываются тесно, образуя материал с высокой плотностью и узкими порами, что снижает скорость процесса биодеструкции.

В качестве сырья для культивирования штаммов использовали: кору хвойных пород (пихты, лиственницы), гидролизный лигнин, кору пихты после различных химических обработок.

Субстраты подвергали стерилизации при давлении 1 атмосфера (136 кПа) в течение 1 часа. Для культивирования изучаемых штаммов рода Тrichoderma субстраты инокулировали споровой суспензией грибов из расчета 1х106 спор/г субстрата. Изоляты грибов рода культивировали в чашках Петри (в количестве 20 г) в термостате при температуре от 25 до 27° С в течение 15 суток. Опыты проводили в 3-х повторностях.

Оценку продуктивности спорообразования грибов рода Trichoderma при культивировании на растительных субстратах проводили подсчетом титра методом разведений в камере Горяева.

Содержание легко- и трудногидролизуемых полисахаридов в сырье устанавливали с использованием метода Кизеля и Семигановского. Метод основан на реакциях гидролиза полисахаридов исследуемой пробы с последующим нахождением общего количества образовавшихся моносахаров по редуцирующей способности эбулиостатическим методом (Рязанова, 1996; Ушанова, 2004). Содержание лигнина определяли с 72%-ной серной кислотой в модификации Комарова. Определение гуминовых веществ проводили по методу И.В. Тюрина в модификации ЦИНАО (ГОСТ 26213-84). Метод основан на окислении гумуса коры раствором бихромата калия в серной кислоте с последующим фотоколориметрическим определением трехвалентного хрома, эквивалентного содержанию гумуса (Кидин, 2008). Метод определения содержания золы основан на сжигании сырья в фарфоровом тигле с последующим прокаливанием остатков в муфельной печи (Оболенская, 1991).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Результаты исследований по продуктивности спорообразования рода Trichoderma наглядно свидетельствуют о способности всех трех штаммов расти и развиваться на данных лигноуглеводных субстратах.

При росте на исследуемых растительных субстратах образуются конидиеносцы с конидиями, форма и размеры которых не отличаются от органов бесполого спороношения, формирующихся при росте на стандартных питательных средах. Однако титр данных штаммов различается. Так, наибольший выход КОЕ штамма Trichoderma а&регеИит «Mg-6» отмечен на коре пихты исходной, выход спор составил 3.5 109 и коре пихты после экстракции изопропанолом -3.22109 (таблица 1, рисунок 1).

Штамм Trichoderma harzianum «М99/5» имел высокий титр КОЕ, хотя и несколько ниже в сравнении с Trichoderma а&'регеИит «Mg-6», на тех же субстратах -коре пихты исходной и коре пихты после экстракции изопропанолом, выход спор составил 1.33 109 и 5.3Т08 соответственно (таблица 1, рисунок 2).

Изучение роста штамма Trichoderma koningii «ТСЛ-06» показало, что максимальный выход спор был на коре пихты исходной и составил 1.24 109 (таблица 1, рисунок 3).

Самые низкие показатели конидиегенеза были отмечены на коре лиственницы после СО2-экстракции и варьировали от 1.1Т07 до 3.30Т07 (таблица 1, рисунок 1 - 3 А).

Таблица 1 - Титр (КОЕ/г) штаммов Trichoderma на растительных субстратах на 20 сутки культивирования

Субстрат

Тпско- ТпсИо-

,, derma derma

азргггИит , . ,

«М 6 harzianum konmgu

«м^6» «М99/5» «ТСЛ-06»

Trichoderma

Гидролизный лигнин

Кора лиственницы после СО2-экстракции

- исходная

- после экстракции гексаном

- после экстракции горячей водой

- после экстракции изопропанолом

- после экстракции холодной водой

1,60-108 2,0-107 2,9-107

3,30107 1,1107 2,6-107

Кора пихты:

3,5109 1,33109 1,24109

4,0108 0,9108 0,5108

3,0108 7,8-107 6,5108

3,22109 5,3108 5,1-108

2,86109 3,0108 3,6108

А Б

Рисунок 1 - Рост и спороношение штамма Trichoderma аярегв11ит «Mg-6» на гидролизном лигнине (А), коре пихты исходной (Б)

А

Б

Рисунок 2 - Рост и спороношение штамма Trichoderma harzianum «М99/5» на гидролизном лигнине (А), коре пихты исходной (Б)

А

Б

Рисунок 3 - Рост и спороношение штамма Trichoderma копт^ «ТСЛ-06» на гидролизном лигнине (А), коре пихты исходной (Б)

Можно отметить, что предварительная химическая обработка различными органическими растворителями либо не повышает степень доступности сырья для деструкции штаммов, либо, в ряде случаев, оказывает ингибирующий эффект на рост грибов. Таким образом, для наработки препарата можно использовать отходы без предварительной химической обработки.

Несомненно, скрининг штаммов для получения биологических препаратов на растительных субстратах должен определяться не только их антагонистической активностью, но и способностью усваивать при твердофазном культивировании используемый субстрат. В дальнейшем была исследована степень биодеструкции грибами рода Trichoderma двух субстратах: гидролизном лигнине и коре пихты.

