CC BY
31Использование моноклональных антител в диагностике и исследовании антигенных детерминант
Helicobacter pylori
Вечканов Е.М. ([email protected])
(1) Ростовский Государственный Университет, кафедра биохимии и
микробиологии
(2) Ростовский НИИ противочумной институт, лаборатория «Гибридом»
Долгое время господствовала версия о паразитическом образе жизни Н. pylori в желудке человека. Однако в настоящее время, господствующее положение постепенно приобретает версия о симбиотическом характере взаимоотношений человека и Н. pylori. Тем не менее, естественный симбионт Н. pylori, если подвергнуть его воздействию стрессорных факторов, начинает производство собственных факторов защиты, которые являются патогенными по отношению к человеку; таким образом, индуцируется повреждение эпителия слизистой оболочки желудка, ведущее к язвенной болезни, и стимулируется раковое перерождение железистого эпителия желудка. [4,5] Успешное лечение в таком случае напрямую зависит от полноты эрадикации хеликобактера из организма человека. Очевидна необходимость в точном, быстром и достаточно простом диагностикуме Н. pylori. Однако существующие на данный момент тест-системы либо недостаточно точны, либо некомфортны для пациента (инвазивные методы диагностики). В связи с этим представляется перспективным использование моноклональных антител (МКА), получаемых к поверхностным антигенам клеток Н. pylori, для создания точной и удобной тест-системы для обнаружения этого микроорганизма у пациента. Своевременное обнаружение Н. pylori позволяет указать на факторы риска развития язвенной болезни, если обследуемый здоров, или выработать правильную схему лечения, если патологии уже «дан ход».
Материалы и методы
В работе использовали микробные клетки Н. pylori кокковидной и вегетирующей форм, убитые нагреванием (100°С, 30 минут) и мертиолятом, а также культуральную жидкость гибридомы В10,- продуцента моноклональных антител полученной и любезно предоставленной лабораторией «гибридом» Ростовского НИПЧИ. Микробные клетки осторожно смывали с чашек Петри и суспендировали в буфере, состава: Tris-HCl 50 мМ, ЭДТА 1 мМ, рН = 6,5. Подготовленные таким образом образцы хранились в замороженном состоянии при минус 20 0С до использования. Перед проведением опыта образцы размораживали и смешивали в соотношении 1:1 с лизис-буфером состава: Tris-HCl 200 мМ, SDS 4%, бромфеноловый синий натриевая соль 0,01%, глицерин 40 %, ß-меркаптоэтанол 400 мМ. Подготовленные таким образом пробы прогревали на водяной бане при 100 0С, в течение 5 мин. В пробах определяли количества белка по Лоури.
Характеристику антигенных детерминант осуществляли методом иммуноблоттинга. Принцип метода - разделение белковых детерминант с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле по методу Laemmli [7], с последующим переносом разделённых белков на нитроцеллюлозную мембрану, по методу описанному Bjerrum. O. J., and C. Schafer-Nielsen [6] и иммуноферментным анализом дот-блот по Haid A., Suissa M.[8] Отдельно готовили пробы с вегетирующей и кокковидной формой Н. pylori. При приготовлении проб исходили из расчёта, чтобы на один карман геля приходилось порядка 100 мкг белка. Разделяющий гель готовился, исходя из конечной концентрации акриламида (акриламид + бис-акриламид) 12,5%, с 0,1% содержанием SDS.
Электрофорез проводился в течение 5 часов при напряжении 50 В. О ходе и скорости движения образцов судили по перемещению полосы красителя - бромфенолового синего. В качестве белков-метчиков использовались бычий сывороточный альбумин (Merck) (М=68 кДа) и химотрипсин (М=24 кДа) (Sigma).
По завершении электрофоретического разделения гель снимали со стёкол, складывали «сэндвич» для переноса и осуществляли перенос на нитроцеллюлозную мембрану согласно Bjerrum. O. J., and C. Schafer-Nielsen. [6] Подготавливали
нитроцеллюлозную мембрану (Membranfilter Scheicher & Schuell) (0,2 цш) на 6 мм шире и длиннее геля, предварительно смоченную в буфере для переноса. Полиакриламидный гель после проведения электрофореза подрезали, помещали в буфер для переноса состава: Tris 47,9 мМ, Глицин 38,6 мМ, SDS 0,0385%, Этанол 20% на 10 мин при 00С. Накладывали гель на мембрану, прокладывали фильтровальным ватманом и помещали в камеру для переноса. Перенос осуществлялся в течение 30 мин, при напряжении 60 В. После блоттинга треки маркёров молекулярной массы окрашивали Ponceau S до проявления полос [1], а ту часть, где происходил перенос белковых антигенов, инкубировали с образцами антител гибридомы В10 и специфической поликлональной мышиной сывороткой по методу Haid A., Suissa M. [8] Использовался готовый набор вторичных антимышиных иммуноглобулинов, коанъюгированных с пероксидазой хрена - Goat Anti-Mouse Immunoglobulins-Peroxidase Conjugate Calbiochem® Immunochemicals. Полученный иммунодот проявляли с использованием диаминобензидина [2].
Результаты исследования
Исследовали состав белков H. pylori. Используемые пробы были следующего состава: проба № 1 - белковые метчики (бычий сывороточный альбумин (М=68 кДа) и химотрипсин (М=24 кДа), проба № 2 - лизат бактериальной массы Helicobacter pylori кокковидный формы (концентрация по белку 10 мкг/мкл), проба № 3 - лизат бактериальной массы Helicobacter pylori вегетирующей формы (концентрация по белку 10 мкг/мкл).