О результатах эффективности воздействия ферментативного комплекса исследуемых штаммов рода Trichoderma на лигноуглеводные субстраты судили по изменению основных целлюлозных и лигнино-вых компонентов, а также накоплению гуминовых веществ. Данные исследований химического состава субстратов до и после биодеструкции штаммами грибов рода Trichoderma при культивировании в течение 15 суток представлены в таблицах 2 - 4. Исследования показали, что все штаммы способны использовать отходы в качестве субстратов и наибольшей степени деструкции подвергались компоненты коры пихты (таблица 2).

Таблица 2 - Химический состав коры пихты исходной до и после биодеструкции %, а.с.с

После биодеструкции штаммами

Показатели

урт

д

дио

б

-г ^ 51 £ «

I * -

к

здо

■3 Й н

Легкогидролизуемые 16,70 13,22 12,70 14,27

полисахариды

Трудногидролизуемые 20,80 12,20 14,54 11,16

полисахариды

Сумма полисахаридов 37,50 25,42 27,24 25,43

Лигниновые вещества 43,50 47,30 46,40 48,20

Гуминовые вещества - 11,80 8,90 5,70

Белок 3,29 3,93 3,85 3,62

Зола 8,50 4,40 5,10 4,30

чве при биодеструкции лигнина растительного опада ксилотрофными грибами.

Наибольшее количество гуминовых веществ отмечено в результате культивирования штамма Trichoderma а&регеИит «Mg-6» на коре пихты и гидролизном лигнине и составило 11.8% и 11.32% соответственно (таблица 2, 3).

Таблица 3 - Химический состав гидролизного лигнина до и после биодеструкции %, а.с.с с учетом убыли массы

и После биодеструкции ци штаммами

Показатели

Из всех исследуемых субстратов максимальное снижение легкогидролизуемых и трудногидролизу-емых полисахаридов отмечено при росте штамма Trichoderma а&'регеИит «Mg-6» на коре пихты, при этом количество легкогидролизуемых полисахаридов по сравнению с исходным сырьем уменьшилось в 1.3 раза, трудногидролизуемых полисахаридов - в 1.7 раза. При росте штамма Trichoderma harzianum «М99/5» содержание легкогидролизуемых и трудно-гидролизуемых полисахаридов снижалось на 16% на гидролизном лигнине и на 27% на коре пихты. При росте штамма Trichoderma koningii «ТСЛ-06» содержание легкогидролизуемых и трудногидролизуемых полисахаридов на тех же субстратах снижалось на 19% и 32% соответственно (таблицы 2, 3).

Процесс деструкции лигноуглеводного комплекса сопровождается образованием гуминовых веществ. Лигноуглеводные субстраты привлекают внимание исследователей как возобновляемое сырье, являющееся основным прогумусовым веществом в почве. Они разлагаются и вовлекаются в биосферный круговорот углерода, формируя гуминовые соединения в почве. Гуминовые вещества относятся к числу важнейших компонентов почв и влияют практически на все почвенные свойства: поглотительную способность, содержание элементов питания, структурные характеристики и на плодородие почв и урожай сельскохозяйственных культур. Лигноудобрения особенно важны в этом аспекте, поскольку именно фенольные соединения, образующиеся в результате разложения лигнина, являются одним из главных источников бен-зоидных фрагментов молекул гуминовых веществ (Телышева, 1978; Головлева, 1982).

В этом аспекте представляло интерес изучить способность штаммов Trichoderma не только осуществлять деструкцию лигноуглеводных субстратов, но и продуцировать гуминовые кислоты. Наши исследования показали, что образование гуминовых кислот отмечено у всех штаммов на трех типах субстратов, однако их количество зависит от типа субстрата и самого продуцента. Это подтверждает данные Ю.П. Ваксмана (1968) (цит. По Химия древесины, 1996), отметившего образование гуминовых веществ в по-

у

урт

д

о био

I 8 _

¡а ¿3 ^

-г ^ 51

£ «

? 3 "Я 1

ЗДО

■3 Й н

Легкогидролизуемые 2,98 1,58 1,21 1,42

полисахариды

Трудногидролизуемые 9,52 9,08 9,22 8,76

полисахариды

Сумма полисахаридов 12,50 10,66 10,43 10,18

Лигниновые вещества 71,05 63,09 68,54 69,23

Гуминовые вещества - 11,32 10,90 1,80

Белок 2,79 3,31 3,53 3,26

Зола 7,40 4,40 5,10 5,62

После биодеструкции коры пихты штаммами рода Trichoderma происходит относительное увеличение лигниновых веществ. Можно предположить, что в процессе деструкции данного субстрата важную роль играет ослабление связи лигноуголеводного комплекса через деструкцию целлюлоз. Следовательно, после утилизации углеводов, относительная доля лигнина увеличивается. Такой механизм воздействия на растительные субстраты был описан Т.М. Тепкапеп (1997).

Результаты по воздействию штаммов Trichoderma на состав лигноцеллюлозного комплекса гидролизного лигнина свидетельствуют об их способности разрушать сложные химические связи в молекуле лигнина, однако в зависимости от штамма, утилизация различных составных компонентов гидролизного лигнина происходит по-разному.

Как видно из данных таблицы 3, максимальная утилизация лигниновой части по сравнению с другими штаммами отмечена у штамма Trichoderma реге11ит «Mg-6», что можно объяснить его более высокой фенолоксидазной активностью (Махова, 2003), при этом незначительно понижается содержание компонентов целлюлозы, что свидетельствует о разрушении связей между лигниновыми и целлюлозными компонентами субстрата. При культивировании штаммов Trichoderma harzianum «М99/5» и Тпскв-derma кэтщи «ТСЛ-06» процесс разрушения целлюлозы и олигосахаридов преобладал над разрушением лигнина.

Интересно отметить факт, что в результате роста штаммов грибов рода Trichoderma происходит накопление белка, количество которого наибольшее на коре пихты при культивировании всех исследуемых

штаммов и достигает 3.93% при культивировании штамма Trichoderma asperellum «Mg-6». Накопленный белок при внесении в почву может служить источником дополнительного питания для почвенной микрофлоры и растений.

ВЫВОДЫ

Таким образом, в результате проведения экспериментальных исследований можно сделать следующие выводы:

1. Показана возможность использования растительных отходов техногенной сферы - гидролизного лигнина и коры пихты и лиственницы для массового размножения грибов рода Trichoderma. Способность к деструкции данных субстратов грибами и отсутствие токсических свойств позволяют создавать путем твердофазной ферментации биопестициды для защиты растений.

2. Оценено влияние подготовки субстрата на степень деструкции его грибами. Установлено, что в результате культивирования штаммов рода Trichoderma на лигноуглеводных субстратах деструкции подвергаются как полисахариды, так и вещества лигнино-вой природы. Процесс деструкции лигноуглеводного комплекса сопровождается образованием гуминовых веществ.

3. По совокупности показателей для получения биопрепарата можно рекомендовать кору пихты в качестве субстрата и штаммы Trichoderma asperellum «Mg-6» и Trichoderma harzianum «М99/5» как продуценты. Предпосылками для использования коры пихты в качестве сырья для производства биопрепарата на штаммах Trichoderma asperellum «Mg-6» и Trichoderma harzianum «М99/5» являются ее высокий гумусообразующий потенциал и максимальная доступность для ферментативной системы продуцентов..

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

Дитрих В.И. Оценка объемов и возможные пути использования отходов лесозаготовок на примере Красноярского края / В.И. Дитрих, А.А. Андрияс, А.И. Пережилин, В.П. Корпачев // Хвойные бореальной зоны. -2010. - XXVII, № 3 - 4. - с. 346-351;

Коломбет, А.А. Научное обоснование и практическая реализация технологии создания грибных препаратов для защиты растений от болезней : дис. ...канд. биол. наук. - Москва, 2007. - 527 с.

Садыкова, В.С. Изменчивость вида Trichoderma asperellum и отбор штаммов для создания биопрепаратов на гидролизном лигнине : дис. ... канд. биол. наук. - Москва, 2003. - 198 с;

Рязанова, Т.В. Химия древесины: учебное пособие для студентов / Т.В. Рязанова, Н. А. Чупрова, Е. В. Исаева. - Красноярск: КГТА, 1996. - 358 с;

Ушанова, В.М. Основы научных исследований. Часть 2. Контроль качества и экстрагирование растительного сырья / В.М. Ушанова, О.И. Лебедева, А.Н. Девятлов-ская. - Красноярск: СибГТУ, 2004. - 168 с;

Кидин, В.В. Практикум по агрохимии / В.В. Кидин, И.П. Дерюгин, В.И. Кобзаренко и др.; Под ред. В.В. Кидина. - М.: КолосС, 2008. - 599 с;

Оболенская, А.В. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы [Текст] : учеб. пособие для вузов / А.В. Оболенская, З.П. Ельницкая, А.А. Леонович. -М.: Экология, 1991. - 320 с;

Телышева, Г.М. Удобрение на основе лигнина / Г.М. Те-лышева, Р.Е. Панкова // Рига: Зинатне, 1978. - Вып.64 -с.158;

Головлева, Л.А. Разложение лигнина грибными культурами / Л.А. Головлева, Х.Г. Ганбаров, Г.К. Скрябин // Микробиология. - 1982. - Т. 51, Вып. 4. с. 543-547;

Tenkanen Т.М., Siika-aho M. // Tricel 97. Program and Abstracts. Ghent. Belgium. - 1997. - p. 19;

Махова, Е.Г. Культивирование грибов рода Trichoderma на лигноуглеводных субстратах и получение биопрепарата: автореф. дис. канд. техн. наук. - Красноярск, 2003. - 21 с.

Поступила в редакцию 30.09.15 Принята к печати 28.12.2015