В результате электрофоретического фракционирования в полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия по методу Laemmli, был получен «белковый профиль», предствленный на Рис. 1. Окрашивание белковых полос осуществляли с помощью красителя Кумасси R-250. [1]
Электрофоретический профиль белков H. pylori №1 №2 №3
БСА (М=68 кДа) Трипсин (М=24 кДа)
Рис 1.
Далее осуществляли перенос фракционированных белков с пластины полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану по методам Bjerrum and Schafer-Neilsen. После электроблоттинга, нитроцеллюлозную мембрану обрабатывали моноклональными антителами гибридомы В10, специфичной поликлональной сывороткой и нормальной сывороткой. Используемые пробы были следующего состава: проба № 1 - лизат бактериальной массы Helicobacter pylori кокковидной формы и МКА гибридомы В 10, проба № 2 - лизат бактериальной массы Helicobacter pylori вегетирующей формы и МКА гибридомы В 10, проба № 3 - лизат бактериальной массы Helicobacter pylori кокковидной формы и специфическая поликлональная сыворотка, проба № 4 - лизат бактериальной массы Helicobacter pylori вегетирующей формы и специфическая поликлональная сыворотка, проба № 4 - лизат бактериальной массы Helicobacter pylori вегетирующей формы и нормальная мышиная сыворотка (контроль), проба № 5 - белковые метчики (бычий сывороточный альбумин (М=68 кДа) и химотрипсин (М=24 кДа)).
После проявления иммуноблота, полученную картину документировали путём сканирования. Блоттограмма приведёна на Рис 2.
Блоттограмма антигенных фракций H. pylori №1 №2 №3 №4 №3 №5
Рис 2.
Согласно блоттограмме моноклональные антитела взаимодействуют с белковым антигеном, молекулярной массой 30 кДа в одинаковой степени, как у кокковидной, так и у вегетирующей формы H. pylori (Дорожка № 1 и № 2) Специфическая поликлональная сыворотка даёт более пёструю картину взаимодействия с белковыми антигенами (Дорожка № 3 и № 4).
Обсуждение результатов.
На сегодняшний день можно считать практически доказанной роль бактерии Helicobacter pylori в этногенезе язвенных и онкологических патологий желудочно-кишечного тракта. Несмотря на допускаемые симбиотические взаимоотношения человека и H. pylori, это микроорганизм всё же является одним из самых существенных факторов риска развития язвенной болезни желудка, язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, хронического гастрита, аденокарциномы желудка. В связи с этим изменилось представление о методах лечения и диагностики этих заболеваний. Теперь всё большее внимание уделяется неинвазивным методам их диагностики. Проводится усовершенствование методов с целью снижения времени проведения анализа, повышения его достоверности и снижения стоимости диагностики. Одним из путей решения данной проблемы является использование моноклональных антител для создания диагностического препарата по определению возбудителя.
Моноклональные антитела являются сегодня наиболее эффективным инструментом, с помощью которого возможно, с одной стороны, проведение тонких исследований антигенной композиции микробной клетки, выяснение функций отдельных антигенных детерминант, с другой - повышение чувствительности и
специфичности серологического анализа, создание на их основе новых, более точных и быстрых методов идентификации и дифференциации.
Выяснение биологических и иммунохимических свойств антител и распознаваемых ими антигенов является необходимым условием их последующего успешного применения в диагностических целях, и нашей задачей было изучение свойств МКА, секретируемых гибридомой В10, полученной в лаборатории «гибридом» РПЧИ.
По данным иммуноблоттинга, поверхностный белковый антиген с молекулярной массой 30 кДа связывается с моноклональными антителами гибридомы В10. Согласно литературным источникам, это может быть пориновый белок бактерии, одновременно выполняющий функцию адгезии микроорганизма на клетках эпителия слизистой оболочки желудка; это говорит о его присутствии во всех штаммах H. ру1оп.
Как видно из рис. 2, белковый антиген, обнаруживаемый моноклональными антителами гибридомы В10, присутствует в равной степени как у кокковидной, так и у вегетирующей форм. Кроме того, было выяснено, что моноклональные антитела взаимодействуют в равной степени с антигеном кокковидной формы и антигеном активной вегетирующей формы. Эти факты говорят в пользу антител, продуцируемых гибридомой В10, как кандидата на создание тест-системы по определению Helicobacter pylori.
Таким образом, исходя из вышеизложенного, представляется достаточно перспективной дальнейшее изучение иммунохимических свойств антител, продуцируемых гибридомой В10, с целью разработки на их основе точного и быстрого диагностикума Н. pylori-инфекции.
Литература
1. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот:
Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука,
1981. 288с.
2. Инструкция к применению Hybridoma Screening Kits. Calbiochem
Immunochemicals/ Cat №38644
3. Ломов С. Ю. Роль факторов патогенности в механизмах хеликобактерных поражений желудка.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.-1997, № 6.-с. 108-111.
4. Blaser M. Ecology of Helicobacter pylori in the human stomach— J. Clinical Investigation. —1997—Vol. 100.—P. 759-762
5. Blaser, M.. // Hypothesis: the changing relationships of Helicobacter pylori and humans: implications for health and disease. J Infect Dis, 1999. 179(6): p. 1523-30.
6. Bjerrum. O. J., and C. Schafer-Nielsen. 1986. Buffer systems and the transfer parameters for semi-dry electroblotting with a horizontal apparatus, p.315-327. In P. Dunn (ed.), Electrophoresis~86. VCH, Weinheim, Germany.
7. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London) 227:680-685
8. Haid A., Suissa M. In: Methods in Enzymology, Fleischer S and Fleischer B. (eds), Academic Pres, New York, Vol. 96. p. 192, 1983
